Yazarlar onu teknik yardım için Elisabeth Blanchard teşekkür etmek istiyorum. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Transwell Kültürleri Kullanım için Kültürleme Calu-3 Hücreler Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> Donmuş depolama hücreleri çözülme için: <ol><li> % 20 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, and10 mM HEPES pH 7.4 (EMEM-% 20 + S) içeren Minimum Essential Eagle Medium hazırlayın. 37 ile steril filtre hazırlanmış bir 0.2 um gözenek boyutlu bir filtre kullanılmak üzere, orta, ve bir su banyosu içinde sıcak ° C. In situ havayolu epitel ortam içinde daha fazla yansıtıcı olmak için, antibiyotikler veya antimiyotikler orta ile desteklenmiş değildir. </li><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla Calu-3 hücreleri (&lt;1 dk), bir donmuş cryovial çözülme. </li><li> 50 ml&#39;lik steril konik tüpe çözülmüş hücreleri aktarın ve ısıtılmış EMEM +% 20-S, 30 ml eklemek </li><li> 1,000-1,200 az 5 dakika süreyle santrifüj yoluyla topak hücrelere x g,soğutma olmadan ve düşük fren hızı ile. </li><li> Nazikçe süpernatant süzün ve yavaşça aşağı yukarı ve pipetleme ile ısıtılmış EMEM +% 20-S, 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tohum 2 ila 5 × 10 37 6-iyi doku kültürü plaka ve inkübe içine kuyu başına 6 hücre ° C, hücreler% 75 kadar hava atmosferinde% 7 CO 2 - 80% konfluent. Günlük olarak kontrol edin; 7 güne kadar gerekli olabilir. Her 3-4 günde hücrelerin medyumuyla aspire ve taze EMEM-% 20 + S. ile değiştirin </li></ol></li><li> : Altkültür hücreleri için <ol><li> Sıcak% 0.05 tripsin - 37 ° C su banyosunda% 0.02 EDTA. Fazla orta ve serum çıkarmak için% 0.02 EDTA - hücrelerin medyumuyla aspire ısıtılmış ve% 0.05 tripsin ile bir kere yıkayın hücrelerini. Yıkama çıkarın ve hücreler tripsin ısıtıldı kuyu başına 1 ml ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin ve bir mikroskop altında% 7 CO2 ve monitör hücrelerin en azından% 75 doku kültür plakasının da (lar) dan ayırmak kadar her 5 dak. Bu olabilir5 ila 30 dakika sürer. </li><li> Aşırı tripsin kaldırmak EMEM-% 20 + S hücreleri yıkayın. 50 ml&#39;lik steril konik tüpe hücreler tripsinize aktarın. Bir 6-kültür plakasının bir hücre Çoklu kuyular ve bir steril 50 ml konik bir tüp içine toplanmış olabilir. Soğutma olmaksızın 1,000-1,200 santrifüje edilerek EMEM-% 20 + S ve pelet hücreler 30 ml x g, ekleme, ve düşük fren hızı ile. </li><li> Yavaşça süpernatant Durusu ve hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve taze olarak EMEM-% 20 + S hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 80% birleşik - onlar 75 arasında olduğunda 1.2.7 adımlarda 1.2.5 açıklandığı gibi doku kültür kaplarına altkültür hücrelere devam hücreleri Trypsinize için yukarıda 1.2.3 adımları 1.2.1. </li><li> Yukarı 6-kuyulu plakanın iyi bir ikinci EMEM +% 20-S, 5 ml&#39;lik bir nihai hacim içinde bir T-25 cm2 şişeye Alt kültür, 0.5 ila 1 x 10 6 hücre / şişeye arasında tohumlama. </li><li> 5 ml kullanarak hücreleri, altkültür ayırmak için T-25 cm 2 balon başına tripsin ısındıbir T-25 cm2 şişeye yukarı bir ila EMEM +% 20-S, 10 ml&#39;lik bir nihai hacim içinde T-75 cm2 şişeye, tohum 5-1 arasında x 10 6 hücre / flask. </li><li> 8 ml Kullanımı 2 T-75 cm 2 şişeler içine bir T-75 cm 2 balon hücreleri, altkültür ayırmak için T-75 cm 2 balon başına tripsin ısındı. 3 yeni şişeler: Optimum hücre büyümesi için, alt kültür hücreleri 1 ebeveyn şişeyi daha büyük bir oranda T-75 cm 2 veya altkültür daha büyük ölçülü balona yok. </li></ol></li><li> Sonra hücreler ekilerek oylandı, tamamen kaldırmak ve% 75-90 izdiham ulaşıncaya kadar her 2 ila 3 gün orta değiştirin. Hücreler% 75-90 izdiham ulaşmak için 3 hafta kadar sürebilir. Polarize kültürler, alt kültür hücreleri bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyümeye öncesi optimal kuşak için. </li><li> Hücreleri yeterince tohum Transwell ekler istenilen sayıda büyüdü kadar altkültür hücreleri devam edin. Her Transwell insert 2 × 10 5 hücre gerektirir. Optimum performans polarize kültürler üretebilmek için, en fazla 10 altkültürler uğramıştır hücreleri kullanır. </li></ol> 2. Büyüyen Polarize Calu-3 Sıvı kaplı Kültürleri (LCC) Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> 37 EMEM bir su banyosu içinde% 10 FBS (EMEM-% 10) ihtiva eden ve sıcak hazırlanması ° C. </li><li> Tohumlama için 24-kuyu Transwell plaka hazırlayın. Steril forseps kullanarak, insert membran dokunmadan iç kısmından plakasının dış satırlara Transwell ekler taşıyın. Hücreler sadece plakanın dış satırlar üzerinde kuyu içine ekilerek olmalıdır. Bazolateral bölme içine hava kabarcıklarının girişini önlemek için, her bir bölme duvarına karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyuya orta serbest bırakarak, her biri için EMEM-% 10, 600 ul ilave edin. </li><li> T-75 cm 2 doku hücreleri ayırın. SubcuLTURE şişeler ısıtıldı tripsin kullanılarak, ve-EMEM +% 20, adım 1.2 &#39;de tanımlanan tripsinize hücreleri, her 2 şişeler başına S, 30 ml ile yıkanır. </li><li> İyice hafifçe aşağı yukarı ve pipetleme ile EMEM-% 10, 5 mL içinde yıkanmış hücrelerin tekrar süspansiyon. </li><li> Tripan mavi dışlama yöntemi ile uygulanabilir ve total hücre sayısı belirleyin. Yalnızca% 80 devam - 90% yaşayabilir. </li><li> 50 ml&#39;lik steril bir konik boru, 2&#39;lik bir konsantrasyonda x EMEM-% 10 ile 10 6 canlı hücre / ml &#39;ye sulandırın hücre. </li><li> Her Transwell ve apikal bölmeye hücreleri ekleyin. , Boşlukları, hücreleri olmadan EMEM-10% 100 ul ekleyin hücre içermeyen kontrol kuyuları, olacak kuyu A1 ve D1, için. Kalan kuyularının her biri için hafifçe uç duvarın iç kılavuz kanal karşı pipet olta ve yavaş yavaş salan hücreler, yeniden süspanse Calu-3 hücreler 100 ul ilave edin. Insert membrana pipet dokunmayın. Calu-3 hücrelerinin, homojen bir süspansiyon sağlamak için hafifçe ajite hücre süspansiyonuBu tohum çekilebilir. </li><li> 37 ° C ve% 7 hava atmosferde CO 2 de inkübe Transwell plakası. Fiziksel rahatsızlık minimal olacaktır küvözde plakayı. Polarizasyon verimliliğini artırmak için, birbirlerinin üstüne tabak yığmayın. </li><li> Polarize ve tamamen, deneylerinde kullanıma hazır olarak aşağıda 2.13 adımlarda 2.10 açıklandığı Transwells orta yerine kadar kültürleri korumak. Hücreleri tamamen polarize kadar Orta tamamen, önceki beslendikten sonra dördüncü ve sonra üçüncü gün arasında değişen bir döngü daha sonra üç gün Transwells içine ekilerek sonra değiştirilir, ve olmalıdır. </li><li> Sıcak EMEM-10 37 ile bir su banyosu içinde% ° C. </li><li> Yavaşça Transwell ekler orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml birinci her kuyudan apikal orta kaldırma sonra pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta taneli kuyulardan, ve ttavuk bütün kuyulardan bazolateral orta çıkarmadan. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın. </li><li> Pipet ucu kılavuz ucun yan kullanarak apikal bölmeye yönlendiren ortamı, daha sonra tohumlu kuyulara, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 apikal bölmeye EMEM-10% 200 ul ekle. Doğrudan hücreleri üzerine orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın. </li><li> Bazolateral bölmelere EMEM-% 10, 600 ul ekle. Bazolateral bölmeleri içine hava kabarcıkları girmesini önlemek için, her bölmenin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her biri orta ekleyin. </li></ol> 3. Calu-3 LCC Direnç Gelişimi Değerlendirilmesi Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> Trans-epitelyal elektrik Calu-3 direnci (Teer) sonra LCC 30 dk Değerlendirinorta değişiklikler; eğer istenirse değerlendirme her bir ortam değişikliği yapılabilir. Steril koşullar altında ölçüm yapın. Bazal ölçümler elde etmek için hücre içermeyen kontrol kuyuları A1 ve D1 (boşluklar) ile ölçümler başlayın ve her iyi için ölçümler ile devam edin. <ol><li> Steril koşullar altında, steril su içinde% 70 etanol ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne STX2 elektrot aktarmak ve 15 dakika sterilize edin. </li><li> Kalibre ve üreticinin talimatlarına göre kullanıma voltohmmeter sınayın. </li><li> Etanol, hava kurusu 5-10 sn elektrot çıkarın ve steril EMEM-% 10 ile elektrot durulayın. </li><li> DİRENÇ ayara voltohmmeter şekli anahtarını ayarlayın ve gücü AÇIK konuma getirin. </li><li> Bezin bir Transwell kültür bazolateral bölmesine erişim sağlayan 3 girişlerinden birine elektrot yerleştirin. Sıra elektrot yüzden artık kurşun yavaþca, dış kuyunun dibine dokunur ve dikey kalmasınıve kısa kurşun uç zar dokunmadan, apikal bölmesinin doku kültür ortamı içinde. </li><li> &quot;Tedbir R&quot; düğmesine basın ve stabilize etmek için okuma için bekleyin. Her kuyucuk için diğer 2 bağlantı noktaları için tekrarlayın ve her üç limanlarından, kuyu başına üç ölçümün toplam ölçümleri kaydetmek. Hücrelerin bütün kuyuları için direncini ölçmek için devam edin. </li><li> ,% 70 etanol içinde 5-10 dk iliklerine steril dH 2 O, durulama ve iyice kurutulması ile elektrot temizleyin. Orijinal ambalajında ​​saklayın. </li><li> Eşitlik 1 kullanılarak, her bir kuyunun dayanıklılığını hesaplayın. Ω fiili = Ω örnek - Ω boş, Denklem 1 Ω numune seribaşı iyi ve Ω boş gelen ortalama ölçüm nerede ekler ve orta içeren 2 kuyu, A1 ve D1 ortalama ölçüm, ancak hiçbir hücredir. </li><li> Denklemleri kullanılarak, birim alan direnç hesaplamation 2. Ω gerçek × efektif membran alanı = Ω × cm 2, Denklem 2 efektif membran alanı 24-kuyu Transwell uçlar için 0.33 cm 2 olduğu. </li></ol></li><li> Bu kutuplaşma esasına 02:59 Transwell kültürleri, apikal ve bazolateral bölmeleri arasında pasif sodyum fluorescein difüzyon ölçümü, ikinci bir tahlil yaparak tamamlandıktan doğrulayın. Sodyum fluoresein testi için kullanılan kuyu hemen tahlil tamamlanmasından sonra atılmalıdır. <ol><li> 4.75 mM KCl;; 2.53 mM CaCl 2 .2 H 2 O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 mM steril su içinde NaHCO 3; 0.45 mikron filtrasyon cihazı ile steril filtre (118 mM NaCl floresan olmayan tampon hazırlayın ). 4 ışıktan korunmalıdır ° C&#39;de floresan olmayan tampon, steril filtre, alüminyum folyo ile sarın, ve mağaza içinde 1 mg / ml sodyum fluorescein hazırlayın. Oda sıcaklıkları için SıcakKullanmadan önce yeniden. </li><li> Direnç ölçümleri tamamladıktan sonra, dikkatlice 02:59 bireysel Transwell kültürlerin bazolateral ve apikal bölümlerinde hem orta kaldırmak. </li><li> Transwell kültürleri durulayın. Yavaşça apikal bölmelere bazolateral bölmeleri ve 100 ul oda sıcaklığında steril D-PBS 600 ul oda sıcaklığında steril Dulbecco PBS (D-PBS) ekleyin. </li><li> Yavaşça kuyulardan D-PBS çıkarın. Bazolateral bölmelere 600 ul steril floresan olmayan tampon ekleyin. Apikal bölmelere 100 ul steril 1 mg / ml sodyum fluoresein ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plaka. CO2 kuluçka sırasında bu gerekli değildir. </li><li> İnkübasyon sırasında, sodyum floresein sulandırmak için floresan olmayan tampon kullanılarak, 20 ug / ml ve 0 ug / ml arasında değişen bir sodyum fluoresein standart bir eğri hazırlanır. En az 600 ul nihai hacim içinde sodyum fluoresein, en az 8 farklı konsantrasyonda, her hazırlayın. TutmakStandart eğri dilüsyonları absorbans ölçmek için hazır olana kadar ışıktan korunmalıdır. </li><li> Her bir test Transwell arasında bazolateral bölme Analiz için bir temiz tüpe floresan olmayan tampon numune aktarın. Plaka pasif sodyum fluorescein difüzyon incelemek ve atmak için kullanılan test Transwells çıkarın. Inkübatör kalan Transwells ile plaka dönün. </li><li> 96 çukurlu bir düz tabanlı plaka içine üç kopya halinde her bir standart çözelti 100 ul koyun. </li><li> Floresan olmayan tampon içinde her bir bazolateral numunenin üç dilüsyonları (1:2, 1:20 ve 1:50) hazırlanması, ve içine, iki kopya halinde her bir sulandırılmamış numune seyreltme ve her biri 100 ul ekle bir 96-gözlü düz alt plaka. </li><li> 486 nm veya 490 nm dalga boyunda ELISA plaka okuyucu Tedbir numune absorbansı. </li><li> Floresein st için sodyum absorbans değerleri karşı örneklerin absorbans karşılaştırarak bazolateral bölme içinde sodyum fluoresein konsantrasyonunun belirlenmesiandard eğrisi. </li></ol></li></ol> 4. Solunum Virüs ile birlikte polarize Calu-3 LCC Infecting Güvenlik Önlemleri: Virüs kullanılan uygun bir biyogüvenlik düzeyde steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. <ol><li> İstediğiniz inokulum 100 ul olurdu böylece serumsuz EMEM virüs seyreltin. </li><li> Serumsuz EMEM hücreleri yıkayın. Yavaşça o bazolateral orta apikal orta kaldırarak, tüm kuyulardan orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta, sonra ayrılmış kuyularda, her şeyden önce kuyusundan apikal orta kaldırma ve sonra kaldırma her kuyudan bazolateral ortamı. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın. <ol><li> T sonra hücre içermeyen kuyuları A1 ve D1 apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin veO seribaşı kuyuları, pipet rehberlik etmek ucun tarafı kullanılarak apikal bölmeye orta yönetmenlik. Doğrudan hücreler üzerinde orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın. </li><li> Bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekleyin. Bölmesinin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her Transwell orta ekleyin. </li><li> Yavaşça kuyulardan serum orta aspire. </li></ol></li><li> Bulaşmamış veya mock-enfekte kuyuları ile başlayarak, Transwells ve apikal bölmeye uygun olan virüs dilüsyon ekleyin. Bulaşmamış kuyuları, mock-enfekte kuyuları için, uygun Transwells ve apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin uygun Transwells arasında apikal bölmeye serumsuz EMEM seyreltilir virüssüz hazırlık 100 ul ekleyin ve için virüs enfeksiyonu, serum serbest EMEM virüs sulandırmak ve uygun Transwells ve apikal bölmelere 100 ul ekleyin. </li><li>Her bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekle. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin ve 2 saat boyunca% 7 CO2. </li><li> Sonra enfekte kuyulardan, ilk bulaşmamış ve mock-enfekte kuyulardan, kuyulardan orta aspire. Bazolateral süpernatantlar ardından ilk apikal süpernatantlar, çıkarın. </li><li> Apikal bölmeleri ve bazolateral bölümlerinde EMEM-% 10 ve 600 ul içinde EMEM-% 10 ile 200 ul ortam değiştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical care research and practice. 2010, (2010).</li><li>Mukherjee, M., Pritchard, D. I., Bosquillon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+air-interfaced+Calu-3+cell+layers+for+investigation+of+inhaled+drug+interactions+with+organic+cation+transporters+in+vitro.">Evaluation of air-interfaced Calu-3 cell layers for investigation of inhaled drug interactions with organic cation transporters in vitro.</a> International journal of pharmaceutics. 426, 7-14 (2012).</li><li>Baginski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+into+the+fate+of+inhaled+salmon+calcitonin+at+the+respiratory+epithelial+barrier.">Investigations into the fate of inhaled salmon calcitonin at the respiratory epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 29, 332-341 (2012).</li><li>Vllasaliu, D., Alexander, C., Garnett, M., Eaton, M., Stolnik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc-mediated+transport+of+nanoparticles+across+airway+epithelial+cell+layers.">Fc-mediated transport of nanoparticles across airway epithelial cell layers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. , (2011).</li><li>Vinhas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollen+proteases+compromise+the+airway+epithelial+barrier+through+degradation+of+transmembrane+adhesion+proteins+and+lung+bioactive+peptides.">Pollen proteases compromise the airway epithelial barrier through degradation of transmembrane adhesion proteins and lung bioactive peptides.</a> Allergy. 66, 1088-1098 (2011).</li><li>Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+Pharmaceutical+Aerosol+Deposition+Device+on+Cell+Cultures+(PADDOCC)+to+evaluate+pulmonary+drug+absorption+for+metered+dose+dry+powder+formulations.">A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e. 77, 132-138 (2011).</li><li>Huttunen, S., Toivanen, M., Arkko, S., Ruponen, M., Tikkanen-Kaukanen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+activity+of+wild+berry+juice+fractions+against+Streptococcus+pneumoniae+binding+to+human+bronchial+cells.">Inhibition activity of wild berry juice fractions against Streptococcus pneumoniae binding to human bronchial cells.</a> Phytotherapy research: PTR. 25, 122-127 (2011).</li><li>Elm, C., Rohde, M., Vaerman, J. P., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interaction+of+the+pneumococcal+surface+protein+SpsA+with+the+human+polymeric+immunoglobulin+receptor+(hpIgR).">Characterization of the interaction of the pneumococcal surface protein SpsA with the human polymeric immunoglobulin receptor (hpIgR).</a> The Indian journal of medical research. 119, 61-65 (2004).</li><li>Sutherland, T. C., Quattroni, P., Exley, R. M., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+passage+of+Neisseria+meningitidis+across+a+polarized+respiratory+epithelium.">Transcellular passage of Neisseria meningitidis across a polarized respiratory epithelium.</a> Infection and immunity. 78, 3832-3847 (2010).</li><li>Grantham, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+of+the+influenza+A+virus+M2+protein+is+not+required+for+virus+replication+in+vitro+but+contributes+to+virus+virulence.">Palmitoylation of the influenza A virus M2 protein is not required for virus replication in vitro but contributes to virus virulence.</a> Journal of. 83, 8655-8661 (2009).</li><li>Saedisomeolia, A., Wood, L. G., Garg, M. L., Gibson, P. G., Wark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lycopene+enrichment+of+cultured+airway+epithelial+cells+decreases+the+inflammation+induced+by+rhinovirus+infection+and+lipopolysaccharide.">Lycopene enrichment of cultured airway epithelial cells decreases the inflammation induced by rhinovirus infection and lipopolysaccharide.</a> The Journal of nutritional biochemistry. 20, 577-585 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., Hill, T., Li, K., Peters, C. J., Tseng, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+(SARS)+coronavirus-induced+lung+epithelial+cytokines+exacerbate+SARS+pathogenesis+by+modulating+intrinsic+functions+of+monocyte-derived+macrophages+and+dendritic+cells.">Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus-induced lung epithelial cytokines exacerbate SARS pathogenesis by modulating intrinsic functions of monocyte-derived macrophages and dendritic cells.</a> Journal of virology. 83, 3039-3048 (2009).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+innate+immune+responses+of+human+bronchial+epithelial+cells+to+severe+acute+respiratory+syndrome-associated+coronavirus+infection.">Dynamic innate immune responses of human bronchial epithelial cells to severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection.</a> PloS one. 5, e8729 (2010).</li><li>Hsu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+constitutive+type+I+interferon+response+in+bronchial+epithelial+cell+to+influenza+infection.">Critical role of constitutive type I interferon response in bronchial epithelial cell to influenza infection.</a> PloS one. 7, e32947 (2012).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of virological methods. 174, 144-149 (2011).</li><li>Zhang, L., Peeples, M. E., Boucher, R. C., Collins, P. L., Pickles, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+infection+of+human+airway+epithelial+cells+is+polarized,+specific+to+ciliated+cells,+and+without+obvious+cytopathology.">Respiratory syncytial virus infection of human airway epithelial cells is polarized, specific to ciliated cells, and without obvious cytopathology.</a> Journal of virology. 76, 5654-5666 (2002).</li><li>Geys, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+the+pulmonary+translocation+of+nanoparticles:+a+preliminary+study.">In vitro study of the pulmonary translocation of nanoparticles: a preliminary study.</a> Toxicology letters. 160, 218-226 (2006).</li><li>Geys, J., Nemery, B., Hoet, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Transwell ekler Calu-3 LCC oluştururken, hücrelerin hiç kutuplaştırma olabilir, veya tam olarak polarize etmek değil, gibi bir Teer tarafından tanımlanan ≥ 1000 Ω x 2 cm ve apikal ve bazolateral bölmeleri arasındaki ≤% 1 sodyum fluoresein boyası dengeleme. Buna ek olarak, LCC içinde Calu-3 hücreleri tam kutuplaştırma olabilir, fakat Teer ölçümler arasında tutarsız olabilir. Calu-3 LCC Teer ölçümlerinde dalgalanmalar, günlük normal olmasına rağmen kültür, doğal olarak az 5 hafta veya sürece 12 hafta olabilecek, yaşla birlikte azalır kadar Teer kez tamamen polarize, dramatik değişim beklenmemektedir tohumlama sonrası. Polarize Calu-3 LCC yeteneği hücreler hazırlanmış ve Transwell sistem içinde kullanım öncesinde pasajlandı nasıl kısmen bağlıdır. Alt kültür sırasında bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyüdü Hücreler, dondurulmuş stoktan fazla 10 kat ekilerek oylandı, ya da değil kidüzenli olarak taze besiyeri ile birlikte en tam kutuplaştırmaya az olasıdır, ve herhangi bir polarizasyon hızla düşecek. Polarizasyon Eksik veya toplam eksikliği de malzeme ve Calu-3 LCC için kullanılan Transwells gözenek boyutu varyasyon atfedilen olabilir, ve benzeri kompozisyon ve gözenek büyüklüğüne Transwells içinde sürü-için-çok varyasyon ayrıca polarizasyon etkileyebilir. Latacağız Calu-3 polarize gelen kültürü korumak, bazolateral bölmeye Transwell zarından büyümesine izin verebilirsiniz. Kutuplaşma olmayışı da bakteriyel büyüme nedeniyle olabilir, Calu-3 hücreleri arasındaki sıkı bağlantıları müteakip parçalanmasına yol bulutlu kültür ortamı ile gösterilir. Calu-3 LCC değişken Teer ölçümleri Calu-3 LCC hücre mono tabakaları, insert, ya da levha kendileri mekanik kesintileri neden olabilir. Orta değişiklikler ve Teer ölçümleri pipet uçları veya elektro olmadan yapılmalıdırde hücrelerin temas yol açar. Bu işlemleri gerçekleştirirken, bakım direnci tespit voltohmmeter yeteneği bozacak apikal ve bazolateral bölmeleri, içine hava kabarcıkları tanıtmak önlemek için alınmalıdır. Aslında kutuplaşmış bir kültürde direniş tespit voltohmmeter yeteneği de elektrot kablolarında protein birikmesi ile sınırlı olabilir. Bu birikme nazik zımpara ile kaldırılabilir veya elektrot değiştirerek düzeltilebilir. Bir kez Calu-3 LCC tamamen polarize ve Teer artık artmaktadır, Calu-3 LCC solunum yolu enfeksiyonuna konak akciğer epitel hücre yanıtlarını karakterize etmek için bir in vitro model olarak kullanılmak için hazır. Bu sistem Calu-3 LCC bei ek avantajlarıyla birlikte, geleneksel olarak bu tür A549 ve HEp-2 hücreleri gibi solunum patojenleri incelemek için kullanılan tek tabaka-kültürlü akciğer hücre hatları ile karşılaştırıldığında patojenlere yönlü tepkilerin iyi karekterinigeliştirmek için ng daha hızlı, daha kolay elde edilebilir ve primer, kutuplaşmış, farklılaştırılmış NHBE daha üretmek için daha az pahalı. NHBE benzer polarize Calu-3 sıkı kavşak oluşumu göstermek ve müsin üretirler. Ancak, NHBE aksine, polarize Calu-3 hücreleri bazal hücreler ve kirpikli kolumnar epitel hücrelerinin katmanlarına ayrım yoktur, ve birkaç polarize Calu-3 hücreleri kirpikler şeklinde çıkıntılar 19 gelişir. Solunum hakaret havayolu epitel hücrelerinin polarize tepkilerin test için yararlı rağmen Böylece, polarize Calu-3 LCC solunum hakaret veya yaralanmaya yanıt olarak hava yolu geliştirme veya yeniden incelemek için ideal bir model değil. In vitro olarak kültür hücreleri, mukus üretimini hücresel enfektivite yanı sıra, bir polarize modelinde bulaşıcı virüs yayılması ve virüs salınması ve polarize Calu-3 LCC ve polarize, farklılaşmış NHBE rapor edilmemiştir arasında mukus üretiminin doğrudan karşılaştırma etkileyebilir . A549 ve HEp-2 hücreleriCalu-3 hücreleri daha kültürüne kolay yeniden, ancak, Transwell ekler üzerinde büyüdüğü zaman Calu-3 LCC aksine, onlar polarize kültürleri kurmazlar, ve böylece ideal değil modelleri solunum virüs enfeksiyonu, in vitro polarize epitel hücrelerinin yanıtları inceleyerek içindir .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAKTİFLER </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin -% 0.02 EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle Minimum Essential Medium (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Isı inaktive, 56 ° C, 30 dakika </td></tr><tr><td> 100X olmayan esansiyel amino asitler (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Karanlıkta 4 ° C&#39;de depolayın </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-% 10 FBS (EMEM% 10) </td><td></td><td></td><td> Steril-filtre, serum% 10 ısı-inaktif FBS ile EMEM Ek </td></tr><tr><td> EMEM-% 20 FBS + takviyeleri (EMEM-% 20 + S) </td><td></td><td></td><td> ; 1X amino asitler, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, steril-filtre ısı-inaktif FBS,% 20: son konsantrasyonları için EMEM Ek </td></tr><tr><td> 24-iyi Transwell plakaları </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 mikron gözenek boyutu, polyester </td></tr><tr><td> Tripan mavisi </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Steril dH 2 O kullanarak% 70 hazırlayın </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Sigara floresan tampon </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2 × H 2 O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH 2 PO 4, steril su içinde 25 mM NaHCO 3; steril filtre </td></tr><tr><td> Sodyum floresein </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> Steril olmayan floresan tamponu içinde 1 mg / ml steril filtre, ışıktan korumak; 4 mağaza ° C 6 aya kadar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EKİPMAN </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 elektrot </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA plaka okuyucu </td><td></td><td></td><td> A 486 veya A 490 ölçebilen </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

Havayolu epitel hücrelerinin apikal ve bazolateral yüzeyler in vivo patojen maruziyeti yönlü tepkiler göstermektedir. Böylece, apikal ve bazolateral yüzeyler oluşturarak, Polarize solunum patojenlere hücresel cevaplarının incelenmesi için in vitro modeller idealdir. Böyle bir modelin normal insan bronşiyal epitel hücreleri (NHBE) farklılaşıyor. Ancak, bu sistem izole akciğer doku örnekleri, uzmanlık ve doku kültürü epitel hücreleri, ve bir hava-sıvı arayüzü kültürü oluşturmak için zaman gerektirir. Bir insan bronşiyal adenokarsinom türetilen Calu-3 hücreleri, solunum hakaret 1, farmakolojik bileşikler 2-6 proksimal hava yolu epitel hücrelerinin tepkisi inceleyerek ve bakteriyel 7-9 ve viral patojenler, grip virüsü, rinovirüs dahil olmak için alternatif bir model olarak ve şiddetli akut solunum sendromu - ilişkili koronavirüs 10-14. Son zamanlarda, wE Calu-3 hücreleri NHBE 15,16 ile tutarlı bir şekilde solunum sinsityal virüs (RSV) enfeksiyona duyarlı olduğu gösterilmiştir. Burada, ayrıntılı büyüyen ve kültür Calu-3 hücreleri LCC içine kültüre oylandı hücreleri korumak teknik detayları üzerinde duruluyor Calu-3 hücre polarize, sıvı kaplı kültürü (LCC), kurulması ve biz sunuyoruz polarize Calu-3 hücrelerinin solunum virüsü enfeksiyonu gerçekleştirmek için yöntem. Sürekli polarize Calu-3 LCC, Calu-3 hücreleri dikkatli Transwell ekler kültürleme önce pasajlandı yapmalısınız edinin. Hazır Calu-3 tek tabaka kültürleri,% 90 izdiham altında kalmalı dondurulmuş stok az 10 kez pasajlandı edilmeli ve düzenli olarak taze ortam ile sağlanmalıdır. Bir kez Transwells kültüre, Calu-3 LCC dikkatle ele alınması gerekir. Düzensiz ortam değişiklikleri ve hücre katmanları veya levhaların mekanik veya fiziksel bozulma olumsuz için polarizasyon etkisibirkaç saat veya gün. Polarizasyon trans-epitelyal elektriksel direnç (Teer) değerlendirilerek izlenir ve apikal ve bazolateral bölmeleri 17,18 arasında sodyum fluoresein pasif dengeleme değerlendirerek doğrulanır. Ω × cm 2 veya 1,000 Yukarıdaki kez Teer yaylaları, Calu-3 LCC solunum patojenlere hücresel yanıtları incelemek için kullanıma hazırdır.

Şekil 1, farklı apikal ve bazolateral yüzeylerinin geliştirilmesi polarize Calu-3 hücreleri, gösterildiği gibi, Transwell kültür sistemleri içinde sıvı kaplı kültürler (LCC) olarak büyümüş zaman. Yöntem sonra burada açıklandığı gibi, Calu-3 LCC, trans-epitelyal elektrik rezistansı (Teer) tohumlama sonraki 3 hafta içinde Ω x cm 2 ya da 1.000 &#39;üzerinde bir plato, Şekil 2&#39; de gösterildiği üzere bir örnek ulaşır. Polarize hücreleri arasında oluşan sıkı kavşaklar apikal ve bazolateral bölmeler arasındaki küçük moleküllerin pasif dengeleme engeller. Bu nedenle, bir değiştirilmiş sodyum fluoresein dengeleme tahlil Calu-3 LCC 15,17,18 polarizasyon doğrulamak için kullanılır. LCC artar Calu-3 hücre mono tabakaları Teer olarak, pasif bazolateral bölmesine equilibrates floresan miktarı azalır. Teer 1.000 Ω cm x 2, equilibrates floresan miktarı kezbazolateral bölmesine olarak Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi ≤% 1, bu nedenle, Calu-3 LCC Teer ≥ 1000 Ω cm x 2 iken tam olarak polarize edilmiş olarak kabul edilir. Calu-3 LCC pik Teer ölçüm deneyden deneye değişebilir. Ancak, herhangi bir deney için bir kere Teer değerleri plato, tam polarize, enfekte olmamış Calu-3 LCC 12 hafta sonrası tohumlama ile 5 arasındaki için kararlı olabilirler. Transwell kültürlü Calu-3 direnç gelişme olmaması Tablo 1&#39;de özetlendiği gibi çeşitli faktörler neden olabilir. Ω × cm 2 veya 1,000 Yukarıda Calu-3 LCC platolar Teer, modeli incelemek için kullanılmaya hazır olduğunu bir kez respiratuvar sinsityal virüs (RSV) dahil solunum patojenlere hava yolu epitel hücre yanıtlarının. Hücrelerin bir mock-enfeksiyonu (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında polarize kültür bütünlüğü içinde daha hızlı bir düşüş RSV sonuçları Poz. Şekil 1. Transwell-kültür hücrelerinin kesiti temsil. Hücreleri ekleme membran apikal yüzeyinde yetiştirilmektedir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Şekil 2. Trans-epitelyal elektriksel direnç (Teer) ve Transwell ekler tohumlama sonrası Calu-3 hücrelerinin polarizasyon Gelişimi. Her zaman noktasında, Teer ortanca Ω x cm 2 olarak sunulan bir temsilci deneyden 32 bağımsız kuyuların ± SEM. <img alt="Şekil 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Şekil 3,. Pasif equili<html> hücreleri gibi polarize olur Calu-3 hücre mono tabakaları bazolateral bölmesine sodyum fluoresein ration inhibe edilir. dört bağımsız deneyin kümülatif veri sunulmuştur. Her veri noktası tek bir ölçüm temsil eder. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Şekil 4. Polarize Calu-3 LCC RSV enfeksiyonu tek tabaka bütünlüğü bir düşüş hızlanır. Polarize Calu-3 hücreleri 0. gün bir İçişleri Bakanlığı = 1 RSV-A2 ile enfekte edildi ve polarite 8 hafta sonrası enfeksiyon yönünden takip edildi. Bir temsilci deneme gösterilir. Veri infeksiyon başına 8 bağımsız kuyuları ± SEM zaman noktası başına medyan direnç olarak sunulmaktadır. * P olarak Student t-testi ile tespit mock-ve RSV-A2-enfekte kültürler arasındaki &lt;0.05. yolları &quot;&gt; <tbody><tr><td> Konu </td><td> Çözünürlük (ler) </td></tr><tr><td> Direnç ölçülebilir değildir </td><td><ul><li> Kuyularda herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın </li><li> Dondurulmuş stok daha az 10 kez pasajlandı oylandı Calu-3 hücreleri kullan </li><li> Calu-3 hücre monolayer altkültür% 100 izdiham ulaşmasına izin vermeyin </li><li> Hücreler (ucun gözenekler aracılığıyla büyümüş olabileceğini belirten) sıra insert altında plastik üzerinde büyüyen olmadığını kontrol edin </li><li> Tam direnç gelişimi için 2-3 hafta sonrası tohumlama izin ver </li><li> Değiştirmek, kullanılan ekler kompozisyon ve gözenek boyutu kontrol edin, gerekiyorsa (önerilen polyester insert, 0,3 mikron gözenek boyutu, hayır kaplamalar, ayrıntılar için malzemeler bakınız) </li><li> Ucundan biriken proteinler kaldırmak için hafifçe zımpara ve gerekirse değiştirilmesi, elektrodun kalitesini kontrol edin </li><li> Bakteriyel büyüme için orta kontrol </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Direnç geliştirir, ama tam polarizasyon (≥ 1.000 Ω × cm 2) elde edilememesi </td><td><ul><li> Geliştirmek için polarizasyon (bazen 4 hafta kadar sürebilir) için ek süre tanıyınız </li><li> Dondurulmuş stok daha az 10 kez pasajlandı oylandı Calu-3 hücreleri kullan </li><li> Calu-3 hücre monolayer altkültür% 100 izdiham ulaşmasına izin vermeyin </li><li> Sürekli önceki beslendikten sonra ardından üçüncü ve dördüncü gün arasında değişen, Transwell kültürlerde orta yerine </li><li> Plakaların dış sıra halinde yerleştirilen uçları üzerinde sadece kültür hücreleri </li><li> Transwell ekler farklı bir sürü kullanın </li></ul></td></tr><tr><td> Hücreler tamamen polarize, ancak direnç bir okuma diğerine tutarlı değil </td><td><ul><li> Bozabilir veya inkübatör plakaları yığmayın </li><li> Biyogüvenlik kabininde titreşime sebep yok iken Transwell plates ele alındığını </li><li> Kuyularda herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın </li><li> Ortam değiştirme veya Teer okumaları yapan pipet uçları ile hücre tabakası rahatsız etmeyin </li><li> Apikal bölmeye 200 ul ortamı kullanın; düşük ses dengesiz Teer okumalara neden olabilir </li><li> , Elektrodun kalitesini kontrol ucundan biriken proteinler kaldırmak için hafifçe zımpara ve gerekirse değiştirin </li></ul></td></tr></tbody></table> Transwells içinde zaman kültür Calu-3 hücreleri oluşabilir Tablo 1. Sorun giderme sorunları. Çoklu faktörler sıvı kaplı kültürleri, bu tabloda ortaya koyan en muhtemel olarak Calu-3 hücreleri dolu kutuplaşmaya katkıda bulunur.

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro at JoVE.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri görüşlerini temsil etmemektedir.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

establishing-liquid-covered-culture-polarized-human-airway-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K Görüntüleme.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri görüşlerini temsil etmemektedir.

Video: Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Fare ve insan elde edilen birincil Gastrik epitel Monolayer kültür yenilenme çalışmaları için

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...