Este nuevo método eficiente para aislar las subpoblaciones de esperatocitos y espermatozoides de ratones adultos se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Este método utiliza un tinte de unión al ADN de baja citotoxicidad con un amplio espectro de excitación que se puede aplicar a las órdenes FACS más utilizadas actualmente. Este método es muy sencillo.
El aspecto más difícil es la citometría de flujo, pero la estrategia detallada de gating debe ayudar a adaptar el protocolo a otros clasificadores de células. Demostrando el procedimiento estará Yu-Han Yeh, un asistente de investigación del Laboratorio de Satoshi Namekawa. Después de cosechar ambos testículos de un ratón macho de ocho semanas de edad, coloque los tejidos en un plato de Petri de 60 milímetros que contenga dos mililitros de PBS helado y retire la túnica albuginea.
Separe suavemente los testículos con fórceps para dispersar ligeramente los túbulos seminiferos. Y transfiera los túbulos a una gota de PBS helado fresco en un plato de Petri de 100 milímetros. Utilice los fórceps para desenredar suavemente los túbulos y lavar los túbulos en tres gotas adicionales de PBS como se acaba de demostrar.
Después del último lavado, coloque los túbulos seminíferos desenredados en un tubo de 15 mililitros, que contiene dos mililitros de tampón de disociación para una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, utilice una pipeta de 1000 microlitros para pipetear suavemente los túbulos 20 veces, antes de devolver el tubo a la incubadora durante otros seis minutos. Al final de la incubación, pipetear los tejidos 20 veces más, antes de devolver el tubo a la incubadora.
Después de tres minutos, pipetee suavemente los túbulos 10 veces o hasta que no queden trozos de tejido visible, antes de detener la disociación con 10 mililitros de tampón FACS. Luego, centrífuga a la suspensión de tejido dos veces usando 10 mililitros adicionales para el tampón FACS fresco para el segundo lavado para eliminar el espermatozoide y tantos desechos como sea posible. Para manchar las células para el análisis citométrico de flujo, vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de tampón FACS.
Y filtre la suspensión celular a través de un colador de células de nylon de 70 micras.en un tubo de 50 mililitros. Después de contar, transfiera el 10% de las células a un nuevo tubo sobre hielo como control negativo no manchado. Y mezcle completamente seis microlitros de la mancha DCV en la suspensión celular restante.
Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius en la oscuridad con suave temblor cada 10 minutos, agregue cinco microlitros de DNase I a las células. Y filtre las células a través de un colador de malla de nylon de 35 micras en un tubo FACS de cinco mililitros sobre hielo. Para el análisis citométrico de flujo de las celdas, cree un nuevo experimento en el software de análisis de flujo y, en el menú de herramientas de la hoja de cálculo, haga clic en nueva densidad para crear un área de dispersión hacia delante frente frente a un trazado de densidad de área de retrofluya en una escala lineal.
Haga clic en nuevo histograma para crear un trazado de histograma azul DCV en una escala logarítmica. Y haga clic en Iniciar y grabar para comenzar a procesar la muestra no detenida. Mientras se ejecuta la muestra, haga clic en la configuración del detector y del umbral para ajustar los voltajes PMT de dispersión hacia delante y hacia atrás para colocar las celdas no manchadas en la escala del gráfico de dispersión hacia delante y hacia atrás.
Ajuste el voltaje PMT para el canal jappy para localizar la posición de la población negativa DCV en la primera década de la gráfica logarítmica del histograma azul DCV. A continuación, haga clic en Detener para descargar el ejemplo no detenido. Después de vórtices brevemente y cargar la muestra manchada, haga clic en el siguiente tubo para crear una nueva hoja de trabajo para la muestra.
Establezca el citometro para adquirir al menos una vez 10 en los seis eventos y haga clic en Iniciar y registrar. A continuación, haga clic en Nueva densidad para crear la altura de dispersión hacia delante frente frente a la anchura de dispersión hacia delante. Y la densidad de color azul DCV frente a la densidad roja DCV en una escala lineal.
En el área de dispersión hacia delante frente frente a la gráfica de densidad de área de retropareador, utilice la herramienta polígono para dibujar una puerta llamada celdas para incluir la mayoría de las celdas y excluir pequeños desechos. Aplique esta puerta a la gráfica de altura de dispersión hacia delante frente frente a ancho de dispersión hacia adelante y utilice la herramienta rectángulo para dibujar la puerta de una sola celda para excluir celdas no individuales. Aplique la puerta de la celda única a la gráfica de densidad roja DCV en comparación con la gráfica de densidad roja DCV y ajuste la escala para capturar un perfil extendido.
Utilice la herramienta poligonal para dibujar una puerta DCV para excluir las celdas no manchadas y la población lateral, y aplique la puerta a un trazado de histograma azul DCV en una escala lineal. Los tres picos principales se refieren a los diferentes contenidos de ADN 1C, 2C y 4C. Cree una segunda gráfica de densidad azul DCV frente a la de color rojo DCV en una escala lineal.
Y puerta trasera de la puerta DCV en la parcela para localizar las poblaciones 1C y 4C. Cree otro trazado de densidad azul DCV frente a rojo DCV en una escala lineal. Y utilice la herramienta de elipse para dibujar una puerta en la población 1C.
Utilice la herramienta poligonal para cercar la población 4C con una curva continua. Y cree otra gráfica de densidad roja DCV azul frente a DCV en una escala lineal. Utilice la herramienta polígono para crear una puerta 4C.
En una nueva gráfica de dispersión hacia delante al lado del otro, utilice la herramienta de elipse para crear puertas de paquiteno, diploteno y leptoteno, espermatocitos de cigeno. Cuando se hayan dibujado todas las puertas, cree una nueva gráfica de puntos de color azul DCV frente a DCV en una escala lineal para aplicar la puerta for 4C para asegurarse de que las tres poblaciones están en un orden continuo dentro de la puerta. A continuación, cree un nuevo área de dispersión hacia delante frente frente a una gráfica de densidad de área de retropareador en una escala lineal y seleccione el tamaño unificado de las células como una población de espermatozoides redondas pura.
Después de la clasificación, las purezas representativas de las fracciones separadas de leptoteno, cigono, paquiteno y capermatocito de diploteno suelen estar entre el 80% y el 90%, según lo confirmado por la inmunostaining SYCP3 y Gamma H2AX. La pureza de la facción espermática redonda se puede confirmar mediante la tinción del núcleo con DCV en combinación con la tinción Sp56 y H1t, y también es típicamente alrededor del 90%La viabilidad de las poblaciones celulares aisladas es generalmente superior al 95%Y los rendimientos totales promedio de cada fracción de un solo ratón adulto es típicamente suficiente para varios análisis posteriores. Las células ordenadas se pueden utilizar para varios análisis de secuenciación de próxima generación para explorar mejor la expresión génica y la regulación durante la espermatogénesis.
