Los autores desean agradecer a Elisabeth Blanchard por su asistencia técnica. Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

1. Cultivo de células Calu-3 para el uso en las culturas Transwell Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. <ol><li> Para descongelar las células de almacenamiento de congelados: <ol><li> Preparar medio esencial mínimo de Eagle que contiene 20% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 0,1 mM no aminoácidos esenciales, 2 mM L-glutamina, y 10 mM de HEPES, pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtro estéril el medio preparado usando un 0,2 micras de tamaño de poro del filtro, y caliente en un baño de agua a 37 ° C. Para ser más reflexiva del entorno in situ en el epitelio de las vías respiratorias, medio no está suplementado con antibióticos o antimicóticos. </li><li> Descongelar un criovial congelado de Calu-3 células rápidamente (&lt;1 min) en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 ml estéril y añadir 30 ml de EMEM-20 calentado% + S. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sin refrigeración, y con la velocidad de frenado bajo. </li><li> Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de EMEM caliente-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. Semilla 2 a 5 x 10 6 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C, 7% de CO 2 en la atmósfera de aire hasta que las células son 75% - 80% confluente. Revise diariamente, hasta 7 días que sean necesarios. Cada 3-4 días aspirar el medio de las células y reemplazar con agua fresca EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Para las células subcultura: <ol><li> Tripsina 0,05% tibia - 0,02% de EDTA en un baño de agua a 37 ° C. Aspirar el medio de las células, y lavar las células una vez con tripsina calentada 0,05% - 0,02% de EDTA para eliminar el exceso de medio y suero. Eliminar el lavado y añadir 1 ml de tripsina calentado por pocillo a las células. </li><li> Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 y el monitor bajo un microscopio cada 5 minutos hasta al menos 75% de células se separen del pozo (s) de la placa de cultivo de tejidos. Esto puedetomar entre 5 y 30 min. </li><li> Lavar las células en EMEM-20% + S para eliminar el exceso de tripsina. Transferir las células tratadas con tripsina a un tubo cónico de 50 ml estéril. Varios pocillos de las células de una placa de cultivo de 6 pocillos se pueden mezclar en un tubo cónico de 50 ml estéril. Añadir 30 ml de EMEM-20% + S y sedimentar las células por centrifugación a 1,000-1,200 × g, sin necesidad de refrigeración, y con velocidad baja de freno. </li><li> Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en EMEM fresco-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. El uso de pasos a través de 1.2.1 1.2.3 arriba para Tripsinizar las células, las células continúan subcultivo en placas de cultivo de tejido como se describe en los pasos a través de 1.2.5 1.2.7 cuando están entre 75 - 80% confluente. </li><li> Subcultivo de un pocillo de una placa de 6-y hasta un T-25 cm 2 matraz en un volumen final de 5 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 0,5 a 1 x 10 6 células / matraz. </li><li> Uso de 5 ml de tripsina calentado por T-25 cm 2 matraz para separar las células, subcultivode un T-25 cm 2 matraz hasta un T-75 cm 2 matraz en un volumen final de 10 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 1 a 5 x 10 6 células / matraz. </li><li> Con 8 ml de tripsina calentado por T-75 cm 2 frasco para desprender las células, subcultura de un T-75 cm 2 frasco en 2 T-75 cm 2 frascos. Para el crecimiento celular óptimo, no células de subcultivo en matraces mayores de T-75 cm 2 o subcultivo en una proporción mayor que matraz de matriz 1: 3 frascos nuevos. </li></ol></li><li> Una vez que las células han sido subcultivadas, completamente quitar y reemplazar medio cada 2 a 3 días hasta que alcanzan 75-90% de confluencia. Las células pueden tomar hasta 3 semanas para llegar a 75-90% confluencia. Para la generación óptima de las culturas polarizadas, células subcultura antes de que crezcan más allá del 90% de confluencia en forma de monocapa. </li><li> Continuar con las células de subcultivo hasta que las células han crecido suficientes para sembrar el número deseado de inserciones Transwell. Cada inserto Transwell requiere 2 × 10 5 células. Para obtener un rendimiento óptimo de la generación de cultivos polarizados, utilizar células que han sufrido no más de 10 subcultivos. </li></ol> 2. Crecimiento polarizadas Calu-3 líquido cubiertas Culturas (LCC) Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. <ol><li> Preparar EMEM que contenía FBS al 10% (EMEM-10%) y se calienta en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Preparar una placa de 24 pocillos Transwell para la siembra. Utilizando pinzas estériles, inserciones Transwell de mover desde el interior de las filas exteriores de la placa sin tocar la membrana de inserción. Las células sólo se debe subcultivar en pocillos en las filas exteriores de la placa. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, añadir 600 l de EMEM-10% a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. </li><li> Separar las células de T-75 cm 2 de tejido. Subculture matraces usando tripsina calentado, y lavar con 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tratadas con tripsina, como se describe en el paso 1,2. </li><li> A fondo resuspender las células lavadas en 5 ml de EMEM-10% pipeteando suavemente arriba y abajo. </li><li> Determinar el recuento de células viables y totales por el método de exclusión con azul de tripano. Procede sólo si 80% - 90% son viables. </li><li> En un tubo cónico de 50 ml estéril, diluir las células a una concentración de 2 x 10 6 células viables / ml con EMEM-10%. </li><li> Añadir las células en el compartimiento apical de cada Transwell. A los pocillos A1 y D1, que será libres de células pocillos de control, es decir, espacios en blanco, añadir 100 ml de EMEM-10% sin células. Para cada uno de los pocillos restantes, añadir 100 ml de resuspensión de Calu-3 células, inclinando suavemente la pipeta contra el canal de guía interior de la pared del inserto y liberando lentamente las células. No toque la pipeta a la membrana de inserción. Para mantener una suspensión homogénea de Calu-3 células, agitar suavemente la suspensión celulardurante esta etapa de siembra. </li><li> Incubar la placa Transwell a 37 º C y 7% de CO 2 en atmósfera de aire. Colocar la placa en una incubadora donde perturbación física será mínimo. Para mejorar la eficiencia de la polarización, no se apilan las placas en la parte superior de la otra. </li><li> Para mantener los cultivos hasta polarizada y listo para usar en los experimentos, reemplazar completamente medio en transwells, como se describe en los pasos a través de 2,10 2,13 continuación. Medio debe ser reemplazado por completo tres días después de que se subcultivan en transwells, y luego en un ciclo de alternancia entre el día cuarto y tercero continuación, después de la alimentación anterior, hasta que las células son completamente polarizada. </li><li> Warm EMEM-10% en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Suavemente aspirar medio de inserciones Transwell. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero la eliminación de medio apical de todos los pocillos, y tla eliminación de gallina medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio. </li><li> Añadir 200 l de EMEM-10% para el compartimento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a los pocillos sembrados, dirigir el medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción. </li><li> Añadir 600 l de EMEM-10% de los compartimentos basolaterales. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, se añade medio a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. </li></ol> 3. Evaluación del Desarrollo de la Resistencia de Calu-3 LCC Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. <ol><li> Evaluar trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min después decambios de medio; la evaluación se puede realizar después de cada cambio de medio, si se desea. Realizar mediciones bajo condiciones estériles. Comenzar las mediciones con pozos el control libre de células A1 y D1 (los espacios en blanco) para obtener mediciones de referencia, y continuar con las mediciones para cada pocillo. <ol><li> En condiciones estériles, transferir el electrodo stx2 a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 70% de etanol en agua estéril, y esterilizar 15 min. </li><li> Calibrar y probar el voltohmmeter para uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Retire el electrodo del etanol, el aire seco 5-10 segundos, y enjuague el electrodo con agua estéril EMEM-10%. </li><li> Ajuste el selector de modo de la voltohmmeter al ajuste de resistencia y encender el equipo. </li><li> Suavemente coloque el electrodo en uno de los 3 puertos que permiten el acceso al compartimiento basolateral de una cultura Transwell. Coloque el electrodo para que la iniciativa es sólo toque ligeramente el fondo del pozo externo y se mantiene vertical,y el cable más corto es en el medio de cultivo tisular del compartimiento apical, sin tocar la membrana de inserción. </li><li> Empuje &quot;Medida R&quot; botón, y esperar a que la lectura se estabilice. Repetir para los otros 2 puertos para cada pocillo y registrar las mediciones de los tres puertos, para un total de tres mediciones por pocillo. Continuar para medir la resistencia de todos los pocillos de células. </li><li> Limpiar el electrodo por remojo 5-10 min en 70% de etanol, lavado en dH 2 O estéril, y secado a fondo. Conservar en el envase original. </li><li> Calcular la resistencia de cada pocillo, utilizando la Ecuación 1. Ω = Ω real de la muestra - Ω en blanco, la ecuación 1 donde la muestra Ω es la medida media de un pozo sin semillas y en blanco Ω es la medida promedio de los 2 pozos, A1 y ​​D1, que contiene las inserciones y medianas, pero las células no. </li><li> Calcular la resistencia unidad de área, utilizando Equación 2. Ω real x = área efectiva de la membrana × Ω cm 2, la ecuación 2 donde el área efectiva de la membrana es 0,33 cm 2 para 24-así inserciones Transwell. </li></ol></li><li> Compruebe que la polarización se completa mediante la realización de un ensayo secundario, la medición de la difusión pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral, de una a tres cultivos Transwell. Los pozos utilizados para el ensayo de fluoresceína sódica deben ser desechados inmediatamente después de la finalización del ensayo. <ol><li> Prepare no fluorescente tampón (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 en agua estéril; filtro estéril con 0,45 micras dispositivo de filtración ). Preparar fluoresceína de sodio a 1 mg / ml en tampón no fluorescente, filtro estéril, envolver en papel de aluminio, y se almacenan a 4 ° C, protegido de la luz. Calentar a habitación temvolver antes de su uso. </li><li> Después de completar las mediciones de resistencia, retirar cuidadosamente medio de los compartimentos apical y basolateral de uno a tres cultivos individuales Transwell. </li><li> Enjuague culturas Transwell. Suavemente añadir 600 l a temperatura ambiente estéril PBS de Dulbecco (D-PBS) a los compartimentos basolaterales y 100 l a temperatura ambiente estériles D-PBS a los compartimentos apical. </li><li> Retire con cuidado D-PBS de los pozos. Añadir 600 l estéril no fluorescente tampón a los compartimentos basolaterales. Añadir 100 l estéril de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio a los compartimentos apical. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hr. CO 2 no es necesario durante esta incubación. </li><li> Durante la incubación, preparar una curva estándar de fluoresceína sódica que oscila entre 20 mg / ml y 0 g / ml, utilizando no fluorescente tampón para diluir la fluoresceína sódica. Preparar al menos 8 diferentes concentraciones de fluoresceína de sodio, cada uno en un volumen final de al menos 600 l. Mantenerdiluciones de la curva estándar protegido de la luz hasta el momento de medir la absorbancia. </li><li> Transferir la muestra tampón no fluorescente desde el compartimento basolateral de cada Transwell de prueba a un tubo limpio separado para el análisis. Eliminar la prueba transwells utilizado para examinar la difusión pasiva de fluoresceína de sodio de la placa y desechar. Devolver la placa con transwells restantes a la incubadora. </li><li> Coloque 100 l de cada solución estándar por triplicado en un 96-pocillos de fondo plano placa. </li><li> Preparar tres diluciones de cada muestra basolateral (1:2, 1:20, y 1:50) en tampón no fluorescente, y añadir 100 ml de cada muestra no diluida y de cada dilución, en duplicado, en un 96-bien plana placa de fondo. </li><li> Medir la absorbancia de la muestra en un lector de placas de ELISA a 486 nm o 490 nm. </li><li> Determinar la concentración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral mediante la comparación de la absorbancia de las muestras en contra de los valores de absorbancia de la fluoresceína sódica stAndard curva. </li></ol></li></ol> 4. Infección Polarized Calu-3 LCC con virus respiratorio Medidas de seguridad: Realizar todos los procedimientos en un gabinete de seguridad biológica usando técnica de cultivo estéril, a un nivel de bioseguridad adecuado para el virus que se utiliza. <ol><li> Diluir virus en EMEM libre de suero de modo que los inóculos deseado sería en 100 l. </li><li> Lavar las células en EMEM libre de suero. Suavemente aspirar medio de todos los pocillos, eliminando el medio apical luego el medio basolateral. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero eliminando el medio apical de todos los pocillos, y después eliminando el medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio. <ol><li> Añadir 100 l de EMEM libre de suero para el compartimiento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, y después a tél sin semillas pocillos, dirigiendo medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción. </li><li> Añadir 600 l de EMEM libre de suero a los compartimentos basolaterales. Añadir medio a cada Transwell inclinando la pipeta contra la pared del compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. </li><li> Suavemente aspire el suero libre de medio de pozos. </li></ol></li><li> Empezando con los pozos no infectados o infectados mock-, añadir las diluciones adecuadas de virus para el compartimento apical de transwells. Para los pozos no infectados, añadir 100 ml de EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells apropiados, por infección simulada pocillos, añadir 100 l de virus libre de la preparación diluida en EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells adecuadas, y por infección por virus, virus diluir en EMEM libre de suero y añadir 100 ml de los compartimentos apical de transwells apropiadas. </li><li>Añadir 600 l de EMEM libre de suero para todos los compartimentos basolaterales. </li><li> Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 2 horas. </li><li> Aspirar el medio de pozos, en primer lugar de los pozos infectados y no infectados por el simulacro, luego de los pozos infectados. Eliminar los sobrenadantes apicales primero, seguidos por los sobrenadantes basolateral. </li><li> Reemplazar medio con 200 l de EMEM-10% en los compartimentos apical y 600 l de EMEM-10% en los compartimentos basolaterales. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Al establecer Calu-3 LCC en inserciones Transwell, las células no pueden polarizar en absoluto, o no puede polarizar completamente, tal como se define por una TEER ≥ 1000 Ω × 2 cm y ≤ sodio 1% de fluoresceína de equilibrado colorante entre los compartimentos apical y basolateral. Además, Calu-3 células en LCC puede polarizar completamente, pero TEER pueden ser incompatibles entre mediciones. A pesar de las fluctuaciones en las mediciones TEER de Calu-3 LCC son normales en el día a día, una vez completamente polarizados, cambios dramáticos en TEER no se espera hasta que el cultivo disminuye naturalmente con la edad, que puede ser tan poco como 5 semanas o hasta semanas 12 después de la siembra. La capacidad de Calu-3 LCC para polarizar depende en parte de cómo las células se mantienen y se subcultivaron antes de su uso en el sistema Transwell. Las células que han crecido más allá de 90% de confluencia como una monocapa durante el subcultivo, que han sido subcultivadas más de 10 veces de stock congelado, o que no han seren suministrada con medio fresco en un horario regular son menos propensos a polarizar completamente, y cualquier polarización es probable que disminuya rápidamente. Incompleta o falta total de polarización también se puede atribuir a la variación en el material y el tamaño de poro de transwells utilizados para Calu-3 LCC, y de lote a lote variación en transwells de composición similar y tamaño del poro puede afectar también a la polarización. Aumentar tamaños de poro puede permitir Calu-3 a crecer a través de la membrana Transwell en el compartimento basolateral, la prevención de la cultura de polarización. Una ausencia de polarización también puede ser debido al crecimiento bacteriano, se indica por medio de cultivo turbio, que conduce a la posterior ruptura de las uniones estrechas entre las células Calu-3. Medidas variables TEER de Calu-3 LCC puede ser causada por alteraciones mecánicas de las monocapas de células Calu-3 LCC, inserciones, o las propias placas. Cambios en el medio y las mediciones TEER deberán realizarse sin puntas de pipeta o electroconduce de tocar las células. Durante la realización de estas operaciones, se debe tener cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos apical y basolateral, que interrumpen la capacidad de la voltohmmeter para detectar la resistencia. La capacidad de la voltohmmeter para detectar la resistencia en una cultura que es en realidad polarizada puede también limitada por la acumulación de proteínas en los conductores de los electrodos. Esta acumulación puede ser retirado con lijado suave, o puede ser corregida mediante la sustitución del electrodo. Una vez Calu-3 LCC completamente polarizar y la TEER está aumentando ya no, Calu-3 LCC están listos para su uso como un modelo in vitro para la caracterización de las respuestas del huésped epiteliales de pulmón de células a la infección respiratoria. Este sistema permite una mejor caracterización de las respuestas de dirección a los patógenos en comparación con monocapa de cultivo de pulmón de células líneas tradicionalmente utilizados para estudiar patógenos respiratorios, tales como A549 y células HEp-2, con las ventajas adicionales de Calu-3 bei LCCng más rápida a desarrollar, se obtiene más fácilmente, y menos costoso para generar a primaria, y NHBE polarizado y diferenciado. Al igual que NHBE, polarizado Calu-3 demuestran la formación de uniones estrechas, y producen mucinas. Sin embargo, a diferencia de NHBE, polarizadas Calu-3 células no se diferencian en capas de células basales y de células epiteliales columnares ciliadas, y pocos polarizadas 3 Calu-células se desarrollan como cilios-proyecciones 19. Así, aunque útil para examinar las respuestas polarizadas de las vías respiratorias células epiteliales respiratorias insulto, polarizado Calu-3 LCC no son un modelo ideal para estudiar el desarrollo de las vías respiratorias o remodelación en respuesta al insulto respiratorias o lesiones. Producción de moco por las células cultivadas in vitro pueden afectar la infectividad celular, así como la liberación de virus infeccioso y la propagación del virus en un modelo polarizado, y una comparación directa de la producción de moco entre polarizada Calu-3 LCC y NHBE polarizado y diferenciado no ha sido reportado . A549 y células HEp-2 avolver más fáciles de cultivar que Calu-3 células, sin embargo, a diferencia de Calu-3 LCC, no formar cultivos polarizados cuando se cultivan en insertos Transwell, y por lo tanto no son modelos ideales para el examen in vitro de las respuestas de las células epiteliales polarizadas a la infección por virus respiratorio .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina - EDTA al 0,02% </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal bovino (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Inactivan por calor, 56 º C, 30 minutos </td></tr><tr><td> No esenciales aminoácidos 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Almacenar a 4 ° C en la oscuridad </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> FBS EMEM-10% (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM con FBS inactivado por calor al 10% de suero, esterilizada por filtro </td></tr><tr><td> EMEM-20% de FBS + suplementos (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Suplemento EMEM a concentraciones finales: FBS inactivado por calor, 20%; 1X aminoácidos; 2 mM L-glutamina; 10 mM de HEPES; estéril-filtro </td></tr><tr><td> 24-así placas Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 micras de tamaño de poro, poliéster </td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Prepare un 70% utilizando estéril dH 2 O </td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> No fluorescente tampón </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 en agua estéril, estéril filtro </td></tr><tr><td> Fluoresceína sódica </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml en agua estéril no fluorescente tampón; estéril-filtro, proteger de la luz; almacenar a 4 º C hasta 6 meses </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stx2 electrodo </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lector de placas ELISA </td><td></td><td></td><td> Capaz de medir un 486 o 490 A </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

Las superficies apical y basolateral de las células epiteliales de las vías respiratorias demostrar respuestas direccionales de la exposición patógeno in vivo. Por lo tanto, ideal en modelos in vitro para el examen de las respuestas celulares a patógenos respiratorios polarizan, formando superficies apical y basolateral. Uno de estos modelos se diferencian normales células epiteliales bronquiales humanas (NHBE). Sin embargo, este sistema requiere muestras de tejido pulmonar, la experiencia aislar y cultivar células epiteliales de tejido, y el tiempo para generar una cultura interfase aire-líquido. Calu-3 células, derivadas de un adenocarcinoma bronquial humano, son un modelo alternativo para el examen de la respuesta de las células epiteliales de vías respiratorias proximales al insulto respiratoria 1, los compuestos farmacológicos 2-6, 7-9 y bacterianas y patógenos virales, incluyendo el virus de la influenza, rinovirus y el síndrome respiratorio agudo severo - coronavirus asociado al 10-14. Recientemente, we demostrado que Calu-3 células son susceptibles a virus sincitial respiratorio (RSV) en una manera consistente con NHBE 15,16. Aquí, detalles de la creación de un polarizada, líquido cubierto de cultivo (LCC) de Calu-3 células, centrándose en los detalles técnicos de crecimiento y cultivo de células Calu-3, el mantenimiento de las células que han sido cultivadas en LCC, y se presenta el método para realizar la infección de virus respiratorio polarizadas Calu-3 células. Para obtener de forma polarizada Calu-3 LCC, Calu-3 células deben ser cuidadosamente subcultivaron antes de cultivar en inserciones Transwell. Calu-3 cultivos en monocapa debe permanecer por debajo de 90% de confluencia, se debe subcultivar menos de 10 veces de stock congelado, y regularmente debe ser suministrado con medio fresco. Una vez cultivadas en transwells, Calu-3 LCC debe ser manejado con cuidado. Los cambios de medios irregulares y la interrupción mecánica o física de las capas de células o placas de polarización para impactar negativamentevarias horas o días. La polarización se controla mediante la evaluación de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y se verificó mediante la evaluación de la equilibración pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral 17,18. Una vez mesetas TEER igual o superior a 1000 Ω x cm 2, Calu-3 LCC está listo para usar para examinar la respuesta celular a los patógenos respiratorios.

Cuando se cultiva como líquido cubiertas de cultivos (LCC) en sistemas de cultivo Transwell, como se ilustra en la Figura 1, Calu-3 células en desarrollo, se polarizan las distintas superficies apical y basolateral. Siguiendo el método descrito aquí, la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de Calu-3 LCC alcanza una meseta en o por encima de 1.000 Ω cm × 2 a 3 semanas después de la siembra, un ejemplo del cual se muestra en la Figura 2. Las uniones estrechas formadas entre células polarizadas prevenir equilibrado pasiva de pequeñas moléculas entre los compartimentos apical y basolateral. Así, un ensayo de fluoresceína sódica modificada de equilibración se utiliza para confirmar la polarización de Calu-3 LCC 15,17,18. Como la TEER de monocapas de células Calu-3 en incrementos de LCC, la cantidad de fluoresceína que pasivamente se equilibra en el compartimento basolateral disminuye. Una vez que la TEER es 1.000 Ω cm × 2, la cantidad de fluoresceína que se equilibra enpara el compartimento basolateral está ≤ 1%, como se muestra en la Figura 3, por lo tanto, Calu-3 LCC se considera que son completamente polarizada cuando la TEER es ≥ 1.000 Ω × 2 cm. La medición TEER pico de Calu-3 LCC puede variar de experimento a experimento. Sin embargo, una vez TEER meseta valores para cualquier experimento dado, totalmente polarizado, sin infectar Calu-3 LCC puede ser estable durante 5 hasta las 12 semanas post-siembra. La ausencia de desarrollo de resistencia en Transwell-cultivadas Calu-3 puede ser causado por varios factores, tal como se indica en la Tabla 1. Una vez que la TEER de Calu-3 mesetas LCC en o por encima de 1.000 Ω cm × 2, el modelo está listo para ser utilizado para examinar las vías respiratorias respuestas de las células epiteliales de los patógenos respiratorios, incluyendo el virus sincitial respiratorio (RSV). La exposición a los resultados de RSV en una disminución más rápida de la integridad de la cultura polarizada en comparación con una maqueta de la infección de células (Figura 4). Figura 1. Células sección transversal de representación de Transwell-cultivos de células. Se cultivan en la superficie apical de la membrana de inserción. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figura 2. Desarrollo de trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) y la polarización de Calu-3 células después de la siembra en insertos Transwell. En cada punto de tiempo, TEER se presentan como mediana Ω cm x 2 ± SEM de 32 pocillos independientes de un experimento representativo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figura 3. Pasivo equili<html> calibración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral de las monocapas de células Calu-3 es inhibida como células polarizado. Los datos acumulados de cuatro experimentos independientes se presenta. Cada punto de datos representa una medición individual. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figura 4. Infección por el RSV de polarizado Calu-3 LCC acelera la disminución de integridad de la monocapa. Polarized Calu-3 células fueron infectadas con RSV-A2 a una MOI = 1 en el día 0, y la polaridad se monitorizó durante 8 semanas después de la infección. Un experimento representativo se muestra. Los datos se presentan como mediana resistencia de 8 pocillos independientes por infección ± SEM por punto de tiempo. * P &lt;0,05 entre culturas maqueta y RSV-A2-infectados, según se determina mediante el t-test. formas &quot;&gt; <tbody><tr><td> Cuestión </td><td> Resolución (s) </td></tr><tr><td> La resistencia no es mensurable </td><td><ul><li> Eliminar las burbujas de aire en los pozos </li><li> Use Calu-3 células que han sido subcultivadas de stock congelado menos de 10 veces </li><li> No permita que Calu-3 células para alcanzar el 100% de confluencia en la subcultura monocapa </li><li> Comprobar que las células no están creciendo en el plástico muy por debajo de la pieza de inserción (lo que indica que las células pueden haber crecido a través de los poros de la pieza de inserción) </li><li> Permita 2-3 semanas después de la siembra para el desarrollo de resistencia completa </li><li> Comprobar la composición y tamaño de poro de insertos utilizados, si es necesario cambiar (inserto de poliéster recomendada, 0,3 micras de tamaño de poro, no revestimientos, materiales para ver detalles) </li><li> Comprobación de la calidad del electrodo, lijar suavemente para eliminar las proteínas acumuladas desde la punta, y si es necesario sustituir </li><li> Ver medio para el crecimiento bacteriano </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> La resistencia se desarrolla, pero la polarización total (≥ 1000 Ω x cm 2) no se alcanza </td><td><ul><li> Permitir tiempo adicional para la polarización de desarrollar (en ocasiones puede tardar hasta 4 semanas) </li><li> Use Calu-3 células que han sido subcultivadas de stock congelado menos de 10 veces </li><li> No permita que Calu-3 células para alcanzar el 100% de confluencia en la subcultura monocapa </li><li> Consistentemente sustituir medio en cultivos Transwell, alternando entre el cuarto día de la tercera y luego después de la alimentación anterior </li><li> Sólo las células de cultivo en insertos que se colocan en las filas exteriores de las placas </li><li> Usar un lote diferente de inserciones Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Las células completamente polarizar, pero la resistencia no es consistente entre una lectura y la siguiente </td><td><ul><li> No interrumpir ni apile las placas en la incubadora </li><li> No provocan vibraciones en la cabina de bioseguridad mientras Transwell platES se están manejando </li><li> Eliminar las burbujas de aire en los pozos </li><li> No moleste a la capa de células con puntas de pipeta al cambiar los medios de comunicación o la realización de lecturas TEER </li><li> Usar medio 200 l en el compartimento apical; menor volumen puede producir lecturas inestables TEER </li><li> Compruebe la calidad del electrodo, lijar suavemente para eliminar las proteínas acumuladas en la punta, y reemplazar si es necesario </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Localización de Averías problemas que pueden surgir cuando se cultiva Calu-3 células en transwells. Múltiples factores contribuyen a la polarización completa de Calu-3 células en el líquido cubiertas de cultivos, los más probables de los cuales se destacan en esta tabla.

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Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K vistas.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no necesariamente representan las opiniones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Los cultivos humanos de la placenta y Decidual de órganos para el Estudio de Infecciones en la interfase materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...