El método simple y barato que llamamos MDR le permite aislar poblaciones enriquecidas de espermatozoides paquiteno, espermatozoides redondos y espermatozoides alargadores de testículos de ratón. La principal ventaja del método MDR es su simplicidad. Solo necesita equipos de laboratorio estándar que estén disponibles en la mayoría de los laboratorios de investigación biomédica.
El protocolo MDR es ideal para los investigadores que realizan estudios funcionales sobre células germinales masculinas. Por ejemplo, grupos que están estudiando espermatogénesis, factores que afectan la fertilidad masculina, así como la herencia epigenética paterna. Se requiere un material de partida mínimo para el método MDR.
Y de hecho, rutinariamente obtenemos una buena cantidad de células usando un solo ratón macho adulto. Comience por configurar el equipo y los reactivos necesarios. Establezca un baño de agua a 37 grados centígrados y una incubadora de cultivo celular los 34 grados centígrados, el 5% de dióxido de carbono y el 95% de humedad.
Coloque un rotador de tubo dentro de la incubadora. Preparar y etiquetar la cantidad adecuada de diapositivas de vidrio de microscopía, luego dibujar un anillo de aproximadamente un centímetro de diámetro con una pluma de grasa, y dejar que la grasa se seque. Cuando esté listo para diseccionar al animal, rocíe el abdomen ventral del ratón con 70%etanol y use tijeras para hacer una abertura en forma de V en la cavidad pélvica abdominal.
Tire de la almohadilla epidídmica de grasa con fórceps, localice los testículos y retírelos con tijeras, asegurándose de evitar molestar la tunica albuginea. Coloque los testículos en una placa Petri de seis centímetros que contenga 1X KREBS. Decapsular los testículos y desechar la túnica albuginea, luego dispersa ligeramente los túbulos seminiferos al separarlos suavemente con fórceps.
Transfiéralos a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga dos mililitros de solución de colágeno recién preparada. Incubar los túbulos en el baño de agua de 37 grados Celsius durante tres minutos, agitando suavemente balanceándolos. A continuación, agregue al menos 40 mililitros de KREBS 1X caliente y deje que los túbulos se sedimentan a temperatura ambiente.
Retire el sobrenadante y repita el lavado una vez más. Añadir 25 mililitros de solución de trippsina recién preparada. Coloque el tubo en el rotador dentro de la incubadora de cultivo celular, y déjelo allí durante 15 a 20 minutos, girando a aproximadamente 15 rpm.
Revisa esporádicamente los túbulos. Una vez que la solución se nubla y sólo quedan pequeños trozos de los túbulos, coloque el tubo sobre hielo y proceda al siguiente paso. Filtre la solución a través de un colador celular de 40 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo.
Luego centrifugarlo a 600 x g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para peletizar las células. Vierta cuidadosamente el sobrenadante y toque el pellet celular para resuspender las células en el resto del KREBS 1X. Agregue al menos 40 mililitros de KREBS frío 1X a las células resuspendidas y repita la centrifugación.
Resuspender las células tocando el tubo. A continuación, monte una punta de pipeta en una pipeta de un mililitro y córtela para que la abertura tenga unos tres milímetros de diámetro. Agregue hasta tres mililitros de 0.5%BSA en KREBS.
Resuspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo, asegurándose de evitar las burbujas. Filtrar la suspensión celular a través de un colador de 40 micrómetros y proceder inmediatamente a cargar las células en el gradiente BSA. Debe obtener una suspensión homogénea de una sola célula antes de cargar las celdas en el gradiente.
Las células agujeadas se sedimentarán más rápido, interrumpiendo su gradiente y contaminando las fracciones. Configure un tubo de 50 mililitros verticalmente sobre hielo, asegurándose de que sea posible ver un lado del tubo. A continuación, corte entre cinco y diez milímetros de la punta de una pipeta serológica de diez mililitros y móntelo en un controlador de pipetas.
Pipetear cinco mililitros de la solución 5%BSA en la parte inferior del tubo de 50 mililitros. Toque suavemente la superficie de la solución del 5% con la punta de corte de la pipeta y capa lenta cinco mililitros de solución 4%BSA encima de la solución del 5%. Repita este procedimiento con otras soluciones de BSA para obtener un gradiente de 5% a 1%BSA.
Una línea clara debe ser visible entre las capas. A continuación, cargue cuidadosamente la suspensión de una sola celda en la parte superior del gradiente sin molestarla. Deje que las células se sedimenten a través del gradiente durante una hora y media.
Usando una punta de pipeta cortada, recoja cuidadosamente las fracciones de un mililitro en tubos separados de 1,5 mililitros y guárdelos en hielo, asegurándose de numerar los tubos en el orden en que fueron recogidos. Centrifugar las fracciones de células germinales a 600 x g durante diez minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, teniendo cuidado de no molestar el pellet, desechar la mayor parte del sobrenadante y resuspender las células moviendo el tubo.
Agregue un mililitro de frío 1X Tampón KREBS a cada tubo y repita la centrifugación. Deseche la mayor parte del sobrenadante, dejando alrededor de 100 microlitros y resuspender el pellet celular cuidadosamente. Para analizar las fracciones celulares, comience por pipetear 20 microlitros de 4%paraformaldehído dentro de cada anillo de pluma de grasa en una diapositiva de microscopía numerada.
Añadir inmediatamente dos microlitros de las células resuspendidas de la fracción correspondiente. A continuación, seque los portaobjetos a temperatura ambiente durante al menos una hora. Enjuague las diapositivas una vez con PBS y utilice un medio de montaje con DAPI para montar las diapositivas.
Analice cada diapositiva bajo un microscopio de fluorescencia para estimar qué tipo de células germinales en particular se enriquece en cada fracción. Una vez que se haya tomado una muestra de cada fracción para microscopía, agregue un mililitro de kreBS 1X de hielo frío a cada fracción y centrifugar las células a 600 a 13000 x g durante diez minutos a cuatro grados centígrados. Quite y deseche el sobrenadante y continúe con el análisis descendente preferido.
Este protocolo funciona particularmente bien para enriquecer los espermatozoides redondos. El enriquecimiento superior al 90% se logró en las fracciones dos, tres y cuatro. Los espermatozoides alargados tienden a permanecer en la parte superior del gradiente y se recolectaron con la primera fracción.
Debido a su gran tamaño, los espermatozoides paquiteos se sedimentan más rápido y fueron recogidos en último lugar. El enriquecimiento fue de alrededor del 75% en las fracciones 14 y 15. El ARN total obtenido de la mayoría de las fracciones osciló entre 0,5 y 2,5 microgramos, suficiente para análisis de ARN aguas abajo.
La cantidad de proteína obtenida de cada fracción típicamente osciló entre 20 y 140 microgramos, lo que es suficiente para varias manchas occidentales. En este protocolo, el 10% de los anates proteicos derivados de fracciones individuales era suficiente para detectar claramente las proteínas DDX4, PIWIL1 y PIWIL2 en una mancha occidental estándar. La cantidad de proteína en una fracción también fue suficiente para la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo contra PIWIL1, así como para la detección de PIWIL2 inmunoprecipitado.
Incluso para un primer temporizador, este protocolo funciona muy bien siempre y cuando se asegure de que el pre-tratamiento de sus células es bueno, y nada perturba su gradiente durante la sedimentación. A partir de un solo ratón, se obtienen células altamente enriquecidas, que se pueden utilizar para diferentes análisis aguas abajo como RT-PCR, secuenciación de ARN, inmunoprecipitación e hinchazón occidental. Si bien MDR no es el único método para enriquecer las células germinales masculinas, es una herramienta muy conveniente porque no requiere ningún equipo especializado o un entrenamiento extenso.
