Este trabajo fue financiado por la Universidad de Virginia y el Fideicomiso Jeffress Memorial (J-971). Damos las gracias a L. Colón, Jain K., y Randolph P. útil para los debates y lectura crítica del manuscrito.

1. Ensayo de Benedicto XVI para la reducción de azúcares <ol><li> Preparar una cantidad apropiada de reactivo de Benedict - 940 mM de carbonato de sodio anhidro, 588 mM de sodio dihidrato de citrato, 68 mM de cobre (II) pentahidrato de sulfato. Este reactivo puede almacenarse a temperatura ambiente (RT) durante al menos seis meses sin ningún cambio notable en la reactividad. </li><li> El reactivo anterior es 6x. Así, para 600 reacciones mu l, añadir 100 l de reactivo de Benedict a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml (por ejemplo, Eppendorf marca), por muestra a ensayar. </li><li> Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo, el volumen óptimo se puede determinar basándose en la intensidad de formación de color en un periodo de prueba inicial. Si la muestra se dispone de suficiente entonces comenzar tales ensayos en el volumen de muestra máximo posible (es decir, las cinco sextas partes del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso), y luego se diluye en los ensayos posteriores. </li><li> Añadir ddH 2 O para el tuser para llevar el volumen final a 600 l; mezclar la solución por agitación o pipeteo. </li><li> Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo. </li><li> Retirar la muestra calentada del baño y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar el tubo de muestra en&gt; 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos. </li><li> Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia. </li><li> Ponga el espectrofotómetro UV-vis con agua. </li><li> Medir la absorbancia de la muestra a 475 nm. </li></ol> 2. Ensayo orcinol Bial para pentosas <ol><li> Preparar una cantidad adecuada de reactivo fresco de Bial - 24,2 mM monohidrato de orcinol (véase la figura 2b para la estructura de este compuesto), 6 M de HCl, 0,025% w / v cloruro férrico hexahidratado Nota.:Para un almacenamiento prolongado, el reactivo Bial se pueden preparar como dos soluciones madre por separado: (i) del Reactivo A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O en HCl concentrado] y (ii) Reactivo B [422 mM de monohidrato de orcinol preparado en 95 % de etanol]. El reactivo A se puede almacenar a temperatura ambiente durante seis meses; Reactivo B se puede almacenar a 4 ° C durante un mes, cubierto con papel de aluminio para limitar la exposición de la luz. Estas soluciones madre se mezclaron en un 15 (A): 1 (B) proporción v / v antes de su uso. </li><li> El reactivo anterior es 2x. Así, por 1,0 reacciones ml, añadir 500 l de reactivo de Bial a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, por cada muestra a ensayar. </li><li> Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo. Según nota 1,3 (arriba), si se dispone de suficiente muestra a continuación, iniciar reacciones del ensayo mediante el volumen máximo posible de la muestra (es decir, la mitad del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso) y se diluye a partir de ahí. </li><li> Añadir ddH 2 O al tubo para llevar el final volumen a 1,0 ml, mezclar la solución por agitación o pipeteo. </li><li> Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo. </li><li> Retirar la muestra calentada del baño y dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar el tubo de muestra en&gt; 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos. </li><li> Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia para la inspección visual. </li><li> Para el análisis semicuantitativo, en blanco el espectrofotómetro UV-vis con agua y se mide la absorbancia de la muestra de celda a 660 nm. </li></ol> 3. Ensayo Dische de difenilamina para 2&#39;-desoxipentosa Azúcares <ol><li> Preparar una cantidad adecuada de reactivo Dische de difenilamina - 60 mM difenilamina, 11 M de ácido acético glacial, 179 mM de ácido sulfúrico, 62% v / v de etanol. Este reactivo puede ser preen comparación con antelación y se almacena a temperatura ambiente en un recipiente oscuro, o cubierto con papel de aluminio, para limitar la exposición a la luz. Debido a la sensibilidad a la luz que el reactivo no se deben almacenar indefinidamente, aunque en la práctica puede ser preparado cada dos a tres meses sin cambio aparente en la reactividad. </li><li> El reactivo anterior es 2x. Así, por 1,0 reacciones ml, añadir 500 l de reactivo de Dische a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml, por cada muestra a ensayar. </li><li> Añadir cualquier lugar de 10 l a 500 l de muestra a este tubo. Según nota 1,3 (arriba), si se dispone de suficiente muestra a continuación, iniciar reacciones del ensayo mediante el volumen máximo posible de la muestra (es decir, la mitad del volumen total de la reacción, 500 l de muestra en este caso) y se diluye a partir de ahí. </li><li> Añadir ddH 2 O al tubo para llevar el volumen final a 1,0 ml, mezclar la solución por agitación o pipeteo. </li><li> Se incuban las muestras durante 20 min en un baño de agua hirviendo. </li><li> Retire la muestra caliente de la bañera y la asignaciónw que se enfríe a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar el tubo de muestra en&gt; 9.300 xg (~ 10.000 rpm en un FA45-24-11 Eppendorf rotor de ángulo fijo) durante 5 min para sedimentar cualquier material en partículas; Este paso es más importante para los estudios cuantitativos y no cualitativos. </li><li> Alícuota del sobrenadante de este tubo en una cubeta limpia para la inspección visual. </li><li> Para el análisis semicuantitativo, en blanco el espectrofotómetro UV-vis con agua y se mide la absorbancia de la muestra de celda a 600 nm. </li></ol> 4. Otras indicaciones de uso <ol><li> Las siguientes clases de moléculas son compuestos de referencia adecuados para reacciones de control positivas y negativas para cada ensayo: <ul><li> Benedicto XVI - Positivo = libre ribosa, fructosa, glucosa, Negativo = ARN, ADN, ATP, etc. (Cualquier sacárido carece de una funcionalidad sin azúcares reductores) </li><li> Bial - Positivo = ARN (por ejemplo, extracto de levadura de panadero), la ribosa, ATP, UMP, negativo = bovina serviciosum albúmina (BSA) o cualquier otra proteína </li><li> Dische de - Positivo = ADN (por ejemplo, de timo de ternera), negativo = ARN, ATP, etc. (Cualquier nucleótido no-2&#39;-desoxigenada) </li></ul></li><li> Estos ensayos se han encontrado para ser bastante resistentes a los compuestos a menudo utilizados en la purificación de proteínas, por ejemplo, sales comunes, tales como NaCl, (NH 4) 2 SO 4, y K 2 SO 4 no interfieren, y las reacciones aparecen generalmente no afectados por el contenido del diluyente. Detergentes o agentes caotrópicos, tales como urea pueden afectar a la reactividad de los ensayos si el pH es altamente básico; un neutro a intervalo de pH ácido es generalmente más óptima para la de Bial y ensayos Dische a causa de la química de la reacción subyacente (ver el texto y los protones de los en la Figura 2b, c). Potencialmente subóptimas condiciones de reacción, interferentes sospechosos, etc. debe ser probado en una base de caso por caso, con control positivo y negativo experimentos with compuestos de referencia. </li></ol>

<ol>
	<li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms.">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids.">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Ausubel, F. 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Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars.">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP.">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li><li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+protein+assay+techniques.">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. 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No hay conflictos de interés declarado.

<html> Los ensayos colorimétricos se presenta aquí ofrecer un enfoque sencillo para evaluar rápidamente la naturaleza química de las mezclas de biomoléculas, tales como se encuentran cuando la purificación de proteínas, ARN o complejos de lisado de células enteras en preparación para estudios posteriores. Como la biología estructural persigue asambleas más similar a la nativa, los retos cada vez mayores, como la heterogeneidad de la muestra, se plantean los complejos complicados y multi-componente. Supramolecu...

Gran parte de la biología celular se produce a través de interacciones moleculares que interviene el ADN y el ARN. 4 Estos ácidos nucleicos de origen natural (AN) interactúan entre sí, con las proteínas, 5 y 6 con una serie de compuestos de pequeñas moléculas y ligandos in vivo (por ejemplo, cationes divalentes 7). Las interacciones pueden ser de corta o de larga duración (cinéticamente), puede variar de alta a moderada a baja afinidad (fuerza termodinámica), y también pueden mostrar una variación sustancial en las propiedades químicas y la especificidad - algunas asociaciones son muy específicas (por ejemplo, ADN · · · los factores de transcripción, ARN · · · los factores de empalme), mientras que otras interacciones son necesariamente mucho más genérico (por ejemplo, el ADN · · · bacterianas histona-como las proteínas HU 8). Interacciones no específicas con AN pueden tener consecuencias prácticas para los experimentos in vitro de mezclas de Biomolecules, ya que es posible, e incluso probable, que algunos AEs se asociará con las biomoléculas de interés, al menos en algún subconjunto de las condiciones experimentales que se utilizan (fuerza iónica, pH de la solución, etc.) Consideremos, por ejemplo, la producción de una proteína de interés (POI) a través de la sobre expresión heteróloga de la proteína recombinante en cultivo de células de Escherichia coli; tal procedimiento se realiza rutinariamente en prácticamente cualquier laboratorio de biología estructural 9 En la preparación para experimentos adicionales, tales. como caracterización bioquímica / biofísica, cristalización, etc., los esfuerzos iniciales se centran generalmente en la obtención de una cantidad suficiente de la PDI en una forma tan pura como sea posible, idealmente como un espécimen químicamente homogénea y monodispersas biofísicamente. Después de la interrupción de las células huésped, las primeras etapas de purificación de un flujo de trabajo típico para aislar el objetivo de PDI de E. coli proteínas, ácidos nucleicos, restos de pared celular,y otros componentes del lisado celular. Sin embargo, host NAS puede co-purificar con el POI por varias razones fisicoquímicas - un PDI altamente básica puede no específicamente desplegable anfitrión de ADN / ARN, el POI puede tener un genérico NA actividad de unión (por ejemplo, el antes mencionado HU); el POI puede ser un bastante específico NA-proteína de unión, pero presentan reactividad cruzada con los ARN o ADN de acogida; anfitrión AN puede interactuar con una matriz de cromatografía y por lo tanto simplemente co-eluir con la PDI, y así sucesivamente. Indiscriminada, de alta afinidad de unión de anfitrión NAS a un POI puede plantear un problema molesto ya que las impurezas NA es probable que interferir con los experimentos posteriores (por ejemplo, ensayos de fluorescencia de anisotropía de POI unión • ARN 10). Alternativamente, el PDI no anticipado · · · asociaciones NA también puede ser visto por casualidad, como tales interacciones iluminar el PDI ácido nucleico capacidad de unión. De cualquier manera, si AN son componentes claves o contaminantes, primero hay que cuantificar yidentificar el tipo (ADN, ARN) de AN co-purificación en preparación para experimentos posteriores. Varios existen métodos analíticos para la detección y cuantificación de AN en una muestra. La mayoría de los métodos disponibles son fundamentalmente ya sea espectrofotométrico (por ejemplo, A 260 y A valores de absorbancia 260 / A 280 coeficientes), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tiazol naranja u otros colorantes fluorescentes a NA), o colorimétrico (susceptibilidad de nucleósidos para reacciones químicas que cromóforos absorbentes de rendimiento en la región UV-Vis del espectro electromagnético), como se describió recientemente por De Mey et al. 1 Sin embargo, el paso crucial de identificar el tipo de polinucleótido como ARN o ADN está más allá del alcance de muchos de estos cuantificación enfoques. Aquí se proporciona un conjunto de ensayos colorimétricos para identificar rápidamente los tipos de componentes de NA en una muestra proteica. Los protocolos descritos aquí cun ser ejecutados eficientemente sin etapas adicionales de aislamiento de las posibles impurezas de NA, y se basan en el ensayo de Benedict para azúcares reductores 11, el ensayo de orcinol para pentosas 12,13, 14,15 y reacciones de difenilamina de 2&#39;-deoxypentoses (Figuras 1 y 2) . Prueba de la Benedict (Figura 2a) utiliza la capacidad de la forma lineal, de cadena abierta (aldehído) de un azúcar aldosa para reducir Cu 2 +, con la oxidación concomitante de carbonilo del azúcar a un resto carboxilato y producción de Cu 2 O como un precipitado de color rojo insoluble. Esta reacción tendrá un resultado positivo con libres de azúcares reductores tales como aldosas y cetosas (que se convierten en las aldosas correspondientes a través de productos intermedios enediol), pero no con los azúcares de pentosa que están bloqueados en forma cíclica como parte del esqueleto covalente de un ADN o polinucleótido de ARN. Debido a la exigencia minimalista de una funcionalidad hemiacetal libre, co otrompounds que podrían dan positivo en este ensayo - y por lo tanto actuar como interferentes potenciales - incluyen α-hidroxi-cetonas y oligosacáridos cortos (por ejemplo, el disacárido maltosa). Tanto el de Bial orcinol (Figura 2b) y difenilamina Dische (Figura 2c), las reacciones se basan en la destrucción inicial de la columna vertebral de polinucleótido, a través de la despurinización del nucleósido y ácido-o adicionalmente catalizada por base hidrólisis de los nucleótidos matrices, para dar furano-2 -carbaldehído (furfural) derivados; estos derivados luego reaccionar ya sea con un polihidroxi fenol tal como orcinol (Bial) o difenilamina (Dische de) los reactivos para formar productos coloreados de condensación de estructura química en gran medida desconocido. El ADN frente a la especificidad de ARN de ensayo de la Dische se deriva del hecho de que el azúcar pentosa debe ser 2&#39;-desoxigenado con el fin de ser susceptible a la oxidación a ω-hydroxylevulinyl aldehído, que además reacciona con difenilaminaen condiciones ácidas para producir un color azul brillante de condensado (Figura 2c). Utilizando los protocolos simplificados descritos aquí, se ha encontrado que estas reacciones colorimétricas específicas de azúcar puede diferenciar entre ARN y ADN, y también indican la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa, ribosa o en una muestra biomolecular.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo o equipo </td><td> Proveedor / empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios, notas </td></tr><tr><td> Carbonato de sodio anhidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio dihidrato de citrato </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Cobre (II) sulfato pentahidratado </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Monohidrato de orcinol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> HCl concentrado </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de hierro hexahidratado </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Difenilamina </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribosa </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep a 1% w / v en H 2 O </td></tr><tr><td> El ácido ribonucleico de levadura (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> prep a 10 mg / ml en H 2 O; almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> El ácido desoxirribonucleico (sal de sodio), a partir de timo de ternera </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> prep a 10 mg / ml en H 2 O; almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Los reactivos, equipos y Seguridad Los materiales se enumeran en la foguientes tabla en el orden en que aparecen en la sección de Protocolo. A menos que se indique lo contrario (arriba), todos los reactivos pueden almacenarse a temperatura ambiente y la iluminación. Para cualquier artículo no se enumeran a continuación (por ejemplo, tubos de microcentrífuga), la marca habitual / modelo / variedad que se encuentra en un laboratorio de bioquímica estándar se puede utilizar (por ejemplo, Eppendorf de 1,5 ml marca tubos de microfuga). Estándar tubos de microcentrífuga de plástico se debe utilizar para los pasos que implican centrifugación (por ejemplo, para material de sedimento de partículas cerca del final de cada protocolo). Ningún material en particular es preferible, siempre y cuando los tubos puede ser sellada; los tubos de polipropileno típicos que se encuentran en los laboratorios de bioquímica funcionan bien. En cuanto a las preocupaciones de seguridad y eliminación de residuos, las precauciones estándar de laboratorio (gafas de seguridad, campanas de extracción) debe ser ejercida de pre-parar, trabajando, y disponer de soluciones que contienen concentrado acético, clorhídrico o sulfúrico. Para los reactivos orgánicos como orcinol o difteriaenilamina, guantes de nitrilo son preferibles al látex común (caucho natural) variedad. </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

Experimentación bioquímica general, requiere el conocimiento exacto, en una etapa temprana, del ácido nucleico, proteína y otros componentes biomoleculares en muestras potencialmente heterogéneos. Los ácidos nucleicos pueden ser detectados a través de varios métodos establecidos, incluyendo métodos analíticos que son espectrofotométrico (por ejemplo, A 260), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tintes fluorescentes), o colorimétrico (nucleósidos específicos de reacciones químicas cromogénicos). 1 A pesar de que no puede distinguir fácilmente ARN a partir de ADN, la A 260 / A 280 se emplea comúnmente, ya que ofrece una simple y rápida 2 evaluación del contenido relativo de ácido nucleico, que absorbe predominantemente cerca de 260 nm y proteínas, que absorbe principalmente cerca de 280 nm. Ratios &lt;0,8 se toman como indicadores de muestras &quot;puras&quot; de proteínas, mientras que el ácido nucleico puro (NA) se caracteriza por relaciones de&gt; 1,5 3. Hobargo, hay escenarios en los que el contenido de proteína / NA no puede ser tan clara o fiable inferirse de simples uv-vis medidas espectrofotométricas. Por ejemplo, (i) muestras podrá contener una o más proteínas que son relativamente carente de los aminoácidos aromáticos responsables de la absorción a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como es el caso con algunos pequeños ARN-proteínas de unión, y (ii) muestras pueden exhibir intermedio A 260 / A 280 ratios (~ 0,8 &lt;~ 1,5), donde el contenido de proteína / NA es mucho menos clara e incluso pueden reflejar algunos de alta afinidad de la asociación entre la proteína y componentes de NA. Para tales escenarios, se describe en la presente memoria un conjunto de ensayos colorimétricos para distinguir rápidamente ARN, ADN, y azúcares reductores en una muestra mixta potencialmente de biomoléculas. Los métodos se basan en la sensibilidad diferencial de las pentosas y otros hidratos de carbono a Benedict, Bial (orcinol), y reactivos de Dische (difenilamina); los protocolos simplificados puede ser comcompletado en cuestión de minutos, sin ningún paso adicional de tener que aislar los componentes. Los ensayos pueden realizarse en paralelo a diferenciar entre ARN y ADN, así como para indicar la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa y ribosa (Figura 1).

Los resultados se muestran en la Figura 3 para la aplicación de estos ensayos colorimétricos para los compuestos de referencia conocidos. Los datos representativos se muestran cualitativos para (a), el orcinol Benedict Bial (B), y Dische de difenilamina (c) ensayos, y las curvas de calibración para estos tres ensayos se muestran en la Figura 4. En los paneles 3 (AC), los paneles de la izquierda muestran positivos / negativos experimentos de control usando analitos adecuadamente react...

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Un conjunto de ensayos colorimétricos se describe para la proteína rápidamente distintivo, ARN, ADN, y ducing re-azúcares en muestras de biomoléculas potencialmente heterogéneos.

Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

41.5K vistas.  University of Virginia. Un conjunto de ensayos colorimétricos se describe para la proteína rápidamente distintivo, ARN, ADN, y ducing re-azúcares en muestras de biomoléculas potencialmente heterogéneos.

Video: Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

Rápida y alto rendimiento La amilosa Determinación de Freeze Dried papa Muestras

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Investigación

Química

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed assembly1-3, drug delivery4, improved hydrocarbon recovery5-7, and flowable electrodes for energy storage8. Suspensions containing fluorescent colloids and non-adsorbing polymers are appealing model systems, as the ratio of the polymer radius of gyration to the particle radius&#160;and concentration of polymer control the range and strength of the interparticle attraction, respectively. By tuning the polymer properties and the volume fraction of the colloids, colloid fluids, fluids of clusters, gels, crystals, and glasses can be obtained9.&#160;Confocal microscopy, a variant of fluorescence microscopy, allows an optically transparent and fluorescent sample to be imaged with high spatial and temporal resolution in three dimensions. In this technique, a small pinhole or slit blocks the emitted fluorescent light from regions of the sample that are outside the focal volume of the microscope optical system. As a result, only a thin section of the sample in the focal plane is imaged. This technique is particularly well suited to probe the structure and dynamics in dense colloidal suspensions at the single-particle scale: the particles are large enough to be resolved using visible light and diffuse slowly enough to be captured at typical scan speeds of commercial confocal systems10. Improvements in scan speeds and analysis algorithms have also enabled quantitative confocal imaging of flowing suspensions11-16,37.&#160;In this paper, we demonstrate confocal microscopy experiments to probe the confined phase behavior and flow properties of colloid-polymer mixtures. We first prepare colloid-polymer mixtures that are density- and refractive-index matched. Next, we report a standard protocol for imaging quiescent dense colloid-polymer mixtures under varying confinement in thin wedge-shaped cells. Finally, we demonstrate a protocol for imaging colloid-polymer mixtures during microchannel flow.

Confocal microscopy is used to image quiescent and flowing colloid-polymer mixtures, which are studied as model systems for attractive suspensions. Image analysis algorithms are used to calculate structural and dynamic metrics for the colloidal particles that measure changes due to geometric confinement.

Imagen confocal de Confinados en reposo y que fluye mezclas de coloide y polímeros

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparación de Mica y Silicon Sustratos para el Análisis de Origami ADN y Experimentación

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further supported by recent findings in high-resolution mass spectrometry based proteomics showing that many new proteins and sites within these proteins can be acetylated. However the identity of the enzymes regulating these proteins and sites is often unknown. Among these enzymes, sirtuins, which belong to the class III histone lysine deacetylases, have attracted great interest as enzymes regulating the acetylome under different physiological or pathophysiological conditions. Here we describe methods to link SIRT2, the cytoplasmic sirtuin, with its substrates including both in vitro and in vivo deacetylation assays. These assays can be applied in studies focused on other members of the sirtuin family to unravel the specific role of sirtuins and are necessary in order to establish the regulatory interplay of specific deacetylases with their substrates as a first step to better understand the role of protein acetylation. Furthermore, such assays can be used to distinguish functional acetylation sites on a protein from what may be non-regulatory acetylated lysines, as well as to examine the interplay between a deacetylase and its substrate in a physiological context.

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

This protocol describes the required steps to execute in vitro and in vivo deacetylation assays in order to establish the role of proteins as specific deacetylation substrates for sirtuins and further study the role of reversible - lysine acetylation as a post-translational modification.

Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Un método para manipular tensión superficial de un metal líquido a través de la oxidación de la superficie y Reducción

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

Coulomb Explosion Imaging as a Tool to Distinguish Between Stereoisomers

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish between enantiomers (stereoisomers) of simple chiral species on the level of individual molecules. In this approach, a gaseous molecular jet of the sample expands into a vacuum chamber and intersects with femtosecond (fs) laser pulses. The high intensity of the pulses leads to fast multiple ionization, igniting a so-called Coulomb Explosion that produces several cationic (positively charged) fragments. An electrostatic field guides these cations onto time- and position-sensitive detectors. Similar to a time-of-flight mass spectrometer, the arrival time of each ion yields information on its mass. As a surplus, the electrostatic field is adjusted in a way that the emission direction and the kinetic energy after fragmentation lead to variations in the time-of-flight and in the impact position on the detector.
Each ion impact creates an electronic signal in the detector; this signal is treated by high-frequency electronics and recorded event by event by a computer. The registered data correspond to the impact times and positions. With these data, the energy and the emission direction of each fragment can be calculated. These values are related to structural properties of the molecule under investigation, i.e. to the bond lengths and relative positions of the atoms, allowing to determine molecule by molecule the handedness of simple chiral species and other isomeric features.

For small chiral species, Coulomb Explosion Imaging provides a new approach to determine the handedness of individual molecules.

Imágenes de explosión de Coulomb como herramienta para distinguir entre los estereoisómeros

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

Partícula magnética de ADN vinculante el análisis por la dispersión ligera dinámica y electroforética

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Mejora de señal rápida Nanoprobe por síntesis de nanopartículas de oro In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Solvothermal Synthesis of MIL-96 and UiO-66-NH2 on Atomic Layer Deposited Metal Oxide Coatings on Fiber Mats

Metal-organic frameworks (MOFs), which contain reactive metal clusters and organic ligands allowing for large porosities and surface areas, have proven effective in gas adsorption, separations, and catalysis. MOFs are most commonly synthesized as bulk powder, requiring additional processes to adhere them to functional devices and fabrics that risk decreasing the powder porosity and adsorption capacity. Here, we demonstrate a method of first coating fabrics with metal oxide films using atomic layer deposition (ALD). This process creates conformal films of controllable thickness on each fiber, while providing a more reactive surface for MOF nucleation. By submerging the ALD coated fabric in solution during solvothermal MOF synthesis, the MOFs create a conformal, well-adhered coating on the fibers, resulting in a MOF-functionalized fabric, without additional adhesion materials that may block MOF pores and functional sites. Here we demonstrate two solvothermal synthesis methods. First, we form a MIL-96(Al) layer on polypropylene fibers using synthetic conditions that convert the metal oxide to MOF. Using initial inorganic films of varying thicknesses, diffusion of the organic linker into the inorganic allows us to control the extent of MOF loading on the fabric. Second, we perform a solvothermal synthesis of UiO-66-NH2 in which the MOF nucleates on the conformal metal oxide coating on polyamide-6 (PA-6) fibers, thereby producing a uniform and conformal thin film of MOF on the fabric. The resulting materials can be directly incorporated into filter devices or protective clothing and eliminate the maladroit qualities of loose powder.

Solvothermal Synthesis of MIL-96 and UiO-66-NH2 on Atomic Layer Deposited Metal Oxide Coatings on Fiber Mats

Metal-organic frameworks are effective in gas storage and heterogeneous catalysis, but typical synthesis methods result in loose powders that are difficult to incorporate into smart materials. We demonstrate a method of first coating fabrics with ALD metal oxides, resulting in conformal films of MOF on the fabrics during solvothermal synthesis.

Síntesis de Solvothermal de 96 MIL y UiO-66-NH2 de capa atómica deposita recubrimientos de óxido de Metal en esteras de la fibra

Metal-organic frameworks (MOFs), which contain reactive metal clusters and organic ligands allowing for large porosities and surface areas, have proven ...