עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת וירג&#39;יניה וJeffress זכרון הנאמנות (J-971). אנו מודים ל &#39;קולומבוס, ק ג&#39;אין, ופ רנדולף לדיונים מועילים וקריאה ביקורתית של כתב היד.

1. Assay של בנדיקט להפחתת סוכרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט של בנדיקט - קרבונט 940 מ&quot;מ נטול מי נתרן, מייבשי ציטרט הנתרן mM 588, 68 מ&quot;מ נחושת pentahydrate (II) סולפט. ריאגנט זה ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר (RT) לפחות שישה חודשים ללא שינוי ניכר בתגובתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 6x. כך, 600 תגובות μl, להוסיף 100 μl של ריאגנט של בנדיקט לצינור נקי 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge (למשל, אפנדורף מותג), לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה; הנפח האופטימלי ניתן לקבוע על סמך העצמה של היווצרות צבע בהרצה ראשונית. אם מדגם מספיק זמין אז להתחיל בניסויים כאלה בנפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חמש שישיות מעוצמת התגובה הכוללת, 500 μl של דגימה במקרה זה), ואז לדלל במבחנים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לטויהיה להביא את הנפח הסופי עד 600 μl; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Blank ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של מדגם זה ב475 ננומטר. </li></ol> 2. Assay Orcinol של יאל לסוכרי פנטוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט של יאל הטרי - קריאטין מונוהידראט 24.2 המ&quot;מ orcinol (ראה איור 2b למבנה של תרכובת זו), 6 M HCl, 0.025% hexahydrate כלוריד הברזל w / v הערה.:לאחסון ממושך, המגיב של יאל יכול להיות מוכן כמו שני פתרונות נפרדים מלאי: (i) מגיבים [0.05% w / v FeCl3 • 6H 2 O בריכוז HCl] וכן (ii) מגיב monohydrate orcinol B מ&quot;מ [422 הכין ב95 אתנול%]. מגיב יכול להיות מאוחסן בRT במשך שישה חודשים; B המגיב ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך חודש אחד, מכוסה בנייר כדי לצמצם את חשיפת אור. פתרוני מניות אלה מעורבים ב15 (א): 1 (ב) יחס לפני השימוש v / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ&quot;ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של יאל לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל, לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לצינור להביא fנפח inal ל 1.0 מ&quot;ל; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה ולאפשר לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב660 ננומטר. </li></ol> 3. Assay Diphenylamine של Dische לסוכרים 2&#39;-deoxypentose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמות מתאימה של ריאגנט diphenylamine של Dische - 60 המ&quot;מ diphenylamine, חומצה אצטית קרחונית ז 11, חומצה גופרתית 179 מ&quot;מ, 62% v / v אתנול. מגיב זה יכול להיות מראשpared מראש ולאחסן בRT במכל כהה, או מכוסה בנייר כסף, כדי להגביל את החשיפה לאור. בשל רגישות לאור מגיב לא צריך להיות מאוחסן ללא הגבלה זמן, אף שבפועל זה יכול להיות מוכן בכל שנים עד שלושה חודשים, ללא שינוי ניכר בתגובתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב לעיל הוא 2x. כך, תגובות 1.0 מ&quot;ל, להוסיף 500 μl של ריאגנט של Dische לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מ&quot;ל, לפי המדגם שassayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקום בין 10 ל 500 μl μl של מדגם לצינור זה. לפי הערה 1.3 (לעיל), אם מדגם מספיק זמין אז תתחיל תגובות משפט באמצעות נפח הדגימה המרבית האפשרי (כלומר, חצי נפח התגובה הכולל, 500 μl של דגימה במקרה זה) ותדלל משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DDH 2 O לצינור להביא נפח הסופי למיליליטר 1.0; מערבב את הפתרון על ידי vortexing או pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות למשך 20 דקות באמבט מים רותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם המחומם מהאמבטיה וallow לו להתקרר בRT למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור הדגימה ב&gt; 9300 XG (~ 10000 סל&quot;ד ברוטור FA45-24-11 אפנדורף קבוע זווית) במשך 5 דקות כדי משקעים כל חומר חלקיקים; שלב זה חשוב יותר למחקרים כמותיים ולא איכותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot supernatant מצינור זה לקובט נקי לבדיקה ויזואלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חצי כמותית והריק ספקטרופוטומטר UV-VIS עם מים ולמדוד את הספיגה של מדגם קובט ב 600 ננומטר. </li></ol> 4. הערות שימוש נוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחלקות הבאות של מולקולות הן תרכובות התייחסות מתאימות לבקרת תגובות חיוביות ושליליות לכל assay: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של בנדיקט - חיובי = החופשי ריבוז, פרוקטוז, גלוקוז; השלילי = רנ&quot;א, דנ&quot;א, ATP, וכו &#39;. (כל saccharide החסר פונקציונלית סוכר הפחתה חינם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יאל של - החיובי = רנ&quot;א (תמצית השמרים של האופה לדוגמה), ריבוז, ה-ATP, UMP; השלילי = השור serאממ אלבומין (BSA) או כל חלבון אחר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dische של - חיובי = DNA (למשל העגל התימוס); שלילי = רנ&quot;א, ATP, וכו &#39;. (כל הלא 2&#39;-deoxygenated נוקלאוטיד) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחנים אלה נמצאו להיות די גמישים לתרכובות המשמשות לעתים קרובות בטיהור חלבונים: למשל, מלחים נפוצים כגון NaCl, (NH 4) 2 SO 4, ו-K 2 SO 4 לא התערב, והתגובות מופיעות בדרך כלל אינן מושפעות את התוכן של ממס. חומרי ניקוי או סוכני chaotropic כגון אוריאה עשויים להשפיע על תגובתיות של המבחנים אם pH הוא בסיסי ביותר, וניטראלי לטווח pH חומצי הוא בדרך כלל אופטימלי ביותר למבחנים של Dische יאל של ובגלל כימית התגובה הבסיסית (ראה את הטקסט ואת הפרוטונים באיור 2b, ג). תנאים לא טובים עלולים להיות תגובה, interferents חשוד, וכו &#39;. צריך להיבדק על בסיס מקרה לפי מקרה, תוך שימוש חיובי ושלילי שליטת הניסויים wתרכובות התייחסות ith. </li></ol>

<ol>
	<li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms.">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids.">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).</li><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2011).</li><li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).</li><li>Rice, P. A., Correll, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).</li><li>Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cations+in+charge:+Magnesium+ions+in+RNA+folding+and+catalysis.">Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).</li><li>Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+histone-like+protein+HU+specifically+recognizes+similar+structures+in+all+nucleic+acids.+DNA,+RNA,+and+their+hybrids.">The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids.</a> J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars.">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism.">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li><li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA.">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li><li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides.">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li><li>Burton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+conditions+and+mechanism+of+the+diphenylamine+reaction+for+the+colorimetric+estimation+of+deoxyribonucleic+acid.">A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.</a> Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).</li><li>Vogel, J., Luisi, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+and+its+constellation+of+RNA.">Hfq and its constellation of RNA.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).</li><li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions.">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li><li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP.">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li><li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+protein+assay+techniques.">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction:+twenty-something+years+on.">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

<html> מבחני colorimetric מוצגים כאן מציעים גישה פשוטה במהירות כדי להעריך את האופי הכימי של תערובות biomolecular, כגון הם נתקלו בעת טיהור חלבונים, RNAs או מתחמים מlysate כל התאים בהכנה למחקרים נוספים. כביולוגיה מבנית רודפת מכלולים נוספים יליד דמוי, אתגרים גדולים יותר בהדרגה, כגון הטרוגנ?...

הרבה מביולוגיה של תא מתרחשות באמצעות אינטראקציות מולקולריות המעורבות DNA ו-RNA. 4 חומצות גרעין באופן טבעי אלה (NAS) אינטראקציה זה עם זה, 5, 6 עם חלבונים ועם שורה של תרכובות מולקולה קטנה וligands in vivo (למשל, קטיונים divalent 7). האינטראקציות עשויות להיות קצרים או ארוך חיים (ודינג), עשוי לנוע בין גבוה עד בינוני לזיקה נמוכה (כוח התרמודינמית), וגם יכול להציג וריאציה משמעותית בתכונות כימיות וסגולית - כמה עמותות הן ספציפיות (למשל, ה-DNA · · גורמי תעתוק, RNA · · · גורמי שחבור), ואילו אינטראקציות אחרות הן בהכרח הרבה יותר כללי (למשל, ה-DNA · · · חלבונים חיידקיים היסטון דמויים הו 8). אינטראקציות לא ספציפיות עם NAS יכולות להיות השלכות מעשיות לניסויים במבחנה מעורבת תערובות של biomolecules, כפי שזה אפשרי, בסבירות גבוהה, כי חלק NAS יקשר עם ביומולקולות של עניין, לפחות תחת משנה חלק מתנאי הניסוי בשימוש (חוזק יוני, pH פתרון, וכו &#39;). קח, לדוגמה, ייצור של חלבון של עניין (POI) באמצעות ביטוי יתר של חלבון Heterologous רקומביננטי בתרבית תאי חיידקי Escherichia; הליך כזה מבוצע באופן שגרתי כמעט בכל מעבדת ביולוגיה מבנית 9 בהכנות לניסויים נוספים, כאמור. כאפיון ביוכימי / biophysical, התגבשות, וכו &#39;., מאמצים ראשוניים בדרך כלל להתמקד בהשגת כמות מספקת של נקודתי העניין בצורה טהורה ככל האפשר, באופן אידיאלי כדגימה כימית הומוגנית וbiophysically monodisperse. לאחר ההפרעה של תאים פונדקאיים, בשלבים המוקדמים של עבודת טיהור טיפוסית שואפים לבודד את נקודת העניין מE. חלבונים, חומצות גרעין coli, פסולת דופן תא,ורכיבים אחרים של lysate הסלולרי. עם זאת, המארח NAS עשוי לשתף לטהר עם POI מכמה סיבות physicochemical - POI הבסיסי ביותר עשוי הלא במיוחד נפתח DNA מארח / רנ&quot;א; POI יכול להיות פעילות הגנרית NA-מחייבת (לדוגמה, HU הנ&quot;ל); POI יכול להיות חלבון ספציפי למדי NA-מחייב אבל תערוכת תגובה צולבת עם RNAs המארח או DNAs; המארח NAS עלול ליצור אינטראקציה עם מטריצת כרומטוגרפיה ובכך פשוט שיתוף elute עם POI, וכן הלאה. ללא הבחנה, בעלת זיקה גבוהה מחייב של המארח NAS לPOI יכול להוות בעיה מציקה, כי זיהומי NA סביר יפריעו ניסויים במורד זרם (לדוגמה, מבחני אנאיזוטרופיה קרינה של POI • RNA מחייב 10). לחלופין, POI בלתי צפוי · · · עמותות NA גם ניתן לראות במקרה, כאינטראקציות כאלה להאיר קיבולת חומצת גרעין המחייב של נקודת העניין. כך או כך, בין אם הם מרכיבי NAS או מזהמים עיקריים, צריך לכמת ראשון ולזהות את הסוג (DNA, RNA) של שיתוף מטהר NAS בהכנה לניסויים במורד זרם. מספר שיטות אנליטיות קיימות לאיתור וquantitating NAS במדגם. רוב השיטות הזמינות באופן מהותי או spectrophotometric (למשל, 260 ערכי ספיגה ו260 / A 280 ratios), fluorometric (למשל, מחייב thiazole כתום או צבעי ניאון אחרים לנ&quot;א), או colorimetric (רגישות של נוקלאוזידים לתגובות כימיות שchromophores תשואת קליטה באזור UV-VIS של הספקטרום האלקטרומגנטי), כפי שתואר לאחרונה על ידי דה מיי et al. 1 עם זאת, הצעד החיוני לזיהוי הסוג של polynucleotide כRNA או DNA הוא מעבר להיקף של רבים מאלה quantitation גישות. כאן אנו מספקים סדרה של מבחני colorimetric לזהות במהירות את סוגי רכיבי NA במדגם חלבוניים. הפרוטוקולים מתוארים כאן גיבוצע ביעילות ללא צעדים נוספים של בידוד זיהומי NA הפוטנציאליים, ולהסתמך על הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים 11, assay orcinol לpentoses 12,13, ותגובות של diphenylamine 14,15 2&#39;-deoxypentoses (תרשימי 1 ו 2) . מבחנו של בנדיקט (איור 2a) מנצל את היכולת של השרשרת הפתוחה (אלדהיד) הטופס ליניארי, של סוכר aldose להפחית Cu 2 +, עם חמצון קשור של קרבוניל של הסוכר למחצית carboxylate וייצור של Cu 2 O כ משקע אדום מסיס. תגובה זו תהיה מבחן חיובית עם הפחתת סוכרים חינם כגון aldoses וketoses (אשר להמיר לaldoses המתאים דרך ביניים enediol), אך לא עם סוכרי פנטוז שנעולים בצורה מחזורית כחלק מעמוד השדרה קוולנטי של DNA או RNA polynucleotide. בגלל הדרישה של מינימליסטי פונקציונלי hemiacetal חופשי, שיתוף אחרmpounds שיכולים בדיקה חיובית בבדיקה זו - ולכן יפעל כinterferents פוטנציאלי - כולל α-hydroxy-קטונים ואוליגוסכרידים קצרים (מלטוז disaccharide למשל). שניהם יאל של orcinol (האיור 2b) ותגובות diphenylamine של Dische (איור 2 ג) מבוססות על הרס ראשוני של עמוד שדרת polynucleotide, דרך depurination של nucleoside וחומצה או עוד יותר הידרוליזה בסיס קטליזאטור של נוקלאוטידים ההורי, כדי להניב furan-2 -Carbaldehyde (furfural) נגזרים; הנגזרים האלה אז להגיב עם או polyhydroxy פנול כגון orcinol (יאל של) או diphenylamine (Dische של) ריאגנטים ליצירת מוצרי עיבוי צבעוניים של מבנה כימי הידוע ברובם. דנ&quot;א לעומת רנ&quot;א ספציפי של assay של Dische נובע מהעובדה שסוכר הפנטוז חייב להיות 2&#39;-deoxygenated כדי להיות רגיש לחמצון לאלדהיד ω-hydroxylevulinyl, אשר עוד מגיב עם diphenylamineתחת תנאים חומציים להניב בהירים כחולים מעובים (איור 2 ג). שימוש בפרוטוקולים היעילים שתוארו כאן, יש לנו מצאנו שתגובות colorimetric סוכר ספציפיים אלה יכולים להבחין בין רנ&quot;א ודנ&quot;א, וגם מצביעות על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, או ריבוז במדגם biomolecular.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב או ציוד </td><td> ספק / חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות, הערות </td></tr><tr><td> סודיום קרבונט נטול מים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> dihydrate ציטרט הנתרן </td><td> סיגמא </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> נחושת (II) pentahydrate סולפט </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> monohydrate Orcinol </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> המרוכז HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> hexahydrate כלוריד Ferric </td><td> סיגמא </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamine </td><td> אולדריץ </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית קרחונית </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה גופרתית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> ריבוז </td><td> סיגמא </td><td> R-7500 </td><td> הכנה על 1% w / v בH 2 O </td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית מהשמרים של האופה (cerevisiae ס) </td><td> סיגמא </td><td> R6750 </td><td> הכנה ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O; חנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> חומצה דאוקסיריבונוקלאית (מלח נתרן), מעגל התימוס </td><td> סיגמא </td><td> D1501 </td><td> הכנה ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O; חנות ב 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים, ציוד ובטיחות חומרים מפורטים בfollowing שולחן הסדר בו הם מופיעים בסעיף הפרוטוקול. אלא אם צוין אחר (לעיל), כל ריאגנטים ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר הסביבה ותאורה. עבור כל פריטים שאינו מופיעים ברשימה שלהלן (לדוגמה, צינורות microcentrifuge), היצרן / דגם / מגוון שנמצא במעבדה הביוכימית תקן הרגיל יכול לשמש (למשל, 1.5 צינורות Eppendorf מותג ml microfuge). צינורות פלסטיק סטנדרטיים microfuge אמורים לשמש לפעולות כרוכות בצנטריפוגה (למשל, לחומר חלקיקי משקעים סמכו לסוף כל פרוטוקול). אין חומר מסוים עדיף, כל עוד את הצינורות יכולים להיות אטומים; צינורות פוליפרופילן הטיפוסיים המופיעים במעבדות ביוכימיה לעבוד היטב. במונחים של חששות בטיחות וסילוק פסולת, אמצעי זהירות מעבדה סטנדרטי (משקפי מגן, ברדסי קטר) צריך להיות למימוש בקילוף מראש, עובד עם, והשלכה של פתרונות המכילים אצטית מרוכזים, הידרוכלורית, או חומצות גופרתיות. לחומרים כימיים אורגניים כגון orcinol או diphenylamine, כפפות nitrile עדיפות על מגוון הלטקס המשותף (גומי טבעי). </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

ניסויים ביוכימיים בדרך כלל דורשים ידע מדויק, בשלב מוקדם, של חומצות הגרעין, חלבונים ומרכיבים אחרים בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות. חומצות גרעין ניתן לאתר באמצעות כמה גישות הוקמו, כולל שיטות אנליטיות שspectrophotometric (למשל, 260), fluorometric (למשל, כריכה של צבעי ניאון), או colorimetric (תגובות כימיות chromogenic nucleoside ספציפיים). 1 למרות שאנחנו לא יכולים להבחין RNA מ-DNA, 260/280 יחס מועסק בדרך כלל, כפי שהוא מציע 2 הערכה פשוטה ומהירה של התוכן היחסי של חומצות גרעין, אשר סופגות בעיקר ליד 260 ננומטר וחלבונים, אשר סופגים בעיקר ליד 280 ננומטר. יחסים &lt;0.8 נלקחים כמצביעות על דגימות חלבון &quot;טהורות&quot;, ואילו חומצת גרעין טהורה (NA) מאופיינת ביחסים&gt; 1.5 3. הוwever, יש תרחישים שבם תכולת החלבון / אנ לא יכולה להיות ברורה או מהימן להסיק ממדידות spectrophotometric UV-VIS פשוטות. לדוגמה, (אני) דגימות עשויות להכיל חלבונים אחד או יותר שהם יחסית נטולי החומצות האמינו ארומטיים האחראיות על ספיגה ב≈ 280 ננומטר (TRP, Tyr, Phe), כפי שקורה עם כמה חלבונים קטנים RNA-מחייבים, ו (Ii) דוגמאות ניתן להציג ביניים A 260 / A 280 יחסים (~ 0.8 &lt;~ 1.5), שבו תכולת החלבון / NA הרבה פחות ברור, ואף עלול משקפות חלק-זיקה גבוה קשר בין מרכיבי החלבון ואנ. לתרחישים כאלה, נתאר להלן חבילה של מבחני colorimetric מהירות להבחין RNA, DNA, והפחתת סוכרים במדגם פוטנציאלי מעורב של ביומולקולות. השיטות להסתמך על רגישות ההפרש של pentoses ופחמימות אחרות לבנדיקט, יאל של (orcinol), והמגיבים של Dische (diphenylamine); הפרוטוקולים היעילים יכול להיות completed בעניין של דקות, ללא כל פעולה נוספת שיש לבודד את הרכיבים. את המבחנים ניתן לבצע במקביל להבחנה בין רנ&quot;א ודנ&quot;א, כמו גם להעיד על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, וריבוז (1 איור).

תוצאות מוצגות באיור 3 ליישום מבחנים אלה לcolorimetric תרכובות התייחסות ידועה. מידע איכותי יציג מוצגים ל( ב), והמבחנים של בנדיקט (א), של יאל orcinol של Dische diphenylamine (ג), ועקומות רגילות לשלושת מבחנים אלה מוצגים באיור 4. בלוחות 3 (AC), לוחות השמאל להראות ניסויים שליטים ח...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples at JoVE.com

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ&quot;א, דנ&quot;א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

rapid-colorimetric-assays-to-qualitatively-distinguish-rna-dna

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

41.7K Views.  University of Virginia. חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.

Video: Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

היווצרות של מבני Biomolecular הוזמנו על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים קצרים

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed assembly1-3, drug delivery4, improved hydrocarbon recovery5-7, and flowable electrodes for energy storage8. Suspensions containing fluorescent colloids and non-adsorbing polymers are appealing model systems, as the ratio of the polymer radius of gyration to the particle radius&#160;and concentration of polymer control the range and strength of the interparticle attraction, respectively. By tuning the polymer properties and the volume fraction of the colloids, colloid fluids, fluids of clusters, gels, crystals, and glasses can be obtained9.&#160;Confocal microscopy, a variant of fluorescence microscopy, allows an optically transparent and fluorescent sample to be imaged with high spatial and temporal resolution in three dimensions. In this technique, a small pinhole or slit blocks the emitted fluorescent light from regions of the sample that are outside the focal volume of the microscope optical system. As a result, only a thin section of the sample in the focal plane is imaged. This technique is particularly well suited to probe the structure and dynamics in dense colloidal suspensions at the single-particle scale: the particles are large enough to be resolved using visible light and diffuse slowly enough to be captured at typical scan speeds of commercial confocal systems10. Improvements in scan speeds and analysis algorithms have also enabled quantitative confocal imaging of flowing suspensions11-16,37.&#160;In this paper, we demonstrate confocal microscopy experiments to probe the confined phase behavior and flow properties of colloid-polymer mixtures. We first prepare colloid-polymer mixtures that are density- and refractive-index matched. Next, we report a standard protocol for imaging quiescent dense colloid-polymer mixtures under varying confinement in thin wedge-shaped cells. Finally, we demonstrate a protocol for imaging colloid-polymer mixtures during microchannel flow.

Confocal microscopy is used to image quiescent and flowing colloid-polymer mixtures, which are studied as model systems for attractive suspensions. Image analysis algorithms are used to calculate structural and dynamic metrics for the colloidal particles that measure changes due to geometric confinement.

ההדמיה confocal של רגיעה מרותקת ותערובות קולואיד פולימר מזרימים

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further supported by recent findings in high-resolution mass spectrometry based proteomics showing that many new proteins and sites within these proteins can be acetylated. However the identity of the enzymes regulating these proteins and sites is often unknown. Among these enzymes, sirtuins, which belong to the class III histone lysine deacetylases, have attracted great interest as enzymes regulating the acetylome under different physiological or pathophysiological conditions. Here we describe methods to link SIRT2, the cytoplasmic sirtuin, with its substrates including both in vitro and in vivo deacetylation assays. These assays can be applied in studies focused on other members of the sirtuin family to unravel the specific role of sirtuins and are necessary in order to establish the regulatory interplay of specific deacetylases with their substrates as a first step to better understand the role of protein acetylation. Furthermore, such assays can be used to distinguish functional acetylation sites on a protein from what may be non-regulatory acetylated lysines, as well as to examine the interplay between a deacetylase and its substrate in a physiological context.

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

This protocol describes the required steps to execute in vitro and in vivo deacetylation assays in order to establish the role of proteins as specific deacetylation substrates for sirtuins and further study the role of reversible - lysine acetylation as a post-translational modification.

Deacetylation מבחנים כדי לפענח את יחסי הגומלין בין סירטואינים (SIRT2) ו-מצעי חלבון מסוימים

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

שיטה למניפולציות מתח פנים של מתכת נוזלית באמצעות חמצון פני שטח והפחתה

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

Coulomb Explosion Imaging as a Tool to Distinguish Between Stereoisomers

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish between enantiomers (stereoisomers) of simple chiral species on the level of individual molecules. In this approach, a gaseous molecular jet of the sample expands into a vacuum chamber and intersects with femtosecond (fs) laser pulses. The high intensity of the pulses leads to fast multiple ionization, igniting a so-called Coulomb Explosion that produces several cationic (positively charged) fragments. An electrostatic field guides these cations onto time- and position-sensitive detectors. Similar to a time-of-flight mass spectrometer, the arrival time of each ion yields information on its mass. As a surplus, the electrostatic field is adjusted in a way that the emission direction and the kinetic energy after fragmentation lead to variations in the time-of-flight and in the impact position on the detector.
Each ion impact creates an electronic signal in the detector; this signal is treated by high-frequency electronics and recorded event by event by a computer. The registered data correspond to the impact times and positions. With these data, the energy and the emission direction of each fragment can be calculated. These values are related to structural properties of the molecule under investigation, i.e. to the bond lengths and relative positions of the atoms, allowing to determine molecule by molecule the handedness of simple chiral species and other isomeric features.

For small chiral species, Coulomb Explosion Imaging provides a new approach to determine the handedness of individual molecules.

הפיצוץ הקולומבית הדמיה ככלי להבחנה בין Stereoisomers

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

חלקיקים מגנטיים-DNA מחייב ניתוח לפי פיזור אור דינאמי, Electrophoretic

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...