עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת וירג&#39;יניה וJeffress זכרון הנאמנות (J-971). אנו מודים ל &#39;קולומבוס, ק ג&#39;אין, ופ רנדולף לדיונים מועילים וקריאה ביקורתית של כתב היד.

1. Assay של בנדיקט להפחתת סוכרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט של בנדיקט - קרבונט 940 מ&quot;מ נטול מי נתרן, מייבשי ציטרט הנתרן mM 588, 68 מ&quot;מ נחושת pentahydrate (II) סולפט. ריאגנט זה ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר (RT) לפחות שישה חודשים ללא שינוי ניכר בתגובתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 6x. כך, 600 תגובות μl, להוסיף 100 μl של ריאגנט של בנדיקט לצינור נקי 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge (למשל, אפנדורף מותג), לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה; הנפח האופטימלי ניתן לקבוע על סמך העצמה של היווצרות צבע בהרצה ראשונית. אם מדגם מספיק זמין אז להתחיל בניסויים כאלה בנפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חמש שישיות מעוצמת התגובה הכוללת, 500 μl של דגימה במקרה זה), ואז לדלל במבחנים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לטויהיה להביא את הנפח הסופי עד 600 μl; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Blank ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של מדגם זה ב475 ננומטר. </li></ol> 2. Assay Orcinol של יאל לסוכרי פנטוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט של יאל הטרי - קריאטין מונוהידראט 24.2 המ&quot;מ orcinol (ראה איור 2b למבנה של תרכובת זו), 6 M HCl, 0.025% hexahydrate כלוריד הברזל w / v הערה.:לאחסון ממושך, המגיב של יאל יכול להיות מוכן כמו שני פתרונות נפרדים מלאי: (i) מגיבים [0.05% w / v FeCl3 • 6H 2 O בריכוז HCl] וכן (ii) מגיב monohydrate orcinol B מ&quot;מ [422 הכין ב95 אתנול%]. מגיב יכול להיות מאוחסן בRT במשך שישה חודשים; B המגיב ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך חודש אחד, מכוסה בנייר כדי לצמצם את חשיפת אור. פתרוני מניות אלה מעורבים ב15 (א): 1 (ב) יחס לפני השימוש v / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ&quot;ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של יאל לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל, לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לצינור להביא fנפח inal ל 1.0 מ&quot;ל; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב660 ננומטר. </li></ol> 3. Assay Diphenylamine של Dische לסוכרים 2&#39;-deoxypentose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט diphenylamine של Dische - 60 המ&quot;מ diphenylamine, חומצה אצטית קרחונית ז 11, חומצה גופרתית 179 מ&quot;מ, 62% v / v אתנול. מגיב זה יכול להיות מראשpared מראש ולאחסן בRT במכל כהה, או מכוסה בנייר כסף, כדי להגביל את החשיפה לאור. בשל רגישות לאור מגיב לא צריך להיות מאוחסן ללא הגבלה זמן, אף שבפועל זה יכול להיות מוכן בכל שנים עד שלושה חודשים, ללא שינוי ניכר בתגובתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ&quot;ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של Dische לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל, לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לצינור להביא נפח הסופי למיליליטר 1.0; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה וallow לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב 600 ננומטר. </li></ol> 4. הערות שימוש נוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחלקות הבאות של מולקולות הן תרכובות התייחסות מתאימות לבקרת תגובות חיוביות ושליליות לכל assay: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של בנדיקט - חיובי = החופשי ריבוז, פרוקטוז, גלוקוז; השלילי = רנ&quot;א, דנ&quot;א, ATP, וכו &#39;. (כל saccharide החסר פונקציונלית סוכר הפחתה חינם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יאל של - החיובי = רנ&quot;א (תמצית השמרים של האופה לדוגמה), ריבוז, ה-ATP, UMP; השלילי = השור serאממ אלבומין (BSA) או כל חלבון אחר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dische של - חיובי = DNA (למשל העגל התימוס); שלילי = רנ&quot;א, ATP, וכו &#39;. (כל הלא 2&#39;-deoxygenated נוקלאוטיד) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחנים אלה נמצאו להיות די גמישים לתרכובות המשמשות לעתים קרובות בטיהור חלבונים: למשל, מלחים נפוצים כגון NaCl, (NH 4) 2 SO 4, ו-K 2 SO 4 לא התערב, והתגובות מופיעות בדרך כלל אינן מושפעות את התוכן של ממס. חומרי ניקוי או סוכני chaotropic כגון אוריאה עשויים להשפיע על תגובתיות של המבחנים אם pH הוא בסיסי ביותר, וניטראלי לטווח pH חומצי הוא בדרך כלל אופטימלי ביותר למבחנים של Dische יאל של ובגלל כימית התגובה הבסיסית (ראה את הטקסט ואת הפרוטונים באיור 2b, ג). תנאים לא טובים עלולים להיות תגובה, interferents חשוד, וכו &#39;. צריך להיבדק על בסיס מקרה לפי מקרה, תוך שימוש חיובי ושלילי שליטת הניסויים wתרכובות התייחסות ith. </li></ol>

<ol>
	<li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms.">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids.">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).</li><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2011).</li><li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).</li><li>Rice, P. A., Correll, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).</li><li>Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cations+in+charge:+Magnesium+ions+in+RNA+folding+and+catalysis.">Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).</li><li>Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+histone-like+protein+HU+specifically+recognizes+similar+structures+in+all+nucleic+acids.+DNA,+RNA,+and+their+hybrids.">The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids.</a> J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars.">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism.">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li><li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA.">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li><li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides.">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li><li>Burton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+conditions+and+mechanism+of+the+diphenylamine+reaction+for+the+colorimetric+estimation+of+deoxyribonucleic+acid.">A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.</a> Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).</li><li>Vogel, J., Luisi, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+and+its+constellation+of+RNA.">Hfq and its constellation of RNA.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).</li><li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions.">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li><li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP.">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li><li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+protein+assay+techniques.">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> מבחני colorimetric מוצגים כאן מציעים גישה פשוטה במהירות כדי להעריך את האופי הכימי של תערובות biomolecular, כגון הם נתקלו בעת טיהור חלבונים, RNAs או מתחמים מlysate כל התאים בהכנה למחקרים נוספים. כביולוגיה מבנית רודפת מכלולים נוספים יליד דמוי, אתגרים גדולים יותר בהדרגה, כגון הטרוגנ?...

הרבה מביולוגיה של תא מתרחשות באמצעות אינטראקציות מולקולריות המעורבות DNA ו-RNA. 4 חומצות גרעין באופן טבעי אלה (NAS) אינטראקציה זה עם זה, 5, 6 עם חלבונים ועם שורה של תרכובות מולקולה קטנה וligands in vivo (למשל, קטיונים divalent 7). האינטראקציות עשויות להיות קצרים או ארוך חיים (ודינג), עשוי לנוע בין גבוה עד בינוני לזיקה נמוכה (כוח התרמודינמית), וגם יכול להציג וריאציה משמעותית בתכונות כימיות וסגולית - כמה עמותות הן ספציפיות (למשל, ה-DNA · · גורמי תעתוק, RNA · · · גורמי שחבור), ואילו אינטראקציות אחרות הן בהכרח הרבה יותר כללי (למשל, ה-DNA · · · חלבונים חיידקיים היסטון דמויים הו 8). אינטראקציות לא ספציפיות עם NAS יכולות להיות השלכות מעשיות לניסויים במבחנה מעורבת תערובות של biomolecules, כפי שזה אפשרי, בסבירות גבוהה, כי חלק NAS יקשר עם ביומולקולות של עניין, לפחות תחת משנה חלק מתנאי הניסוי בשימוש (חוזק יוני, pH פתרון, וכו &#39;). קח, לדוגמה, ייצור של חלבון של עניין (POI) באמצעות ביטוי יתר של חלבון Heterologous רקומביננטי בתרבית תאי חיידקי Escherichia; הליך כזה מבוצע באופן שגרתי כמעט בכל מעבדת ביולוגיה מבנית 9 בהכנות לניסויים נוספים, כאמור. כאפיון ביוכימי / biophysical, התגבשות, וכו &#39;., מאמצים ראשוניים בדרך כלל להתמקד בהשגת כמות מספקת של נקודתי העניין בצורה טהורה ככל האפשר, באופן אידיאלי כדגימה כימית הומוגנית וbiophysically monodisperse. לאחר ההפרעה של תאים פונדקאיים, בשלבים המוקדמים של עבודת טיהור טיפוסית שואפים לבודד את נקודת העניין מE. חלבונים, חומצות גרעין coli, פסולת דופן תא,ורכיבים אחרים של lysate הסלולרי. עם זאת, המארח NAS עשוי לשתף לטהר עם POI מכמה סיבות physicochemical - POI הבסיסי ביותר עשוי הלא במיוחד נפתח DNA מארח / רנ&quot;א; POI יכול להיות פעילות הגנרית NA-מחייבת (לדוגמה, HU הנ&quot;ל); POI יכול להיות חלבון ספציפי למדי NA-מחייב אבל תערוכת תגובה צולבת עם RNAs המארח או DNAs; המארח NAS עלול ליצור אינטראקציה עם מטריצת כרומטוגרפיה ובכך פשוט שיתוף elute עם POI, וכן הלאה. ללא הבחנה, בעלת זיקה גבוהה מחייב של המארח NAS לPOI יכול להוות בעיה מציקה, כי זיהומי NA סביר יפריעו ניסויים במורד זרם (לדוגמה, מבחני אנאיזוטרופיה קרינה של POI • RNA מחייב 10). לחלופין, POI בלתי צפוי · · · עמותות NA גם ניתן לראות במקרה, כאינטראקציות כאלה להאיר קיבולת חומצת גרעין המחייב של נקודת העניין. כך או כך, בין אם הם מרכיבי NAS או מזהמים עיקריים, צריך לכמת ראשון ולזהות את הסוג (DNA, RNA) של שיתוף מטהר NAS בהכנה לניסויים במורד זרם. מספר שיטות אנליטיות קיימות לאיתור וquantitating NAS במדגם. רוב השיטות הזמינות באופן מהותי או spectrophotometric (למשל, 260 ערכי ספיגה ו260 / A 280 ratios), fluorometric (למשל, מחייב thiazole כתום או צבעי ניאון אחרים לנ&quot;א), או colorimetric (רגישות של נוקלאוזידים לתגובות כימיות שchromophores תשואת קליטה באזור UV-VIS של הספקטרום האלקטרומגנטי), כפי שתואר לאחרונה על ידי דה מיי et al. 1 עם זאת, הצעד החיוני לזיהוי הסוג של polynucleotide כRNA או DNA הוא מעבר להיקף של רבים מאלה quantitation גישות. כאן אנו מספקים סדרה של מבחני colorimetric לזהות במהירות את סוגי רכיבי NA במדגם חלבוניים. הפרוטוקולים מתוארים כאן גיבוצע ביעילות ללא צעדים נוספים של בידוד זיהומי NA הפוטנציאליים, ולהסתמך על הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים 11, assay orcinol לpentoses 12,13, ותגובות של diphenylamine 14,15 2&#39;-deoxypentoses (תרשימי 1 ו 2) . מבחנו של בנדיקט (איור 2a) מנצל את היכולת של השרשרת הפתוחה (אלדהיד) הטופס ליניארי, של סוכר aldose להפחית Cu 2 +, עם חמצון קשור של קרבוניל של הסוכר למחצית carboxylate וייצור של Cu 2 O כ משקע אדום מסיס. תגובה זו תהיה מבחן חיובית עם הפחתת סוכרים חינם כגון aldoses וketoses (אשר להמיר לaldoses המתאים דרך ביניים enediol), אך לא עם סוכרי פנטוז שנעולים בצורה מחזורית כחלק מעמוד השדרה קוולנטי של DNA או RNA polynucleotide. בגלל הדרישה של מינימליסטי פונקציונלי hemiacetal חופשי, שיתוף אחרmpounds שיכולים בדיקה חיובית בבדיקה זו - ולכן יפעל כinterferents פוטנציאלי - כולל α-hydroxy-קטונים ואוליגוסכרידים קצרים (מלטוז disaccharide למשל). שניהם יאל של orcinol (האיור 2b) ותגובות diphenylamine של Dische (איור 2 ג) מבוססות על הרס ראשוני של עמוד שדרת polynucleotide, דרך depurination של nucleoside וחומצה או עוד יותר הידרוליזה בסיס קטליזאטור של נוקלאוטידים ההורי, כדי להניב furan-2 -Carbaldehyde (furfural) נגזרים; הנגזרים האלה אז להגיב עם או polyhydroxy פנול כגון orcinol (יאל של) או diphenylamine (Dische של) ריאגנטים ליצירת מוצרי עיבוי צבעוניים של מבנה כימי הידוע ברובם. דנ&quot;א לעומת רנ&quot;א ספציפי של assay של Dische נובע מהעובדה שסוכר הפנטוז חייב להיות 2&#39;-deoxygenated כדי להיות רגיש לחמצון לאלדהיד ω-hydroxylevulinyl, אשר עוד מגיב עם diphenylamineתחת תנאים חומציים להניב בהירים כחולים מעובים (איור 2 ג). שימוש בפרוטוקולים היעילים שתוארו כאן, יש לנו מצאנו שתגובות colorimetric סוכר ספציפיים אלה יכולים להבחין בין רנ&quot;א ודנ&quot;א, וגם מצביעות על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, או ריבוז במדגם biomolecular.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב או ציוד </td><td> ספק / חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות, הערות </td></tr><tr><td> סודיום קרבונט נטול מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> dihydrate ציטרט הנתרן </td><td> סיגמא </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> נחושת (II) pentahydrate סולפט </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> monohydrate Orcinol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> המרוכז HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> hexahydrate כלוריד Ferric </td><td> סיגמא </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamine </td><td> אולדריץ </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> ריבוז </td><td> סיגמא </td><td> R-7500 </td><td> הכנה על 1% w / v בH 2 O </td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית מהשמרים של האופה (cerevisiae ס) </td><td> סיגמא </td><td> R6750 </td><td> הכנה ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O; חנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> חומצה דאוקסיריבונוקלאית (מלח נתרן), מעגל התימוס </td><td> סיגמא </td><td> D1501 </td><td> הכנה ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O; חנות ב 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים, ציוד ובטיחות חומרים מפורטים בfollowing שולחן הסדר בו הם מופיעים בסעיף הפרוטוקול. אלא אם צוין אחר (לעיל), כל ריאגנטים ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר הסביבה ותאורה. עבור כל פריטים שאינו מופיעים ברשימה שלהלן (לדוגמה, צינורות microcentrifuge), היצרן / דגם / מגוון שנמצא במעבדה הביוכימית תקן הרגיל יכול לשמש (למשל, 1.5 צינורות Eppendorf מותג ml microfuge). צינורות פלסטיק סטנדרטיים microfuge אמורים לשמש לפעולות כרוכות בצנטריפוגה (למשל, לחומר חלקיקי משקעים סמכו לסוף כל פרוטוקול). אין חומר מסוים עדיף, כל עוד את הצינורות יכולים להיות אטומים; צינורות פוליפרופילן הטיפוסיים המופיעים במעבדות ביוכימיה לעבוד היטב. במונחים של חששות בטיחות וסילוק פסולת, אמצעי זהירות מעבדה סטנדרטי (משקפי מגן, ברדסי קטר) צריך להיות למימוש בקילוף מראש, עובד עם, והשלכה של פתרונות המכילים אצטית מרוכזים, הידרוכלורית, או חומצות גופרתיות. לחומרים כימיים אורגניים כגון orcinol או diphenylamine, כפפות nitrile עדיפות על מגוון הלטקס המשותף (גומי טבעי). </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

ניסויים ביוכימיים בדרך כלל דורשים ידע מדויק, בשלב מוקדם, של חומצות הגרעין, חלבונים ומרכיבים אחרים בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות. חומצות גרעין ניתן לאתר באמצעות כמה גישות הוקמו, כולל שיטות אנליטיות שspectrophotometric (למשל, 260), fluorometric (למשל, כריכה של צבעי ניאון), או colorimetric (תגובות כימיות chromogenic nucleoside ספציפיים). 1 למרות שאנחנו לא יכולים להבחין RNA מ-DNA, 260/280 יחס מועסק בדרך כלל, כפי שהוא מציע 2 הערכה פשוטה ומהירה של התוכן היחסי של חומצות גרעין, אשר סופגות בעיקר ליד 260 ננומטר וחלבונים, אשר סופגים בעיקר ליד 280 ננומטר. יחסים &lt;0.8 נלקחים כמצביעות על דגימות חלבון &quot;טהורות&quot;, ואילו חומצת גרעין טהורה (NA) מאופיינת ביחסים&gt; 1.5 3. הוwever, יש תרחישים שבם תכולת החלבון / אנ לא יכולה להיות ברורה או מהימן להסיק ממדידות spectrophotometric UV-VIS פשוטות. לדוגמה, (אני) דגימות עשויות להכיל חלבונים אחד או יותר שהם יחסית נטולי החומצות האמינו ארומטיים האחראיות על ספיגה ב≈ 280 ננומטר (TRP, Tyr, Phe), כפי שקורה עם כמה חלבונים קטנים RNA-מחייבים, ו (Ii) דוגמאות ניתן להציג ביניים A 260 / A 280 יחסים (~ 0.8 &lt;~ 1.5), שבו תכולת החלבון / NA הרבה פחות ברור, ואף עלול משקפות חלק-זיקה גבוה קשר בין מרכיבי החלבון ואנ. לתרחישים כאלה, נתאר להלן חבילה של מבחני colorimetric מהירות להבחין RNA, DNA, והפחתת סוכרים במדגם פוטנציאלי מעורב של ביומולקולות. השיטות להסתמך על רגישות ההפרש של pentoses ופחמימות אחרות לבנדיקט, יאל של (orcinol), והמגיבים של Dische (diphenylamine); הפרוטוקולים היעילים יכול להיות completed בעניין של דקות, ללא כל פעולה נוספת שיש לבודד את הרכיבים. את המבחנים ניתן לבצע במקביל להבחנה בין רנ&quot;א ודנ&quot;א, כמו גם להעיד על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, וריבוז (1 איור).

תוצאות מוצגות באיור 3 ליישום מבחנים אלה לcolorimetric תרכובות התייחסות ידועה. מידע איכותי יציג מוצגים ל( ב), והמבחנים של בנדיקט (א), של יאל orcinol של Dische diphenylamine (ג), ועקומות רגילות לשלושת מבחנים אלה מוצגים באיור 4. בלוחות 3 (AC), לוחות השמאל להראות ניסויים שליטים ח...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples at JoVE.com

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ&quot;א, דנ&quot;א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

rapid-colorimetric-assays-to-qualitatively-distinguish-rna-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

41.8K Views.  University of Virginia. חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

Video: Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Genetics

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Next-generation Viral RNA/DNA in situ Hybridization Applications in Human Immunodeficiency Virus/Simian Immunodeficiency Virus Research

In situ hybridization is a powerful technique to identify specific RNA or DNA sequences within individual cells in tissue sections, providing important insights into physiological processes and disease pathogenesis. In situ hybridization (ISH) has been used for many years to assess the location of cells infected by viruses, but recently a next-generation ISH approach was developed with a unique probe design strategy that allows simultaneous signal amplification and background suppression to achieve single-molecule visualization while preserving tissue morphology. This next-generation ISH is based on an approach like branched PCR, but performed in situ and is more facile, sensitive, and reproducible than classical ISH methods or in situ PCR approaches in routinely detecting RNA or DNA in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissues. For the last several years our laboratory has been applying this ISH platform for the detection of human immunodeficiency (HIV) and simian immunodeficiency (SIV) viral RNA (vRNA) and/or viral DNA (vDNA) positive cells within a multitude of FFPE tissues. With this detailed technical manuscript, we would like to share our knowledge and advice with all individuals interested in using next-generation ISH in their research.

Here we present a next-generation in situ hybridization assay to identify specific viral RNA or DNA sequences in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissues. This approach allows visualization of low copies of RNA and DNA in less than 24 h with very high sensitivity and specificity.

In situ hybridization is a powerful technique to identify specific RNA or DNA sequences within individual cells in tissue sections, providing important ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

<em&gt; במבחנה</em&gt; אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Bioengineering

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Developmental Biology

<meta charset="utf8"></head><body>ננו-מכונות DNAzyme מדויקות לניתוח RNA ו-DNA מפלים

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: התקדמות בננו-חיישנים של DNA – התמודדות עם אתגרי רגישות וסלקטיביות בזיהוי מולקולרי

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochemistry

בדיקות עבור אנזימי DNA באמצעות אוליגונוקלאוטידים סינתטיים

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

מחבר זרקור: אפיון אנזימים חדשים מאקסטרמופילים ופתוגנים נפוצים להבנת תיקון ושכפול DNA

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

Next-generation Viral RNA/DNA in situ Hybridization Applications in Human Immunodeficiency Virus/Simian Immunodeficiency Virus Research

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין