Los autores desean agradecer a los Drs. Silvia B Campos-Bilderback y George J Rodas para completar los procedimientos quirúrgicos que implican la colocación de líneas de acceso venosas. También desean agradecer a Sara E Destete de mantener las colonias Munich-Wistar que consisten tanto Simonsen y cepas Frömter.

1. Conjugación de albúmina de suero de rata Sulfo-rodamina 101 cloruro de sulfonilo (Rojo Texas) <ol><li> Disolver 100 mg de albúmina de suero de rata (RSA) en 6.667 ml de 100 mM de bicarbonato de sodio pH 9,0; concentración final 15 mg / ml en un tubo de 50 ml cónico. </li><li> Solución Colocar en hielo / agua vaso de precipitados y se enfría a entre 0 y 4 ° C. </li><li> Añadir 200 l de formamida dimetil alta calidad anhidra (DMF) a un vial de 10 mg de cloruro de sulfonilo Texas Red (TRSC); vórtice en el medio durante 15 segundos. </li><li> Solución RSA Vortex en medio y añadir el TRSC disuelto. </li><li> Resumen 50 ml cónica en papel de aluminio (Parafilm se puede utilizar para asegurar un sello hermético se forma), lugar horizontalmente w / hielo y el lugar sólo en eje de balancín para agitar la solución lentamente (evitar la formación de burbujas) en el cubo de hielo, permitir la reacción continúe a 0 a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Hacer 5 L de solución salina al 0,9%, y mojar un peso molecular de 50 kDa cortar cámara que puede ser o bien una membrana) de diálisis con clips, b) ditubería de estudio de carácter como en un flotador-un-Lyzer, o c) casete de diapositiva-a-Lyzer (especialmente adecuada para la eliminación de TRSC no conjugada). </li><li> Lugar mezcla de reacción en la cámara de diálisis y el lugar en el recipiente de 5 L w / la solución salina al 0,9%, dializa durante la noche a 4 ° C con una agitación suave usando una barra de agitación. </li><li> Cambiar la solución de diálisis 5 L en la mañana y en la tarde hasta una incubación durante la noche resultados en prácticamente ningún cambio de color (Esto suele tardar ~ 48 horas con al menos 4 intercambios). Además, con la MWCO de 50 kDa estar tan cerca de la MW de RSA, 66 kDa, es posible nunca producir una solución transparente, lo que será dependiente de la distribución en el tamaño de los poros de la membrana; 60 hr y 5 es intercambios tiempo más que suficiente. </li><li> Medir el volumen y dividir el peso inicial de 100 mg por el volumen para obtener una concentración aproximada de TR-RSA; típicamente gama concentraciones del 10-13 mg / ml. El colorante final: cociente albúmina debe ser ~ 04:01, 1 fluoróforo por 15,000 Daltons MW de proteína. Almacenar a 4 ° C; Nunca congele la solución TR-RSA, como resultado la fragmentación que puede ocurrir va a alterar los valores de permeabilidad. </li></ol> 2. Preparación de la platina del microscopio invertido para Ajustes de imagen / Microscopio <ol><li> Lugar ~ 4-7 piezas de cinta de autoclave (aproximadamente ¾ &quot;de largo) perfectamente apilados uno sobre el otro en el interior de un plato de 50 mm con un cubreobjetos de 40 mm de la parte inferior (cubreobjetos plato inferior). Estos se deben colocar más cerca de uno de los bordes de modo que el borde de la cinta hará contacto con el borde de curvatura del riñón pero no bloquear la trayectoria de luz objetivo (Figuras 1A y 1B); ratas más grandes requerirán más espacio entre la cinta y el borde del plato. </li><li> Coloque 2 toallas Repti-Therm próximos al escenario junto con el plato de 50 mm (Figura 1). Coloque una manta camisa de agua de calentamiento sobre el escenario. </li><li> Maximizar la eficiencia en la recogida de imágenes, asegurando la torreta objetivo tiene un 10x de aire or 20x (aire o agua de inmersión) objetivo y un objetivo de inmersión en agua de mayor potencia para recopilar imágenes para la cuantificación. </li><li> Durante la proyección de imagen de la forma más eficaz de añadir agua a los objetivos consiste en hacer girar a un lado y agregar el agua con una jeringa de 1 cc con un pedazo largo de tubería de PE-200 que se puede llegar a la cima de los objetivos. </li><li> Ajuste la intensidad de excitación del láser de 10 vatios ~ 15-20% utilizando los filtros de densidad neutra en el software. El galio-arseniuro fosfuro fotodetectores no descanned se establecen en 750 para recoger el verde, emisiones y 625 para recoger las emisiones rojas. Azul de emisión (por ejemplo, el tinte nuclear Hoechst 33342) se recogió mediante un detector de multialkaline nondescanned estándar con un valor entre 750-800. </li><li> Para asegurar la recolección adecuada de las emisiones de baja intensidad dentro del espacio de Bowman, asegurarse de que los límites inferiores de los detectores se establecen a fin de no excluir estos valores. Marcadores de alarma visuales indicarán si la sensibilidadajuste es demasiado bajo y estos valores se les está dando un valor de intensidad de cero. </li><li> Cargue una jeringa de 1 cc con ~ 5-8 mg de la solución de albúmina fluorescente diluido con 0,9% de solución salina estéril para criar a un volumen total de 1 cc. </li></ol> 3. La exposición del riñón en una rata Wistar Munich por intravital 2-Photon imágenes <ol><li> Comience con una rata de pre-anestesiados utilizando Pentabarbitol (50 mg / ml de solución, μl/100 120 g de peso corporal), inactina (130 mg / ml de solución, μ/100 120 g de peso corporal), o isofluorano (5% de inducción, 1.5 al mantenimiento 2,5%), una línea morada venosa acceso (ya sea venosa yugular o femoral), y el flanco izquierdo afeitado desde justo debajo de la caja torácica hasta justo por encima del muslo izquierdo. </li><li> Coloque la rata plana en su lado derecho para que el lado izquierdo afeitado quede hacia arriba, asegúrese de que está sobre la mesa, con su postura alargada y no se agachó, con las patas delanteras tocando entre sí y con las patas traseras toquen entre sí (Figura 2A). </li&gt; <li> Muy palpar suavemente para sentir el riñón para determinar donde naturalmente se establecen en el retroperitoneo y trace una línea recta paralela al cuerpo (de la caja torácica hasta el muslo) con un Sharpie (Figura 2A). </li><li> Recoge la piel con un par de pinzas dentadas y pellizcar la piel a lo largo de la línea trazada con un par de pinzas hemostáticas para aplastar el tejido y evitar el sangrado. Corte a lo largo de la incisión usando un par de tijeras quirúrgicas. Aplastar la piel exterior y las capas de músculo antes de la de corte se reducirá dramáticamente y típicamente eliminar el sangrado. </li><li> Repita este procedimiento para la capa muscular externa, que es delgada. </li><li> Para la incisión en la capa muscular interna, que se exponga el peritoneo, re-palpar el riñón para estimar el tamaño. Apriete una línea de incisión más pequeña que el riñón; asegurando la incisión es sólo sobre el riñón. Lo mejor es hacer la incisión muy pequeña y hacerlo más grande si es necesario. Si esto se hace demasiado grande, se requiere sutura.Esta última incisión es crítica; demasiado en uno u otro sentido afectará la estabilidad en el escenario e inducir ya sea artefactos de movimiento de la respiración (el mejor de los casos) o va a estirar la perfusión renal pedículo renal y reducir negativamente (en el peor de los casos). </li><li> Localice el riñón (como se muestra en la Figura 2B) y agarre la grasa que rodea el uso de fórceps, trabajando hacia el polo inferior del riñón en una mano sobre mano de la moda. </li><li> Una vez que se alcanza el polo inferior del riñón, tire suavemente del riñón a través de la incisión al momento de apretar suavemente por debajo del riñón para exteriorizar. Si la incisión es demasiado pequeño, aplastar la capa muscular y cortar para ensancharlo; repetir el procedimiento para exteriorizar riñón. </li></ol> 4. Colocación de la rata Wistar Munich en el escenario de la Imagen <ol><li> Coloque el riñón hacia el borde del plato cubreobjetos con el riñón ligeramente girada hacia el (lado posterior) dorsal de la rata por lo que el lado ventral del riñón is de hacer contacto con el plato inferior cubreobjetos (Figura 1A). Añadir un 09. Solución calentada,% de solución salina estéril al plato. </li><li> Mire a través del objetivo de 10x o 20x y comprobar el movimiento. Si se detecta movimiento, gire la rata sobre un poco para el tórax es más lejos del plato inferior cubreobjetos, asegúrese de que el riñón está tan cerca del borde del plato sin estirar el pedículo renal (fig. 1B). </li></ol> 5. Adquisición de imágenes para cuantificar la permeabilidad renal de albúmina <ol><li> Cálculo de la permeabilidad glomerular (Glomeruluar coeficiente de tamizado; SGC) de cualquier macromolécula será necesario tomar imágenes de fondo de referencia glomérulos individuales antes de la infusión de la molécula fluorescente. Si su microscopio está equipado con una platina motorizada capaz de posiciones de marcación, encontrar y centro de glomérulos individuales con el objetivo de menor potencia y marque cada ubicación. Un pase doble fluoresceína / rodamina epifluorescencia filter es ideal para este procedimiento, aunque cualquier filtro de emisión funcionará (contraste de fase o de otras fuentes no fluorescentes de iluminación no funciona). Los glomérulos aparecerá como estructuras circulares vacíos rodeados por túbulos proximales tienen un autoflourescence amarillo-naranja inherente cuando se ve a través del filtro de doble paso. </li><li> Si su microscopio no tiene una etapa motorizada, escanear el riñón en un patrón de trama con el objetivo de baja potencia y hacer un mapa rudimentario de donde están situados los glomérulos individuales, basándose en puntos de referencia naturales tales como grandes vasos sanguíneos superficiales situadas por encima de la cápsula renal o manchas de grasa. </li><li> Cambie la torreta con el objetivo de inmersión en agua mayor potencia y tomar conjuntos de datos 3D de cada glomérulos asegurándose de que las asas capilares y el espacio de Bowman son claramente visibles. Utilizando una paleta de pseudocolor (algo que no sea B / W) ayudará a visualizar estas estructuras. </li><li> Centrarse en un vaso sanguíneo superficial lentamente infundir en tél fluorescente albúmina toma tiempo que se da para permitir la distribución sistémica. Para las moléculas con baja SGC es esencial para maximizar los valores de intensidad en el plasma pero no para llegar a niveles que saturar los fotodetectores en el microscopio. Esto aumenta la detectabilidad de las moléculas de filtrados. Nota: por lo general hay un lapso de 5-7 segundos entre el momento de la albúmina fluorescente se introduce a la vez que aparece en la pantalla (la adquisición de imágenes completas en ~ 1 fotograma / segundo). </li><li> Deje aproximadamente 10 minutos para que los pequeños fragmentos posibles peso molecular se desvanezcan antes de la adquisición de volúmenes 3D a intervalos de 1 micras que se utilizarán en el cálculo de GSC albúmina. Por lo general, la tensión de Munich ratas Wistar del Simonsen tiene muchos menos glomérulos superficiales, por lo que todo lo que se puede visualizar son imágenes y cuantificados. La cepa Frömter tiene un número mucho mayor de lo que se limita el número cuantificado de ~ 10. </li><li> Al final del estudio, la rata se sacrificó a través de una sobredosis de la anestésicosCI utilizado en el estudio. Un doble pneumothoracotamy se lleva a cabo para asegurar la eutanasia. </li></ol> 6. Cálculo de GSC para fluorescente albúmina de volúmenes 3D <ol><li> El uso de software de procesamiento de imágenes Metamorph cargar los conjuntos de datos 3D para cada glomérulos, tanto en el conjunto de antecedentes y establecer tomada después de la infusión de albúmina fluorescente. </li><li> En el volumen que contiene la albúmina fluorescente localizar un bucle capilar superficial con espacio suficiente espacio vacío entre sus márgenes definidos y el borde de la cápsula de Bowman. </li><li> En el volumen de fondo localizar el mismo plano focal que debe contener todas las señales visuales de la imagen que contiene albúmina. Seleccione una región dentro del loop capilar de interés y anote la lectura de intensidad media. A continuación, seleccione una región en el espacio de Bowman y anote la lectura de intensidad media. Estos serán utilizados como los valores de fondo. </li><li> Para la cuantificación, seleccione la región similar en el espacio de Bowman en el c albúminaontaining imagen. Haga esto por lo menos otras dos regiones a un valor medio de la intensidad media en el espacio de Bowman. </li><li> Seleccione el loop capilar con la intensidad plasma brillante y dibujar una región que lo rodea. Siguiente con la función de umbral, resalte los valores brillantes dentro del plasma circulante, evitando las rayas oscuras que circulan glóbulos rojos. Tenga en cuenta los valores medios de intensidad del plasma del espacio seleccionado. Es importante seleccionar preferentemente las zonas brillantes del plasma debido a factores dentro de la sangre sólo servirá para provocar y la subestimación de los niveles de fluorescencia de plasma. </li><li> Usando una hoja de cálculo de Microsoft Excel introducir los valores para calcular el GSC donde: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos que destacamos a continuación representan lo que sentimos al ser los que van a producir los valores de permeabilidad consistentes y precisos, ya que eludir las trampas siguientes: <ol><li> Dispersión: El uso de un rojo fluoróforos que emiten permite una mayor eficiencia recaudatoria de la luz ya que los fotones de longitud de onda más largas son menos propensos a la dispersión. Utilizando cualquiera de fluoróforos que emiten verde o azul introducirá una mayor variación en el GSC de debido a la mayo...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Enfermedades renales que implican la pérdida urinaria de grandes macromoléculas esenciales, tales como albúmina de suero, durante mucho tiempo han sido pensado para ser causada por alteraciones en la barrera de permeabilidad compuesta de podocitos, células endoteliales vasculares, y una membrana basal de trabajo al unísono. Los datos de nuestro laboratorio utilizando microscopía intravital 2 fotones revelaron una barrera más permeable filtración glomerular (GFB) que se creía en condiciones fisiológicas, con la recuperación de la albúmina filtrada que ocurre en un subconjunto inicial de células llamadas células de los túbulos proximales (PTC) 1,2, 3. Las técnicas anteriores han usado para estudiar la filtración renal y el establecimiento de la característica de la barrera de filtración involucrados micropunción del lumen de estos primeros segmentos tubulares con el muestreo de los contenidos y el análisis de fluido 4. Estos estudios determinaron la concentración de albúmina en el fluido luminal de ser prácticamente inexistente; corresponde estrechamentea lo que se detecta normalmente en la orina. Sin embargo, la caracterización de los polímeros de dextrano con tamaños definidos por esta técnica reveló los de un tamaño similar a la albúmina sérica tenían niveles más altos en el lumen tubular y la orina, sugiriendo aumento de la permeabilidad 5. En esto es un esquema detallado de la técnica utilizada para visualizar y cuantificar directamente glomerular fluorescente permeabilidad a la albúmina in vivo. Este método permite la detección de la albúmina filtrada a través de la barrera de filtración en el espacio de Bowman (la cámara inicial de la filtración urinaria), y también permite la cuantificación de la albúmina por la reabsorción de los túbulos proximales y la visualización posterior de transcitosis albúmina 6. La ausencia de albúmina fluorescente a lo largo de los segmentos tubulares posteriores en la ruta a la vejiga pone de relieve la eficacia de la vía de recuperación en los segmentos proximales antes del túbulo. Por otra parte, cuando se aplica esta técnica para determinar la permeabilidadSe informó de dextranos que tienen un tamaño similar a los valores de permeabilidad virtualmente idénticos albúmina 2. Estas observaciones apoyan directamente la necesidad de ampliar el foco de muchas enfermedades renales proteinúricas a modificaciones incluidas en la recuperación de células del túbulo proximal.

La Figura 3 muestra un ejemplo de una imagen tomada de una superficie de un glomérulo Múnich Frömter rata Wistar y las medidas adoptadas para determinar la permeabilidad de la albúmina fluorescente. El valor GSC para la albúmina de 0.0111 deriva de este otoño glomérulo individual dentro del rango observado en esta cepa de ratas Wistar Munich cuando en el estado alimentado 3. La estabilidad se ve en estas imágenes es debido a la planificación y ejecución de las instrucciones represen...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K vistas.  Indiana University School of Medicine. Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Investigación

Medicina

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Un método para cuantificar Rendimiento de las extremidades superiores en la Vida Diaria El uso de acelerómetros

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

En Vivo Análisis morfométrico de los nervios craneales de humanos usando resonancia magnética en la enfermedad orejas y oídos de la audiencia Normal de Menière

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdérmica de medición de la tasa de filtración Glomerular en los ratones

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Análisis de registros de electrocardiografía a largo plazo para detectar arritmias en ratones

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...