Gli autori desiderano ringraziare Elisabetta Blanchard per la sua assistenza tecnica. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista dei Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione.

1. Colture Calu-3 celle per l&#39;uso in Culture Transwell Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura. <ol><li> Per scongelare le cellule di congelazione: <ol><li> Preparare terreno minimo essenziale di Eagle contenente 20% di siero di siero bovino fetale (FBS), 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina, e 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterile-filtro il terreno preparato con un 0,2 micron pori grandezza del filtro, e caldo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Per essere più riflettente del contesto in situ epitelio delle vie aeree, mezzo non è integrato con antibiotici o antimicotici. </li><li> Scongelare una provetta Microbank ™ congelata di Calu-3 celle rapidamente (&lt;1 min) a 37 ° C bagnomaria. </li><li> Trasferire le cellule scongelate in una provetta da 50 ml conica sterile ed aggiungere 30 ml di caldo EMEM-20% + S. </li><li> Pellet le cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 1000-1200 × g,senza refrigerazione, con velocità e freni. </li><li> Decantare il surnatante delicatamente e risospendere le cellule in 5 ml di caldo EMEM-20% + S delicatamente pipettando su e giù. Seed 2 a 5 x 10 6 cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti di coltura e incubare a 37 ° C, 7% CO 2 in atmosfera di aria fino a quando le cellule sono del 75% - 80% confluenti. Controllare tutti i giorni, fino a 7 giorni può essere richiesto. Ogni 3-4 giorni aspirare il terreno dalle cellule e sostituirlo con fresco EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Per celle sottocultura: <ol><li> Caldo tripsina 0,05% - 0,02% EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Aspirare il terreno dalle cellule, cellule e lavare una volta con riscaldata tripsina 0,05% - 0,02% EDTA per rimuovere eccesso di terreno e siero. Rimuovere il lavaggio e aggiungere 1 ml di tripsina riscaldato per pozzetto alle cellule. </li><li> Incubare a 37 ° C e il 7% di CO 2 e monitor al microscopio ogni 5 min fino ad almeno il 75% delle cellule staccare dal pozzo (s) della piastra di coltura tissutale. Questo puòprendere tra 5 e 30 minuti. </li><li> Lavare le cellule in EMEM-20% + S per rimuovere l&#39;eccesso tripsina. Trasferire le cellule tripsinizzate in una provetta conica da 50 ml sterile. Più pozzetti di cellule da una piastra da 6 pozzetti coltura possono essere raggruppati in un unico tubo da 50 ml conica sterile. Aggiungere 30 ml di EMEM-20% + S e agglomerare le cellule per centrifugazione a 1000-1200 × g, senza refrigerazione, con velocità e freni. </li><li> Decantare il surnatante delicatamente e risospendere le cellule in fresco EMEM-20% + S pipettando gentilmente su e giù. Utilizzando i passaggi attraverso 1.2.1 1.2.3 qui sopra per Tripsinizzare cellule, le cellule continuano a sottocultura in piatti di coltura di tessuti come descritto nei punti 1.2.5 tramite 1.2.7 quando sono tra il 75 - 80% confluenti. </li><li> Subcoltura da un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti fino ad un T-25 cm 2 beuta in un volume finale di 5 ml di EMEM-20% + S, semina tra 0,5 a 1 x 10 6 cellule / fiasco. </li><li> Con 5 ml di tripsina riscaldato per T-25 cm 2 pallone per staccare le cellule, subculturada un T-25 cm 2 pallone a uno T-75 cm 2 pallone in un volume finale di 10 ml di EMEM-20% + S, semina da 1 a 5 x 10 6 cellule / fiasco. </li><li> Utilizzo di 8 ml riscaldato tripsina per T-75 cm 2 pallone per staccare le cellule, sottocultura da un T-75 2 cm pallone in 2 T-75 cm 2 palloni. Per la crescita cellulare ottimale, non subcoltura cellule in fiasche grandi di T-75 cm 2 o subcultura ad un rapporto maggiore di 1 pallone genitore: 3 flaconi nuovi. </li></ol></li><li> Una volta che le cellule sono state subcolturate completamente rimuovere e sostituire medio ogni 2 o 3 giorni fino a raggiungere 75-90% di confluenza. Le cellule possono richiedere fino a 3 settimane per raggiungere il 75-90% confluenza. Per la generazione ottimale di culture polarizzati, cellule sottocultura prima di crescere oltre il 90% di confluenza in un monostrato. </li><li> Continuare a cellule sottocultura finché le cellule sono cresciute abbastanza per inizializzare il numero desiderato di inserti Transwell. Ogni inserto Transwell richiede 2 × 10 5 cellule. Per prestazioni ottimali generando culture polarizzate, utilizzare cellule che hanno subito non più di 10 sottoculture. </li></ol> 2. Growing polarizzati Calu-3 Liquido coperte di Culture (LCC) Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura. <ol><li> Preparare EMEM contenente 10% FBS (EMEM-10%) e caldo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Preparare un 24-pozzetti Transwell per la semina. Utilizzando pinze sterili, spostare inserisce Transwell dall&#39;interno alle righe esterne della piastra senza toccare la membrana di inserimento. Cellule devono essere subcoltivate in pozzetti sulle righe esterne della piastra. Per evitare la formazione di bolle d&#39;aria all&#39;interno del vano basolaterali, aggiungere 600 microlitri di EMEM-10% a ciascuno inclinando la pipetta contro la parete di ciascun vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo. </li><li> Staccare le cellule di T-75 cm 2 tessuti. Subcufiaschi lture utilizzando tripsina riscaldato, e lavare in 30 ml di EMEM-20% + S per ogni 2 fiaschi di cellule tripsinizzate, come descritto al punto 1.2. </li><li> Accuratamente risospendere le cellule lavate in 5 ml di EMEM-10% delicatamente pipettando su e giù. </li><li> Determinare conteggio delle cellule vitali e totale con il metodo di esclusione trypan blu. Procedere solo se l&#39;80% - 90% sono vitali. </li><li> In una provetta conica da 50 ml sterile, diluire cellule ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule vitali / ml con EMEM-10%. </li><li> Aggiungere celle al compartimento apicale di ogni Transwell. Per pozzetti A1 e D1, che saranno privi di cellule pozzetti di controllo, che è, spazi, aggiungere 100 microlitri di EMEM-10% senza cellule. A ciascuno dei rimanenti pozzetti, aggiungere 100 microlitri di sedimento Calu-3 celle, delicatamente inclinando la pipetta contro il canale di guida interno della parete dell&#39;inserto e rilasciando lentamente le cellule. Non toccare la pipetta alla membrana inserto. Per mantenere una sospensione omogenea di cellule Calu-3, agitare delicatamente la sospensione cellularedurante questa fase semina. </li><li> Transwell incubare a 37 ° C e il 7% di CO 2 in atmosfera di aria. Collocare la piastra in un incubatore dove disturbo fisico sarà minimo. Per migliorare l&#39;efficienza di polarizzazione, non impilare piatti uno sopra l&#39;altro. </li><li> Per mantenere culture fino polarizzata e pronto per l&#39;uso in esperimenti, sostituire completamente medie Transwells, come descritto nei passaggi 2,10 a 2.13 di seguito. Terreno deve essere completamente sostituita tre giorni dopo essere subcoltura in Transwells, e quindi su un ciclo alternato tra il quarto giorno e poi terzo dopo la somministrazione precedente, finché le cellule sono completamente polarizzati. </li><li> Caldo EMEM-10% in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Aspirare delicatamente media da inserti Transwell. Con una pipetta capillare collegato ad una trappola vuoto con un vuoto dolce, o con una pipetta da 1 ml, medie aspirato da cell-free pozzetti A1 e D1, poi da seeded pozzi, prima di rimuovere medio apicale da tutti i pozzetti, e tgallina rimozione media basolaterale da tutti i pozzetti. Non toccare le membrane inserti mentre aspirazione media. </li><li> Aggiungere 200 pl di EMEM-10% al compartimento apicale del cell-free pozzetti A1 e D1, quindi ai pozzetti seminato, dirigendo il mezzo nel vano apicale usando il lato dell&#39;inserto per guidare la punta della pipetta. Non aggiungere mezzo direttamente su cellule, e non toccare la membrana di inserimento. </li><li> Aggiungere 600 pl di EMEM-10% ai compartimenti basolaterali. Per evitare la formazione di bolle d&#39;aria all&#39;interno del vano basolaterali, aggiungere mezzo a ciascuno inclinando la pipetta contro la parete di ciascun vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo. </li></ol> 3. Valutare lo sviluppo di resistenza di Calu-3 LCC Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza con tecnica sterile cultura. <ol><li> Valutare trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) di Calu-3 LCC 30 minuti dopocambia il supporto, la valutazione può essere eseguita dopo ogni cambio di mezzo se lo si desidera. Eseguire misure in condizioni sterili. Inizia misure con il cell-free dei pozzetti di controllo A1 e D1 (le frasi) per ottenere misurazioni di base, e proseguire con le misurazioni per ciascun pozzetto. <ol><li> In condizioni di sterilità, trasferire l&#39;elettrodo Stx2 un tubo da centrifuga da 50 ml contenente 70% di etanolo in acqua sterile, e sterilizzare 15 min. </li><li> Calibrare e provare il voltohmmeter per l&#39;uso secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Rimuovere l&#39;elettrodo dal etanolo, aria secca sec 5-10, e sciacquare l&#39;elettrodo con sterile EMEM-10%. </li><li> Impostare il selettore di modalità del voltohmmeter per l&#39;impostazione della resistenza, e accendere l&#39;unità. </li><li> Posizionare delicatamente l&#39;elettrodo in una delle tre porte che permettono l&#39;accesso al vano basolaterale di una cultura Transwell. Elettrodo posto in modo che la portano più solo leggermente tocca il fondo del pozzo esterno e rimane verticale,e il terminale corto è nel mezzo di coltura tissutale del compartimento apicale, senza toccare la membrana inserto. </li><li> Premere &quot;Misura R&quot; pulsante e attendere che la lettura si stabilizzi. Ripetere per le altre due porte per ciascun pozzetto e registrare le misure da tutte e tre porte, per un totale di tre misurazioni per pozzetto. Continuare a misurare la resistenza per tutti i pozzetti di cellule. </li><li> Pulire l&#39;elettrodo immergendolo 5-10 minuti in etanolo al 70%, risciacquo in sterile dH 2 O, e asciugatura accuratamente. Conservare nel contenitore originale. </li><li> Calcolare la resistenza di ogni pozzetto, con l&#39;equazione 1. Ω = Ω attuale campione - Ω bianco, l&#39;equazione 1 cui il campione Ω è la misura media da un pozzo privato dei semi e Ω bianco è la misura media dei pozzi 2, A1 e D1, contenenti inserti e medie, ma non le cellule. </li><li> Calcolare la resistenza unità di superficie, usando Equazione 2. Ω × area effettiva della membrana effettiva = Ω × cm 2, l&#39;equazione 2 in cui l&#39;area effettiva della membrana è 0,33 cm 2 per 24 pozzetti inserti Transwell. </li></ol></li><li> Verificare che la polarizzazione è completa eseguendo un test secondario, che misura la diffusione passiva fluoresceina di sodio tra i compartimenti apicale e basolaterale, sul 1-3 culture Transwell. I pozzetti di siero umano fluoresceina di sodio deve essere eliminata immediatamente dopo il completamento del test. <ol><li> Preparare non fluorescente tampone (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 .2 H 2 O, 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in acqua sterile; filtro sterile con 0,45 micron dispositivo di filtrazione ). Preparare fluoresceina di sodio a 1 mg / ml in tampone non fluorescente, filtro sterile, avvolgerlo in un foglio di alluminio, e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce. Riscaldare a temperature ambientenuovamente prima dell&#39;uso. </li><li> Dopo aver completato misure di resistenza, rimuovere accuratamente medio da entrambi i compartimenti basolaterali e apicale di 1-3 singole culture Transwell. </li><li> Sciacquare culture Transwell. Delicatamente aggiungere 600 microlitri temperatura ambiente sterile PBS di Dulbecco (D-PBS) ai compartimenti basolaterali e 100 pl temperatura ambiente sterile D-PBS ai compartimenti apicali. </li><li> Rimuovere delicatamente D-PBS dai pozzi. Aggiungere 600 microlitri sterile non fluorescente tampone ai vani basolaterali. Aggiungere 100 pl sterile 1 mg / ml di sodio fluoresceina ai compartimenti apicali. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 1 ora. CO 2 non è richiesto durante l&#39;incubazione. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare una curva standard di sodio fluoresceina compresa tra 20 mg / ml e 0 microgrammi / ml, utilizzando non fluorescente tampone per diluire fluoresceina di sodio. Preparare almeno 8 diverse concentrazioni di sodio fluoresceina, ciascuna in un volume finale di almeno 600 microlitri. Mantenerediluizioni della curva standard al riparo dalla luce fino al momento di misurare l&#39;assorbanza. </li><li> Trasferire il campione non fluorescente tampone dal vano basolaterale di ogni Transwell test per un tubo separato pulito per l&#39;analisi. Rimuovere il test Transwells utilizzato per esaminare diffusione passiva fluoresceina di sodio dalla piastra e scartare. Riportare la piastra con Transwells restanti l&#39;incubatrice. </li><li> Mettere 100 ml di ciascuna soluzione standard in triplice copia in una da 96 pozzetti a fondo piatto piatto. </li><li> Preparare tre diluizioni di ciascun campione basolaterale (1:02, 1:20 e 1:50) in non-fluorescente tampone, e aggiungere 100 ml di ciascun campione diluito e di ogni diluizione, in duplice copia, in un 96-ben piatto piastra inferiore. </li><li> Misura assorbanza del campione su un lettore di piastre ELISA a 486 nm o 490 nm. </li><li> Determinare la concentrazione di sodio fluoresceina nel vano basolaterale confrontando l&#39;assorbanza dei campioni con i valori di assorbanza per il sodio fluoresceina stcurva Andard. </li></ol></li></ol> 4. Infezione polarizzata Calu-3 LCC con Virus Respiratorio Misure di sicurezza: Eseguire tutte le procedure in un armadio biosicurezza utilizzando una tecnica sterile cultura, ad un livello adeguato di biosicurezza per il virus in uso. <ol><li> Diluire virus nel siero privo EMEM modo che inoculi desiderata sarebbe in 100 pl. </li><li> Lavare le cellule nel siero senza EMEM. Aspirare delicatamente media da tutti i pozzetti, rimuovere il mezzo apicale poi il mezzo basolaterale. Con una pipetta capillare collegato ad una trappola vuoto con un vuoto dolce, o con una pipetta da 1 ml, medie aspirato da cell-free pozzetti A1 e D1, poi da seeded pozzi, prima rimuovere il mezzo apicale da tutti i pozzetti, e quindi rimuovendo il mezzo basolaterale da tutti i pozzetti. Non toccare le membrane inserti mentre aspirazione media. <ol><li> Aggiungere 100 pl di siero privo EMEM al compartimento apicale del cell-free pozzetti A1 e D1, e quindi tegli seeded pozzi, dirigendo medie nel vano apicale usando il lato dell&#39;inserto per guidare la punta della pipetta. Non aggiungere mezzo direttamente sulle cellule, e non toccare la membrana di inserimento. </li><li> Aggiungere 600 microlitri di siero privo EMEM ai compartimenti basolaterali. Aggiungere mezzo a ciascuna Transwell inclinando la pipetta contro la parete del vano e rilasciando lentamente il mezzo nel pozzo. </li><li> Aspirare delicatamente terreno privo di siero da pozzi. </li></ol></li><li> A partire da pozzi non infetti o mock-infetto, aggiungere diluizioni virus appropriate al compartimento apicale Transwells. Per i pozzi non infetti, aggiungere 100 microlitri di siero-free EMEM al compartimento apicale di Transwells appropriate, per mock-infettate pozzetti, aggiungere 100 ml di virus diluito in preparazione privo di siero EMEM al compartimento apicale di Transwells caso, e per infezione da virus, diluire virus nel siero senza EMEM e aggiungere 100 microlitri ai compartimenti apicali delle Transwells appropriati. </li><li>Aggiungere 600 ml di siero-free EMEM in tutti i comparti basolaterali. </li><li> Incubare a 37 ° C e il 7% CO 2 per 2 h. </li><li> Aspirare il terreno da pozzi, in primo luogo da pozzi non infetti e mock-infetto, quindi dai pozzi infetti. Rimuovere surnatanti apicali prima, seguita da surnatanti basolaterali. </li><li> Sostituire medio con 200 pl di EMEM-10% in compartimenti apicali e 600 pl di EMEM-10% in compartimenti basolaterali. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nello stabilire Calu-3 LCC in inserti Transwell, cellule non polarizzare affatto, o non completamente polarizzare, come definito da una TEER ≥ 1000 Ω × 2 cm e ≤ 1% equilibrazione sodio fluoresceina tra i compartimenti apicale e basolaterale. Inoltre, Calu-3 celle in LCC può polarizzare completamente, ma TEER potrebbe non essere coerente tra le misurazioni. Anche se le fluttuazioni nelle misure Teer di Calu-3 LCC sono normali di giorno in giorno, una volta completamente polarizzati, scombussolato in modo drammatico in TEER non sono previsti fino a quando la cultura diminuisce naturalmente con l&#39;età, che può essere un minimo di 5 settimane o finché 12 settimane dopo la semina. La capacità di Calu-3 LCC per polarizzare dipende in parte come le cellule vengono mantenute e subcoltivate prima dell&#39;uso nel sistema Transwell. Le cellule che sono cresciuti oltre il 90% di confluenza in un monostrato in subcoltura, che sono state subcoltura più di 10 volte da stock congelati, o che non sono inen fornito con mezzo fresco su un programma normale sono meno propensi a polarizzare pienamente, e qualsiasi polarizzazione è probabile un rapido declino. Incompleta o totale assenza di polarizzazione può essere attribuita alla variazione nel materiale e la dimensione dei pori di Transwells utilizzati per Calu-3 LCC, e da lotto a lotto variazione Transwells di composizione simile dimensione dei pori può anche influenzare la polarizzazione. Dimensioni dei pori più grandi possono permettere Calu-3 di crescere attraverso la membrana Transwell nel vano basolaterale, impedendo la cultura di polarizzazione. L&#39;assenza di polarizzazione può anche essere dovuta alla crescita batterica, indicato dal terreno di coltura nebuloso, che porta alla successiva ripartizione delle giunzioni strette tra Calu-3 celle. Misurazioni Teer variabili di Calu-3 LCC possono essere causati da perturbazioni meccaniche dei Calu-3 monostrati cellulari LCC, gli inserti o le piastre stesse. Cambiamenti a medio e misurazioni Teer devono essere eseguiti senza puntali o elettrode conduce toccare le cellule. Durante l&#39;esecuzione di queste operazioni, si dovrebbe aver cura di evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria all&#39;interno del vano apicale e basolaterale, che disturbano la capacità del voltohmmeter per rilevare la resistenza. La capacità del voltohmmeter per rilevare la resistenza in una cultura che è in realtà polarizzata può anche limitata da accumulo di proteine ​​sui cavi elettrodi. Questo accumulo può essere rimosso con sabbiatura dolce, o può essere corretto sostituendo l&#39;elettrodo. Una volta Calu-3 LCC completamente polarizzare e la TEER non aumenta più, Calu-3 LCC sono pronte per l&#39;uso come un modello in vitro per caratterizzare ospitanti risposte cellulari epiteliali polmonari di infezioni respiratorie. Questo sistema permette una migliore caratterizzazione delle risposte direzionali per patogeni rispetto alle linee polmone-coltura monostrato di cellule tradizionalmente utilizzati per studiare patogeni respiratori, come A549 e cellule HEp-2, con i vantaggi supplementari di Calu-3 LCC being più rapido per sviluppare, più facilmente ottenuta, e meno costoso da produrre rispetto primaria, polarizzata, NHBE differenziata. Simile a NHBE, polarizzato Calu-3 dimostrano formazione serrata di giunzione, e produrre mucine. Tuttavia, a differenza NHBE, polarizzate Calu-3 cellule non si differenziano in strati di cellule basali e cellule ciliate colonnari epiteliali, e pochi polarizzati Calu-3 le cellule si sviluppano le ciglia-come le proiezioni 19. Così, anche se utile per esaminare le risposte di cellule polarizzate epiteliali delle vie aeree per insulto respiratoria, polarizzato Calu-3 LCC non sono un modello ideale per esaminare lo sviluppo delle vie aeree o di rimodellamento in risposta a insulto respiratorie o lesioni. Produzione di muco da cellule coltivate in vitro possono influenzare infettività cellulare, così come la liberazione del virus infettivo e diffusione del virus in un modello polarizzato, e un confronto diretto della produzione di muco tra polarizzata Calu-3 LCC e polarizzata, NHBE differenziata non è stata riportata . A549 e cellule HEp-2 ari più facile rispetto alla cultura Calu-3 cellule, tuttavia, a differenza Calu-3 LCC, non formano culture polarizzati quando coltivate su inserti Transwell, e quindi non sono modelli ideali per l&#39;esame in vitro le risposte delle cellule epiteliali polarizzate di infezione del virus respiratorio .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTI </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina 0,05% - 0,02% EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Minimum Essential Eagle (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Calore inattivano, 56 ° C, 30 min </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Conservare a 4 ° C al buio </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10% FBS (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Supplemento EMEM con FBS inattivato al calore al 10% di siero,-filtro sterile </td></tr><tr><td> EMEM-20% FBS + integratori (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Supplemento EMEM a concentrazioni finali: FBS inattivato al calore, 20%; 1X amminoacidi, 2 mM L-glutammina; HEPES 10 mM;-filtro sterile </td></tr><tr><td> Da 24 pozzetti Transwell piastre </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 Dimensione dei pori micron, poliestere </td></tr><tr><td> Blu Trypan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Preparare al 70% con sterili dH 2 O </td></tr><tr><td> PBS di Dulbecco (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Non fluorescente tampone </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 × H 2 O, 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in acqua sterile;-filtro sterile </td></tr><tr><td> Sodio fluoresceina </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml in sterile non fluorescente buffer;-filtro sterile, proteggere dalla luce, conservare a 4 ° C fino a 6 mesi </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stx2 elettrodo </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lettore di piastra ELISA </td><td></td><td></td><td> Grado di misurare A 486 o A 490 </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

Le superfici apicale e basolaterale delle cellule epiteliali delle vie aeree dimostrare risposte direzionali all&#39;esposizione patogeno in vivo. Così, ideale modelli in vitro per l&#39;esame di risposte cellulari patogeni respiratori polarizzare, formando superfici apicale e basolaterale. Uno di questi modelli è differenziato normali cellule epiteliali bronchiali umane (NHBE). Tuttavia, questo sistema richiede campioni di tessuto polmonare, competenze isolare e coltivazione di cellule epiteliali di tessuto, e il tempo per generare un aria-liquido cultura dell&#39;interfaccia. Calu-3, le cellule derivate da un adenocarcinoma umano bronchiale, sono un modello alternativo per esaminare la risposta delle cellule epiteliali delle vie aeree prossimali ad insulto respiratoria 1, composti farmacologici 2-6, e 7-9 batteriche e virali patogeni, inclusi virus dell&#39;influenza, rhinovirus e grave sindrome respiratoria acuta - coronavirus associato 10-14. Recentemente, we ha dimostrato che le cellule Calu-3 sono soggetti a virus respiratorio sinciziale (RSV) infezione in un modo coerente con NHBE 15,16. Qui, abbiamo dettaglio la creazione di un polarizzato, liquido coperto di cultura (LCC) di Calu-3 celle, concentrandosi sui dettagli tecnici di crescita e coltura Calu-3 celle, il mantenimento di cellule che sono state coltivate in LCC, e vi presentiamo la metodo per l&#39;esecuzione di infezione da virus respiratorio polarizzati Calu-3 celle. Per ottenere sempre polarizzato Calu-3 LCC, Calu-3 celle devono essere attentamente sottocoltura prima coltura in inserti Transwell. Calu-3 colture monostrato dovrebbe rimanere inferiore al 90% di confluenza, dovrebbe essere subcoltura meno di 10 volte da stock congelati, e dovrebbe essere regolarmente fornito con terreno fresco. Una volta coltivate in Transwells, Calu-3 LCC deve essere maneggiato con cura. Irregolari cambiamenti dei media e di una perturbazione meccanica o fisica degli strati di cellule o piastre di avere un impatto negativo per la polarizzazionediverse ore o giorni. Polarizzazione viene monitorata valutando trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) e viene verificato valutando l&#39;equilibrazione passiva di fluoresceina di sodio tra i compartimenti apicale e basolaterale 17,18. Altipiani volta TEER pari o superiore a 1000 Ω × 2 cm, Calu-3 LCC sono pronti per l&#39;uso per esaminare le risposte cellulari ai patogeni respiratori.

Quando coltivata come liquido ricoperte culture (LCC) in sistemi di coltura Transwell, come illustrato in figura 1, Calu-3 cellule polarizzano, sviluppo distinte superfici apicale e basolaterale. Seguendo il metodo qui descritto, il trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) di Calu-3 LCC raggiunge un plateau a 1000 Ω o sopra × 2 cm entro 3 settimane dopo la semina, di cui un esempio è mostrato in figura 2. Le giunzioni strette formate tra cellule polarizzate impedire equilibrazione passiva di piccole molecole tra i compartimenti apicale e basolaterale. Così, un saggio modificato di sodio fluoresceina equilibrazione viene utilizzato per confermare polarizzazione di Calu-3 LCC 15,17,18. Come TEER di Calu-3 monostrati cellulari in LCC aumenta, la quantità di fluoresceina che equilibra passivamente nel compartimento basolaterale diminuisce. Una volta che il TEER è 1000 × Ω cm 2, la quantità di fluoresceina che equilibra inal vano basolaterale è ≤ 1%, come mostrato in figura 3, pertanto, Calu-3 LCC sono considerati completamente polarizzato quando il TEER è ≥ 1000 Ω cm 2 ×. La misurazione TEER picco di Calu-3 LCC può variare dalla fase sperimentale alla sperimentazione. Tuttavia, una volta plateau TEER valori per qualsiasi dato esperimento, completamente polarizzata, non infetto Calu-3 LCC può essere stabile per 5 a 12 settimane dopo la semina. Assenza di sviluppo di resistenza in Transwell-colta Calu-3 può essere causato da diversi fattori come indicato nella Tabella 1. Dopo l&#39;TEER di Calu-3 plateau LCC pari o superiore 1000 Ω × 2 cm, il modello è pronto per essere utilizzato per esaminare le risposte delle cellule epiteliali delle vie aeree da patogeni respiratori, tra cui il virus respiratorio sinciziale (RSV). Esposizione a risultati RSV in una più rapida diminuzione dell&#39;integrità cultura polarizzata rispetto a un mock-infezione di cellule (Figura 4). Figura 1. Sezione rappresentazione di Transwell-colture di cellule. Le cellule sono cresciute sulla superficie apicale della membrana dell&#39;inserto. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Figura 2. Sviluppo di trans-epiteliale resistenza elettrica (TEER) e polarizzazione di cellule Calu-3 dopo la semina in inserti Transwell. A ciascun punto di tempo TEER si presenta come mediana Ω x cm 2 ± SEM di 32 pozzetti indipendenti di un esperimento rappresentativo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Figura 3. Passivo equili<html> brazione di fluoresceina sodio nel comparto basolaterale di Calu-3 monostrati di cellule viene inibita come cellule si polarizzano. dati cumulati di quattro esperimenti indipendenti è presentato. Ciascun punto di dati rappresenta una singola misurazione. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Figura 4. Infezione da VRS di Calu-3 polarizzato LCC accelera un calo integrità monostrato. Polarizzati Calu-3 cellule sono state infettate con RSV-A2 ad una MOI = 1 al giorno 0, e la polarità è stata monitorata per 8 settimane dopo l&#39;infezione. Un esperimento rappresentativo è mostrato. I dati sono presentati come media di resistenza 8 pozzetti indipendenti per infezione ± SEM per punto temporale. * P &lt;0.05 tra le culture e mock-RSV-A2-infetti, come determinato da Student t-test. modi &quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Risoluzione (s) </td></tr><tr><td> La resistenza non è misurabile </td><td><ul><li> Rimuovere eventuali bolle d&#39;aria nei pozzetti </li><li> Utilizzare Calu-3 celle che sono state congelate subcoltura da magazzino meno di 10 volte </li><li> Non permettere Calu-3 celle per raggiungere il 100% di confluenza in sottocultura monostrato </li><li> Controllare che le cellule non crescono sulla plastica ben al di sotto l&#39;inserto (che indica che le cellule possono essere coltivate attraverso i pori dell&#39;inserto) </li><li> Lasciare 2-3 settimane post-semina dello sviluppo della resistenza totale </li><li> Controllare la composizione e la dimensione dei pori di inserti usati, modificare se necessario (inserto poliestere consigliato, 0.3 micron dimensioni dei pori, senza rivestimenti, materiali per vedere i dettagli) </li><li> Controllare la qualità dell&#39;elettrodo, levigatura delicatamente per rimuovere le proteine ​​accumulate dalla punta, e se necessario sostituendo </li><li> Controllare terreno per la crescita batterica </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Sviluppa la resistenza, ma polarizzazione completo (≥ 1000 Ω × cm 2) non è raggiunto </td><td><ul><li> Il tempo di attesa per la polarizzazione per lo sviluppo (può occasionalmente richiedere fino a 4 settimane) </li><li> Utilizzare Calu-3 celle che sono state congelate subcoltura da magazzino meno di 10 volte </li><li> Non permettere Calu-3 celle per raggiungere il 100% di confluenza in sottocultura monostrato </li><li> Coerentemente sostituire medie culture Transwell, alternando tra il terzo giorno e poi quarto dopo l&#39;alimentazione precedente </li><li> Solo le cellule di coltura su inserti che vengono inseriti nelle righe esterne di piastre </li><li> Utilizzare un lotto di inserti Transwell </li></ul></td></tr><tr><td> Polarizzare cellule completamente, ma la resistenza non è coerente da una lettura all&#39;altra </td><td><ul><li> Non disturbare o impilare piastre in incubatrice </li><li> Non provocare vibrazioni nell&#39;armadio biosicurezza mentre Transwell plates sono affidate </li><li> Rimuovere eventuali bolle d&#39;aria nei pozzetti </li><li> Non disturbare lo strato di cellule con puntali se si cambia supporto o l&#39;esecuzione di letture Teer </li><li> Usare 200 microlitri media nel vano apicale; abbassare il volume potrebbe causare letture Teer instabili </li><li> Controllare la qualità dell&#39;elettrodo, levigatura delicatamente per rimuovere le proteine ​​accumulate dalla punta, e sostituire, se necessario, </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Ricerca guasti problemi che possono sorgere quando la coltura di Calu-3 celle in Transwells. Molteplici fattori contribuiscono alla polarizzazione pieno di Calu-3 celle in un liquido ricoperte di culture, la più probabile delle quali sono evidenziate in questa tabella.

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Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista dei Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K Views.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista dei Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l&#39;esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Mouse e umano-derivato cultura dello strato monomolecolare epiteliale gastrica primaria per lo studio della rigenerazione

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...