Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SW (DFG WA 2804) y una beca universitaria a SW en el Centro de Investigación Experimental y Clínica, una colaboración del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular y la Facultad de Medicina Charité de Berlín. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. Agradecemos al Sr. Robert Westphal para el apoyo técnico durante su internado en nuestro laboratorio.

Todos los animales procedimientos deben ser aprobados por el comité local institucional bienestar de los animales antes de la ejecución. Durante las mediciones de RM un nivel adecuado de anestesia y monitorización fisiológica (temperatura corporal, la frecuencia respiratoria) son requisitos indispensables. 1. Generación de hueso de médula de ratón derivados de células dendríticas <ol><li> Extraer células de médula ósea de ratones C57BL / 6 ratones como se describió previamente 12. Este protocolo se remonta a 1992 13 y fue descrito originalmente por el grupo de Ralph M. Steinman (1943-2011), descubridor de la célula dendrítica 14. </li><li> Brevemente, se extrae la tibia y el peroné poco después de sacrificar los ratones. Trabajando bajo la campana de flujo laminar (para evitar la contaminación microbiana), enjuagar la médula ósea en una pequeña placa de Petri con medio de lavado (5% de FBS, HEPES 1% de penicilina / estreptomicina y 1% en RPMI) 12. </li><li> Transferir la suspensión celular a través de una estra célulainer (100 micras de malla, nylon) en un tubo de centrífuga estéril de 50-ml con el fin de retirar el hueso y el tejido sobrante. Después de varias etapas de lavado y un 12 lisis de paso, contar las células viables usando azul de tripano y un hemocitómetro a. </li><li> Volver a suspender las células de médula ósea a una concentración de 400.000 células ml -1 en medio de cultivo (RPMI suplementado con FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, HEPES 1% y 1% de L-glutamina) que contenía 75 ng ml -1 del ratón granulocitos macrófagos factor estimulante de colonias (MGM-CSF) obtenido a partir de sobrenadantes de 293FT células HEK transfectadas con un plásmido GMCSF ratón. Transferir 10 ml de suspensión celular (4 x 10 6 células) en placas Petri (100 mm x 20 mm) y se incuban en una incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). El día 3, reponer el medio viejo con 10 ml de medio fresco (manteniendo la concentración final de mGM-CSF a 75 ng ml -1). El día 6, eliminar 10 ml de medio viejo y reponercon 10 ml de medio fresco (MGM-CSF concentración final = 75 ng ml -1). El día 8, eliminar 10 ml de medio viejo y reponer con 10 ml de medio fresco (MGM-CSF concentración final = 150 ng ml -1). </li><li> El día 10, el DC madurar diferenciada con 1 mg ml -1 lipopolisacárido (LPS) durante 24 horas. </li></ol> 2. El marcaje de las células dendríticas con 19 F-partículas ricas <ol><li> Durante la etapa de maduración hr 24 (1,5), la etiqueta de la DC con 1 mM flúor-rico perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) partículas (500-560 nm) también durante 24 horas. Preparar grandes partículas marcadas con flúor por emulsificación de PFCE en Pluronic F-68 (volumen total 2,5 ml) utilizando un sonotrodo celular interrumpiendo titanio y empleando un programa de pulso continuo (100% de amplitud, potencia = 250 W) durante 60 seg. </li><li> Después de las etapas de incubación anteriores, cosechar el maduro y flúor etiquetados-DC usando un raspador de células de cultivo de tejidos, transferencia en un tubo de centrífuga de 50-ml y centrifugara 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Para lavar cualquier partícula de restos y células muertas, deje células recolectadas a adherirse en poli-L-lisina platos. Para prepararse para este paso, capa placas de Petri con poli-L-lisina (1 mg ml -1) a 37 ° C durante 1 hora, después lavar el no unido poli-L-lisina con PBS. </li><li> Incubar por encima de las células cosechadas en las placas de poli-L-lisina en medio libre de suero y permitir que las células se adhieran (1 hora a 37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Lavar el medio para desechar las células no adheridas, partículas restantes y las células muertas y se lava tres veces con pre-calentado (37 ° C) PBS. </li><li> Cosecha de células adherentes por la tripsina-EDTA tratamiento (0,25% de tripsina-EDTA, 3 min de incubación a 37 ° C). </li><li> Después de otro paso de centrifugación lavado, resuspender la cantidad requerida de DC maduras en suero libre de PBS estéril. </li><li> Para determinar si las células han sido correctamente etiquetada, se recomienda comprobar la physicocheMical características de las células por medio de citometría de flujo (FACS). La dispersión lateral (SSC) debería revelar un aumento de la granularidad en estas células, como se ha descrito previamente 11. Debe también tenerse en cuenta que los fibroblastos pueden contaminar los cultivos de corriente continua y también podría llevar hasta los 19 partículas F en paralelo. Por lo tanto la pureza DC debe evaluarse (por la medición del porcentaje de CD11c + CD11b + células usando FACS) antes de la aplicación in vivo. </li></ol> 3. Aplicación in vivo de 19 F-etiquetados células dendríticas <ol><li> Administrar DC (06 10-julio 10) en un volumen de 50 a 100 l intracutánea en las extremidades traseras de un ratón C57BL / 6 colocando el ratón en un soporte y cuidadosamente inserción de una aguja G 26 ½ en las capas superiores de la piel antes de la aplicación (uso jeringas de tuberculina 0,5 ml con agujas permanentemente conectados a reducir al mínimo el volumen muerto). Para asegurar unan aplicación intracutánea adecuado, es importante que la parte insertada de la aguja sea parcialmente visible debajo de la piel. Si la aguja no es ya visible, la aguja se ha insertado demasiado profundo en las capas de la piel. Para el individuo no entrenado, la aplicación intracutánea podría realizarse bajo anestesia. </li><li> Imagen de los miembros de flúor en vivo (19 F) / protón (1 H) MRI (véase la sección siguiente) 21 hr inyección siguiente. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H resonancia magnética Las instrucciones detalladas para la configuración de las exploraciones de RM se refieren a un escáner Bruker MR utilizando el software de control Paravison (versión 5.1). Los nombres que se refieren a las funciones específicas de los proveedores y los elementos se han destacado en letra cursiva. Para otros escáneres MR estos pasos pueden tener que ser ajustados de acuerdo con las directrices de los fabricantes. <ol><li> Organizar el acceso a un dedicadoanimal pequeño MR escáner. Para una calidad de imagen adecuada, un sistema con una intensidad de campo magnético de 9,4 Tesla o más y adaptado de bobinas de radiofrecuencia (por ejemplo, 1 H / F 19 de doble bobina de RF sintonizable volumen, 35 mm de diámetro interior, 50 mm de longitud; Rapid Biomed, Würzburg, Alemania) se recomiendan. </li><li> Antes de la resonancia magnética, preparar la instalación del escáner MRI para anestesia y monitorización fisiológica. Asegúrese de que la máscara de respiración del animal cama / soporte está conectado al sistema de isoflurano y que la sonda de temperatura y la almohadilla de respiración están conectados a un sistema animal de monitorización remota (por ejemplo, modelo 1025, SA Instruments Inc., Nueva York, EE.UU.). Este último sirve para monitorizar los parámetros vitales del animal, tales como la temperatura del cuerpo y la respiración. </li><li> Anestesiar a ratones por narcosis por inhalación usando una cámara de ratón conectado a un sistema de isoflurano. Ajuste el caudal de aire y O 2 a 0,2 L min -1 y 0,1 L min -1, respectivamentey 3% de isoflurano (ajustar de un vaporizador) por alrededor de 2 min hasta que el nivel deseado de anestesia se alcanza (no pellizco respuesta dedo siguiente). Las tasas óptimas de flujo puede variar dependiendo de la configuración que se utiliza. Tenga en cuenta que las altas tasas de flujo puede conducir a la deshidratación. Monitoreo cuidadoso de las condiciones de los animales se requiere en todo momento como se mencionó anteriormente. </li><li> Coloque el ratón boca abajo en la cama ratón / titular del animal pequeño MR escáner (Figura 1). </li><li> Mientras se mantiene la velocidad de flujo de aire y O 2 constante, ajustar el vaporizador de isoflurano al 0,8 - 1,5% hasta un patrón de respiración óptima se alcanza. Una frecuencia respiratoria de 50 a 70 respiraciones por minuto se recomienda. </li><li> Mantener la temperatura corporal a 36-37 ° C durante el experimento mediante el empleo de un agua caliente (o alternativamente aire caliente) sistema de circulación. </li><li> Mantener los ojos del ratón húmedo con ungüento lubricante estéril ojo durante la medición. </li><li> Después de asegurar que el animalen el soporte de imágenes y las conexiones con el sistema de supervisión, mover el soporte hasta el centro de la 1 H / 19 F bobina de RF (que se coloca en el isocentro del imán escáner animal). </li><li> Ajuste de la posición del ratón de tal manera que la rodilla se encuentra dentro del isocentro del imán, ya sea con un método automatizado (por ejemplo, utilizando un láser de posicionamiento en combinación con un soporte de animales accionado por motor) o manualmente por el cálculo de la distancia del soporte necesita ser movido en el imán para alcanzar el isocentro. </li><li> Para confirmar la correcta colocación del animal en el escáner y la posterior planificación de la geometría de corte de imagen (es decir, tamaño, posición y rotación en el espacio), adquirir explorar imágenes en tres orientaciones estándar (axial, coronal, sagital) utilizando la imagen de resolución rápida y de bajo métodos de adquisición (por ejemplo TriPilot protocolo, que utiliza una secuencia de pulsos FLASH). </li><li> Sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia 1 H (por ejemplo,. 400,1 MHz para 9,4 T) y a la frecuencia de resonancia F 19 (por ejemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) y que coincida con la impedancia característica de la bobina a 50 Ohm utilizando el monitor de sintonización del escáner animales MR. Sintonización y de coincidencias es necesario para lograr las condiciones óptimas para la transmisión y recepción de la señal. </li><li> Realizar los ajustes necesarios automáticas del sistema, incluyendo cuñas para ajustar la homogeneidad del campo magnético (por ejemplo ADJ_SHIM), los ajustes del sistema de frecuencia para sintonizar la RF a la frecuencia de Lamor el ratón (por ejemplo ADJ_SF) y la ganancia de referencia para ajustar la amplitud de RF ( por ejemplo ADJ_REFG). Todos estos parámetros son importantes para hacer que los campos magnéticos estáticos y variables (B 0, B 1) en la región de interés lo más homogénea posible. </li><li> Adquirir un segundo conjunto de imágenes Scout (como anteriormente) a lo largo de las tres orientaciones ortogonales, después de ajustar el campo de visión (FOV) de tal manera que los dos miembros inferiores are visible desde la pelvis hasta los pies (LxAxH = 50x25x25 mm). Estas imágenes sirven para planificar las orientaciones de los últimos scans 3D F 1 H / 19. </li><li> Establecer un protocolo TurboRARE 3D por 1 H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Factor RARE = 16 (. Aprox tiempo de exploración de 60 min). Ajustar FOV con la ayuda de las imágenes de scouts, inicie el escaneo (semáforo). </li><li> Carga de un solo pulso FID-secuencia con un TR de al menos 1.000 mseg. Abra Scan Editar y establecer núcleo a 19 F. Utilice la configuración manual de ganancia, desmarca la ganancia de referencia automático en el método de edición del cuadro de herramientas. </li><li> Iniciar la medición sin el registro de datos para mostrar una señal de RM en tiempo real mediante el uso de GSP (ir de configuración). Si la señal F 19 espectral dentro de la ventana de adquisición es demasiado bajo, añadir más promedios en el método de edición y / o modular el pulso atenuador (TX0 o deslizador SP0) hasta un SIgnal es claramente visible. Ajuste la frecuencia básica con el fin de centrar el pico espectral F 19 a 0 Hz en la ventana de adquisición. Aplicar frecuencia básica y pulse Stop. Tenga en cuenta que el isoflurano utiliza como anestesia puede generar una señal de fondo. A 9,4 Tesla MRI del desplazamiento químico entre los 19 que contienen F-partículas y el isoflurano es de aproximadamente 1.800 Hz. Asegúrese de que el ancho de banda de excitación es menor que 3.600 Hz para evitar la emocionante junto con isoflurano las células F-19 marcadas o partículas. La frecuencia básica debe establecerse correctamente en la señal generada por las células F-19 marcadas. Alternativamente, otro método de la anestesia podría ser utilizado como el experimentador crea conveniente. </li><li> Clone (duplicar) el protocolo TurboRARE 3D desde el anterior análisis 1 H. Vaya a Edición Método y anule la selección de la ganancia automática de referencias (como el anterior). Set 19 F núcleo de Edit Scan. Cambiar la matriz de 128x64x64y el. RARAS Factor de por lo menos 40 (hasta 64) Para una mseg TR / TE 1000/6 y 64 promedios, el tiempo de ciclo es de aproximadamente 70 min. Ajuste la ganancia del receptor al 101 (caja de herramientas) e inicie el escaneo sin necesidad de ajustes adicionales utilizando GOP (ir pipeline). </li><li> Cuando los análisis terminado retraer el soporte de ratón desde el escáner de MR. Desconectar el ratón cuidadosamente del soporte. Si el ratón no se sacrifica para el análisis ex vivo (por ejemplo, la histología o la espectroscopia, ver más abajo) directamente después de las mediciones RM, vigilar de cerca hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. Regulación de la temperatura del cuerpo se ve afectado por la anestesia, así que durante el proceso de recuperación, poner el ratón en una jaula separada que se coloca en una tibia de temperatura regulada almohadilla. Una vez que el ratón se ha recuperado totalmente de la anestesia, devolverlo a su jaula explotación ya la sala de animales. </li><li> Para superponer las 19 imágenes de F a H 1 imagenes, utilice el menú Ver opción en el mismo software (Paravison). La función Underlay se puede encontrar bajo correlativas. Guarde el documento de base, cargar la nueva imagen y destacar la capa F 19, definiendo un nuevo color de la tabla de consulta. Para discriminar entre los 19 F y 1 exploraciones H, alterar el umbral para el color seleccionado (corte tabla de consulta) de tal manera que la señal F 19 tendrá el color elegido y el fondo 1 H imagen permanecerá en escala de grises. Otros programas de post-procesamiento (por ejemplo, ImageJ) están disponibles para crear las 1 H / F 19 superposiciones de imágenes. </li><li> En caso de una cuantificación in vivo de la señal F 19 ser necesario, siga un protocolo simple cuantitativo como se ha descrito anteriormente 15,16. En breve, la cuantificación puede realizarse mediante la colocación de un tubo de referencia con una concentración conocida de PFCE-Emulsión dentro del FOV al lado del ratón. Tras la adquisición de las imágenes de RM, quantificar las intensidades de las señales 19 F usando región de interés (ROI) y comparar con la curva de calibración en vitro como se muestra en la Figura 2. </li></ol> 5. Nodo linfático Espectroscopia de Resonancia Magnética (MRS) <ol><li> Después de sacrificar el ratón, quite el ganglio linfático poplíteo y el lugar en un pequeño tubo de RMN de 5 mm y añadir 100 ml de 2% PFA. </li><li> Instalar una bobina F 19 espectroscopía (por ejemplo, una bobina toroidal) que tiene una abertura de al menos 5 mm para sujetar el tubo de RMN que contiene el ganglio linfático. </li><li> Colocar el tubo de RMN en el interior de la bobina y mover la bobina en el isocentro del imán. </li><li> Sintonizar la bobina de RF a la frecuencia de resonancia F 19 (por ejemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) y que coincida con la impedancia característica de la bobina a 50 Ohm utilizando el monitor de sintonización del escáner animales MR. Sintonización y de coincidencias es necesario para lograr las condiciones óptimas para la transmisión y la señalrecepción. </li><li> Establezca todos los parámetros calza dentro de la caja de herramientas Nivelación a 0 y pulse Aplicar. Normalmente no es necesario aplicar métodos Shimming ya que el volumen de la muestra es relativamente pequeña. Si una señal suficiente 19 F está disponible, los métodos automatizados se puede aplicar para la frecuencia calzando sistema, y la ganancia del receptor como se describió anteriormente. </li><li> Carga de un solo pulso secuencia FID con un TR de al menos 1.000 mseg. Abra Editar Scan y establecer el núcleo a 19 F. Utilice la configuración manual de ganancia, desmarca la ganancia de referencia automático en el método de edición del cuadro de herramientas. Establecer el número de promedios a 1. </li><li> Inicie la secuencia utilizando SGP. Si la señal F 19 espectral dentro de la ventana de adquisición es demasiado bajo, añadir más promedios en el método de edición y / o modular el pulso atenuador (TX0 o deslizador SP0) hasta que una señal es claramente visible. Ajuste la frecuencia básica a fin de que la 19 F espeCtral pico está en el centro de la ventana de adquisición en 0 Hz y aplicar frecuencia básica. Ajuste el atenuador de pulso de nuevo para maximizar la señal, para llegar a 90 ° excitación. Cuando la señal es en la parada máximo de la máquina. </li><li> Establecer los promedios en el método de edición entre 64 y 256 (o más si es necesario, dependiendo de la señal) y comenzar la adquisición utilizando GOP. La señal detectada se correlaciona linealmente con el número de promedios. Durante cuantificación tener en cuenta que la señal detectada debe ser normalizado a uno promedio. Además, un estándar de calibración de una concentración conocida o una curva de calibración es necesario calcular el número de células a partir de la señal normalizada F 19 (Figura 2). </li><li> Una vez que la exploración haya terminado, retire la muestra, coloque la siguiente muestra y continúe con el paso 5.3. </li></ol>

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M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy.">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).</li><li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Este método de emplear 19 F / 1 H RMN para seguir el desplazamiento de CC en el nodo de linfa ofrece la oportunidad de estudiar los patrones de migración de las células inmunes in vivo. Las células dendríticas son excelentes ejemplos de la rápida migración de las células inmunes que son capaces de maniobrar a través de las estructuras tridimensionales sin fuertemente adherido a sustratos específicos 17. Aunque la baja resolución espacial (rango de micras) de la técni...

El rastreo de las células in vivo es un aspecto crucial en varios campos de la biomedicina. Para ello, las técnicas de imagen no invasivas que selectivamente puede localizar células en un período de tiempo son extremadamente valiosos. Antes del desarrollo de tres dimensiones de imágenes de resonancia magnética (MRI), el seguimiento de la migración de células inmunes se limitan a los análisis microscópicos o biopsias de tejidos. Seguimiento de la célula con la ayuda de resonancia magnética ha ganado la atención inmenso en los últimos años, no sólo para los inmunólogos que estudian el comportamiento celular inmune in vivo, sino también para los investigadores clínicos y de células madre. Durante mediados de los 90, los primeros estudios sobre el óxido de nanopartículas de hierro 1 inició una cascada de acontecimientos para que las células de seguimiento con IRM. Partículas de óxido de hierro acortar el tiempo de relajación MR (T2 *) de las células marcadas y por lo tanto causar el agotamiento de la señal en imágenes de RM. Partículas de óxido de hierro se han empleado para la etiqueta 2 macrófagos, p oligodendrocyterogenitors 3 y muchos otros tipos celulares. Algunas de estas partículas también han sido clínicamente aprobado por la FDA para el etiquetado de vacunas celulares en 4 pacientes con melanoma. Dado que in vivo o ex vivo etiquetado de las células con partículas de óxido de hierro se basa en un acortamiento de la señal * T2 y el segundo podría ser también provocada por in vivo relacionados con la susceptibilidad-T2 * efectos tales como hemorragias, micro depósitos de hierro, o burbujas de aire, podría ser difícil de identificar células marcadas in vivo de fondo otro T2 * extinciones de señal 5. En este artículo, se describe una técnica para el seguimiento de las células dendríticas (DC) in vivo mediante el empleo de 19 F / 1 H formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Esta tecnología de rastreo celular se introdujo en 2005 6, varios años después de las primeras aplicaciones reconocidas para 19 F en la RM se habían notificado 7. Una importante Advantage de 19 F sobre el etiquetado de óxido de hierro de células de partícula es la baja aparición biológica de 19 F en el tejido, lo que hace posible el seguimiento de las células de forma muy selectiva con imágenes básicamente libres de fondo-. Además, es posible superponer la señal de MR 19 F a partir de las células trasplantadas etiquetados con imágenes anatómicas obtenidas de RM convencional 1H. 19 F / 1 H RMN es por lo tanto considerablemente relevantes para los estudios que investigan la migración celular in vivo. Células estudiadas con este método se etiquetan con 19 F-partículas ricas. Perfluorocarbonos sintéticamente derivados (PFC) que consisten principalmente de carbono y átomos de flúor se utiliza comúnmente para preparar las partículas. Estos compuestos son insolubles en agua y deben ser emulsionado antes de la aplicación in vitro o in vivo. El tamaño habitual de las partículas de PFC que han sido empleados por otros grupos en vivo 19 F-RMN experimentos de seguimientooscila entre 100 nm y 245 nm 6,8-10. Sin embargo, hemos demostrado que la eficiencia en el etiquetado de las células dendríticas con perfluoro-15-corona-5-éter (PFCE) las partículas aumenta con el aumento del tamaño de partícula (&gt; 560 nm). 11

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REACTIVOS </td></tr><tr><td> C57BL / 6 ratones </td><td> Charles River, Berlin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco </td><td> 21875-091 </td><td></td></tr><tr><td> FBS Superior </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0615 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 15630-056 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> PFA </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-281692 </td><td></td></tr><tr><td> Perfluoro-15-corona-5-éter </td><td> ChemPur </td><td> 391 -1996 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-68 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P5556 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri (35 x 10 mm) </td><td> VWR, Alemania </td><td> 391-1996 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ jeringas G </td><td> VWR, Alemania </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> Tamices de nylon de malla de células (100 micras) </td><td> VWR, Alemania </td><td> 734-0004 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de RMN </td><td> VWR, Alemania </td><td> 634-0461 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Herramientas de disección </td><td> FST </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubadora </td><td> Carpeta </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pequeños animales MR sistema </td><td> Bruker Biospin </td><td></td><td> 9.4T BioSpec 94 / USR 20,Paravision Adquisición y Procesamiento de Software </td></tr><tr><td> 1 H / F 19 de doble bobina de RF sintonizable volumen </td><td> Rapid Biomed, Würzburg, Alemania </td><td></td><td> 35 mm de diámetro interior, 50 mm de longitud </td></tr><tr><td> 19 F bobina espectroscopia </td><td> en casa </td><td></td><td> sintonía / partido bobina de lazo, 4 vueltas, diámetro interno 5 mm, 10 mm de largo, dos condensadores de sintonización y la congruencia </td></tr><tr><td> Sistema de inhalación de isoflurano </td><td> Föhr Medical Instruments GmbH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monitoreo Animal sistema Modelo 1025 </td><td> SA Instruments Inc., Nueva York, EE.UU. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring dendritic cell migration using 19f / 1h magnetic resonance imaging

Continuos avances en las técnicas de imagen no invasivas, como la resonancia magnética (RM) han mejorado en gran medida nuestra capacidad para estudiar los procesos fisiológicos o patológicos en los organismos vivos. Resonancia magnética también está demostrando ser una herramienta valiosa para la captura de las células trasplantadas in vivo. Iniciales estrategias de etiquetado celulares para uso MRI hecho de agentes de contraste que influyen en los tiempos de relajación MR (T1, T2, T2 *) y conducen a una mejora (T1) o agotamiento (T2 *) de señal en la que están presentes las células marcadas. T2 * Agentes de mejora tales como agentes ultrapequeñas de óxido de hierro (USPIO) se han empleado para estudiar la migración celular y algunos también han sido aprobados por la FDA para su aplicación clínica. Un inconveniente de los agentes de T2 * es la dificultad de distinguir la extinción de la señal creada por las células marcadas de otros artefactos, como coágulos de sangre, hemorragias micro o burbujas de aire. En este artículo se describe una nueva técnica para el seguimiento de las células in vivo queestá basada en el etiquetado de las células con flúor (19 F)-partículas ricas. Estas partículas se preparan mediante emulsión de perfluorocarbono (PFC) y compuestos entonces se utiliza para marcar células, que posteriormente se pueden obtener imágenes por resonancia magnética F 19. Ventajas importantes de PFC para el rastreo de células in vivo incluyen (i) la ausencia de carbono enlazado a 19 F in vivo, lo que proporciona entonces libres fondo-imágenes y completo de células selectivityand (ii) la posibilidad de cuantificar la señal de la célula por espectroscopía 19 F MR .

Dieciocho a veintiún horas después de la aplicación intracutánea, 19 F-etiquetados células dendríticas (DC) migran hacia el ganglio linfático poplíteo de drenaje. El movimiento de DC a través de los conductos linfáticos en el ganglio linfático de drenaje politeal puede ser apreciado por una superposición de las imágenes 1 H anatómicas con las imágenes 19 F CC (Figura 2A). Hemos reportado previamente en la migración de estas células in vivo, así...

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Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor (<sup&gt; 19</sup&gt; Partículas F)-ricos, la aplicación in vivo de estas células, y para determinar el alcance de su migración a los ganglios linfáticos de drenaje con<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H RMN y<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

11.7K vistas.  A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine. El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor ( 19 Partículas F)-ricos, la aplicación in vivo de estas células, y para determinar el alcance de su migración a los ganglios linfáticos de drenaje con 19 F / 1 H RMN y 19 F MRS.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Investigación

Inmunología e Infección

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparación de la muestra de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

El análisis de la maduración pulmonar de células dendríticas y migración durante la inflamación de las vías alérgica

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Generación de una nueva vacuna de células dendríticas usando melanoma y células madre escamosas del cáncer

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...