La investigación es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones AI-52 381, CA138623 y Kentucky, el cáncer de pulmón Junta de Investigaciones y el apoyo institucional de James Graham Brown Cancer Center.

Metodología Descripción del Microscopio Experimentos en vivo de imágenes de células realizó con TE-FM Epi-Fluorescencia sistema conectado al microscopio Nikon Eclipse TE300 invertido. El microscopio equipado con fase de calentamiento. Un fresco presión HQ digitales B / W CCD (Roper científico) de la cámara y LAMDA 10.02 óptico cambiador de filtros (compañía de Sutter instrumento) se une al microscopio. Longitudes de onda de excitación y emisión se controla con ruedas de filtros y control de Lamba 02.10 controlador rueda de filtros, Sutter Instruments Co. Tiempo de exposición de 500 ms debería ser suficiente para ver la RFP o GFP en células vivas. Hardware de control y adquisición de imágenes se controlan por software Metamorph. La elección de los filtros para el presente estudio son, conjuntos de filtros S525/40m S480/20x y S565/25x, S620/60m de las buenas prácticas agrarias y RFP, respectivamente; EGFP / DsRed doble tecnología dicroica, Chroma. Esta rueda de filtros con capacidad para seis conjuntos de filtros. Microscopio se conecta con el controlador de una etapa anterior Proscan con joystick. Todos estos accesorios puede ser controlado por el software Metamorph. El microscopio también se adjunta con Micromanipuladores para mantener la micropipeta. A. Medición de los leucotrienos B 4 migración dirigida células dendríticas Usando el microscopio por encima del ajuste descrito, hemos desarrollado métodos para seguir ligando dirigido la migración de células dendríticas en tiempo real. Dos micromanipulador (Narishige) se unen al microscopio. La quimiotaxis de médula ósea de ratón a células dendríticas (BMDCs) a LTB 4 gradiente se registró. Aquí se describen los métodos para preparar las pipetas con micro-micro-pipeta extractor, la carga del ligando en micro-pipeta y la creación de la quimiotaxis experimento en el escenario con calefacción del microscopio para controlar la migración direccional de las células. Este método puede ser aplicado para probar la eficacia de los distintos factores quimiotácticos en la inducción de la migración, así como efecto de los inhibidores de la quimiotaxis en células vivas. El aislamiento de BMDCs 21 de ratón se ha descrito en varias publicaciones incluyendo JoVe 22. 1. Preparación de BMDCs <ol><li> El plato del BMDCs (después de un cultivo de 10 días) en el plato cubre-fluoro fondo y que puedan crecer durante 16 horas antes del experimento. </li><li> Se lavan las células con 3 ml de PBS 1X por lo menos 2 veces (mediante la adición de 3 ml de PBS 1X a la placa y de la aspiración del buffer). </li><li> Añadir 2 ml de 1XPBS a la placa. Las células están listas para el experimento. Mantener las células en 37 ° C incubadora antes del experimento. </li></ol> Preparación del ligando cargado micro pipeta: <ol start="4"><li> Fijar los tubos capilares de vidrio (vidrio estándar, de 0,75 mm x 0,4 mm, 6 &quot;, Cat # 625500, AM Systems, INC) en el eje vertical extractor micropipeta (Narishige Internacional de EE.UU., Inc). </li><li> Mantener la temperatura a 52 ° C y permitir que el vidrio se derrita y se separan para formar puntas afiladas borde. </li><li> Fijar la pipeta en el soporte de micro-pipeta. </li><li> Suavizar los bordes ásperos de las micro pipeta con Micro forjar M-900 (Narishige Internacional de EE.UU., Inc) observando al microscopio. </li><li> Prepare por lo menos 10-20 pipetas para cada experimento. Nota: Las micropipetas también se pueden comprar a partir de instrumentos de precisión Mundial (TIP μ, T1801TW1F). </li><li> Tener la concentración deseada (500 l de 100 LTB 4 nM en el experimento actual) del ligando en 1 ml del tubo effendorf y mantener la punta de micropipeta en la solución y permita que la solución para entrar en la micropipeta (rellenado). </li><li> Tomar 1 ml de ligando y en la jeringa (1 cc jeringa de tuberculina) y poco a poco llenar el ligando con Micro-Fill aguja (MF 28G-5, Instrumentos del Mundo de Precisión) en micro pipeta de arriba. </li><li> Conecte el tubo, lo que encaja perfectamente con la pipeta para pipeta y el tubo a la aguja (21 G 11 / 2) conectado a una jeringa de 1 ml, que se llena con el ligando. </li><li> Ahora, mueva con cuidado el ligando lleno de micro-pipeta para la platina del microscopio y fijar en micro manipuladores. </li><li> Aplicar muy poca presión de la jeringa para hacer ligando esté liberando lentamente de la punta. </li><li> Llevar el BMDCs inmaduros plateado para el microscopio y mantenerlos en la placa calentada (37 ° C) el escenario. </li><li> Retire la tapa de plato de flúor. </li><li> El enfoque de la lente de las células utilizando aceite de inmersión objetivo 60X. </li><li> Con cuidado, reducir el ligando cargado pipeta con &#39;Manual de Manipulador de grueso MN-188NE a la proximidad de las células. </li><li> El enfoque de la pipeta con &#39;Micromanipulador hidráulico Bellas MN-188 NE. </li><li> Aplicar muy poca presión de la jeringa para asegurarse de que está ligando la liberación en el plato. </li><li> Establezca los parámetros de adquisición de imágenes para la adquisición de brillantes presentado (10 ms de exposición) en cada 15 segundos durante 2 horas utilizando el software Metamorph. </li><li> Mantener la vigilancia cada 30 minutos por progression de la migración hacia el ligando. </li><li> Si las células están llenas de punta de la pipeta, cambiar la ubicación de la punta en el plato para continuar con la migración de experimento. </li></ol> B. Medición de GPCR (BLT1) y proteína citosólica (β-arrestina) Interacciones, translocación en las células vivas 1. Preparación de construcciones de ADN plásmido Los detalles de las construcciones de ADN plásmido se describe en Jala et al. (2005) 18. 2. Transfección de los Derechos Humanos BLT1-PP y β-arrestina-GFP en células RBL-2H3 <ol><li> Mantener la rata basófilos Leukomia (RBL-2H3) células (60 a 70% de confluencia) a 37 ° C en una atmósfera húmeda de aire del 95%, 5% de CO 2 como monocapas en medios de cultivo (DMEM suplementado con FBS al 15%, 2 mM L-glutamina, 100 U / mL de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina) en frascos T75. </li><li> Separar las células de la antena / frascos con 6 mL de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina, 0,53 mM EDTA) y el período de incubación de 5 min a 37 ° C en una atmósfera húmeda de aire del 95%, 5% de CO 2. Agitar suavemente los frascos para controlar el grado de desprendimiento de las células. </li><li> Agregar 6 ml de medio de cultivo al frasco que contiene 6 ml de tripsina-EDTA y recoger las células mediante la mezcla de ellos con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. Transferencia de las células en 15 ml tubos falcon. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro y tomar 4 x 10 6 células en tubos de 15 ml de centrífuga y centrifugar a 480 g rpm durante 3 min y se resuspenden en 200 l de los medios de transfección (DMEM, 20% de SFB, HEPES 50 mM). Si va a realizar 3 transfections, preparar las células y los medios de comunicación tranfection en consecuencia el número de células cada vez mayor y el volumen de medio de transfección. </li><li> Prepare los plásmidos que se transfectadas en las concentraciones de al menos 1,5 mg / mL. Preparamos el ADN del plásmido mediante el uso de ADN plásmido QIAGEN Maxi kit. Añadir el individuo o la codificación de ADN plásmido humanos BLT1-RFP (25 mg) y β-arrestin1 GFP-(15 mg) a cubetas de electroforesis estéril, (Bio-Rad # 16552088), que tiene 0,4 cm de distancia entre los electrodos. </li><li> Tome 200 l de las células se resuspendieron por encima y colocarlos en las cubetas que contienen hBLT1-RFP o β-arrestin1 GFP-o los dos juntos y mezclar suavemente con una pipeta mL estéril. </li><li> Dejar las cubetas arriba a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Electroporar las células de Gene Emisores II con la tensión de 250 V y capacidad de 500 mF. </li><li> Después de la electroporación que las células mantenerse a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Tomar 1 ml de medio de crecimiento normal y se mezcla con las células por electroporación en las cubetas. </li><li> Distribución de 300 l de esta mezcla en 35 mm platos de cristal de cultivo de tejido de fondo (plato de flúor, instrumentos de precisión Mundial) que contiene 2 ml de medio de cultivo habitual y se incuba durante 1 hora a 37 ° C en una atmósfera húmeda de aire del 95%, 5% de CO 2. Permitir que las células se adhieran a fondo del plato. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación después de 1 h de incubación con los medios de comunicación regular de crecimiento y les permite crecer a 37 ° C en una atmósfera húmeda de aire del 95%, 5% de CO 2 incubadora durante 18-24 horas. </li></ol> 3. Imágenes de células vivas Adquisición de imágenes <ol><li> Después de 18-24 horas, lave el 2 células o 3 veces con 2 ml de agua tibia rojo fenol libre de RPMI con 10 mM HEPES, pH 7,55 (Agregue 2 ml de medio de calentamiento directamente a la placa y los medios de comunicación aspirado. Repita 2 o 3 veces). Añadir 1,8 ml de fenol caliente RPMI exento de rojo que contiene HEPES 10 mM. </li><li> Lugar de 30 mm de vidrio cubreobjetos de fondo placas de cultivo que contienen células RBL-2H3, transfectadas con hBLT1-PP y β-arrestin1-GFP en la platina del microscopio climatizada (37 ° C). </li><li> Recoger las imágenes de la celda con un aumento de 600x con objetivo Nikon 60 X Plan Apo 60X/1.4 aceite apertura numérica del objetivo de inmersión (disponible en nuestro sistema de microscopio). </li><li> Pon una gota de aceite en la lente objetivo 60 x y el enfoque de las células con campo claro regulares de luz transmitida por tocar el fondo de la placa. </li><li> Para controlar la fluorescencia de las proteínas transfectadas, cambiar de campo claro (luz transmitida) a filtros de fluorescencia (RFP filtro, si es que quieres ver o receptor de las buenas prácticas agrarias, si quieres ver β-arrestin1). </li><li> Elija la celda brillante y saludable, que expresa hBLT1-RFP en la superficie celular con RFP filtro y capturar la imagen. </li><li> A continuación, pasar a las buenas prácticas agrarias filtro y asegúrese de que β-arrestina-GFP se expresa en el citoplasma y la captura de la imagen. Luego color pseudo-tanto las imágenes, antes de tiempo transcurrido capturar imágenes de células vivas para asegurarse de que sangran a través de la fluorescencia no se está produciendo entre el PP y las buenas prácticas agrarias. </li><li> Una vez que la elección de su celda de hecho, establecer los parámetros de acuerdo a su propósito el uso de software (Software Metamorph en este caso). </li><li> En la manifestación actual, dieciséis bits de imágenes se adquieren con el vinora conjunto de intervalos de 1 X 1 en combinación con el Plan 60 X objetivo Nikon Apo 60X/1.4 aceite apertura numérica del objetivo de inmersión. </li><li> Recoger las imágenes de fluorescencia de GFP PP y fluorocromos simultáneamente en 30 segundos el intervalo de tiempo (si las interacciones translocación / son demasiado rápidos, se puede reducir los intervalos de tiempo) de estas ruedas con filtros controlados por el software Metamorph. </li><li> Los tiempos de exposición La cámara está ajustada a 1000 ms de RFP y las buenas prácticas agrarias. (Establecer los tiempos de exposición específicas de acuerdo a la intensidad de fluorescencia de RFP y las buenas prácticas agrarias). </li><li> En primer lugar recoger las imágenes durante 1 minuto sin la adición de ligando, que actúa como punto de tiempo 0. </li><li> Agregue el l 200 de ligando (a partir de un balance de 10 M a una concentración final de 1 mM) después de 1 minuto sin molestar a la placa / o la posición de la célula. </li><li> Las imágenes de fluorescencia se recogen durante 60 minutos después de añadir el ligando y se almacena como imágenes TIFF con el orden creciente de los nombres de archivo. </li><li> Todos estos archivos se pueden hacer como los archivos de la pila de imágenes de fluorescencia individual / combinado con marcas de tiempo con el software. </li></ol> Proceso de imágenes y la cuantificación de la fluorescencia de las proteínas y localización <ol><li> Adquirir las imágenes con papel normal (sin células) con filtros de PP y GFP fluorescentes y guardarlas como imágenes de fondo. Utilizar estas imágenes para restar a partir de imágenes de datos reales obtenidos anteriormente. </li><li> Prepare la pila de imágenes de forma individual para imágenes RFP y las buenas prácticas agrarias. </li><li> Seleccionar / definir las distintas regiones (vs superficie citosólica) para medir la intensidad de la fluorescencia de GFP y RFP (BLT1 y translocación β-arrestina) </li><li> Trace la intensidad de fluorescencia como la cantidad en función del tiempo. En este gráfico se proporcionará la información acerca de la cinética de la translocación de la molécula determinada. </li></ol> Resultados representante A. Medición de los leucotrienos B 4 migración dirigida células dendríticas El método descrito en este protocolo se utilizó para determinar la migración de células dendríticas hacia los leucotrienos B 4 (Figura 1 y el video adjunto 1) 21. Podemos aplicar la misma metodología para determinar la capacidad quimiotáctica de las células de un ligando particular en las células vivas. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Médula ósea de ratón con células dendríticas derivadas de migración hacia el 100 nM LTB 4. Video 1. Migración en vivo de células de BMDCs a LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">Haga clic aquí para ver el vídeo</a> . B. Medición de GPCR (BLT1) y proteína citosólica (β-arrestina) Interacciones, translocación en las células vivas Una vez finalizado este procedimiento, se puede obtener la siguiente información en los eventos de señalización de GPCR. <ol class="lroman"><li> La localización de los GPCR y proteínas citosólicas y el núcleo (Figura 2). </li><li> Inducida por ligando la interacción de la superficie de GPCR (BLT1 en este caso) con la proteína citosólica (β-arrestina en este caso) (Fig. 3). </li><li> Cinética de internalización del receptor y translocación de β-arrestina a la membrana seguido de la internalización, junto con los receptores (Figura 4) (Jala et al. 2005) 18. </li><li> Se puede determinar el ligando dependiente estado de activación de los receptores en las células vivas (que se adjunta video 2) y determinar los motivos críticos o procesos involucrados en la activación de los receptores (Jala et al. 2005) 18. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Expresión de BLT1-RFP (A), β-arrestina-GFP (B), pNuc PPC-(C) en células RBL-2H3. Color combinado imagen que se muestra en el panel D. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Translocación inducida por ligando del receptor y β-arrestina. Análisis de la línea de intensidad de fluorescencia en las células se muestran. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Cinética de la internalización del receptor y translocación de β-arrestina con la adición de 1 mM LTB 4. La intensidad de fluorescencia se mide en función del tiempo en la membrana y citosólicas lugares de la célula. Video 2 imágenes en vivo de las células que expresan BLT1-PP y β-arrestina-GFP en la adición de 1 mM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">Haga clic aquí para ver el video</a>

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Imágenes de células vivas es una poderosa herramienta para demostrar la función y las interacciones de las proteínas específicas que se producen en tiempo real. Los métodos descritos en este manuscrito muestra claramente que LTB 4 puede inducir una rápida migración de las células dendríticas. Estos métodos no sólo ampliar los aspectos de LTB 4 en función de diversos tipos de células, que permiten a los mismos métodos que se aplican a una variedad de otras quimiocinas y pruebas de su ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell lines:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

Receptores acoplados a proteína G (GPCR) pertenecen a la familia de proteínas transmembrana siete y mediar en la transducción de señales extracelulares de respuestas intracelulares. GPCRs control de diversas funciones biológicas como la quimiotaxis, la liberación de calcio intracelular, regulación de los genes de una manera dependiente de ligando a través de heterotrimeric proteínas G 1-2. Unión del ligando induce una serie de cambios conformacionales que conducen a la activación de heterotrimeric G-proteínas que modulan los niveles de segundos mensajeros como el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), inositol trifosfato (IP3) y glicerol diacil (DG). Concomitante con la activación de la unión del ligando del receptor también inicia una serie de eventos para atenuar la señalización del receptor a través de la desensibilización, el secuestro y / o internalización. El proceso de desensibilización de GPCRs se produce a través de la fosforilación de los receptores de las quinasas del receptor de la proteína G (GRKs) y posterior unión de β-arrestins 3. β-arrestins son proteínas citosólicas y trasladar a la membrana de la activación de GPCR, la unión a receptores fosforilados (la mayoría de los casos) que, al facilitar la internalización del receptor 6.4. Leucotrieno B 4 (LTB 4) es una molécula pro-inflamatoria lípidos derivados del ácido araquidónico vía y media sus acciones a través de GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1, un receptor de alta afinidad) y LTB 4 receptor 2 (BLT2, un receptor de baja afinidad ) 7-9. El LTB 4 BLT1 vía ha demostrado ser crucial en varias enfermedades inflamatorias, entre ellas, el asma, la artritis y la aterosclerosis 10-17. El presente documento describe las metodologías desarrolladas para controlar LTB 4-inducida por la migración de leucocitos y las interacciones de BLT1 con β-arrestina y translocación de los receptores en las células vivas mediante técnicas de microscopía 18-19. La médula ósea procedentes de células dendríticas de ratones C57BL / 6 fueron aisladas y cultivadas como se describió anteriormente 20-21. Estas células se pusieron a prueba en vivo de imágenes de células métodos para demostrar LTB 4 migración celular inducida. El BLT1 humanos fue etiquetado con la proteína roja fluorescente (RFP BLT1-) en el C-terminal y β-arrestin1 etiquetados con una proteína fluorescente verde (β-arr-GFP) y se transfectaron los plásmidos, tanto en rata basófilos Leukomia (RBL-2H3) las líneas celulares 18-19. La cinética de la interacción entre estas proteínas y la localización se controlaron mediante microscopía de vídeo en directo de la célula. Las metodologías en el presente documento describe el uso de técnicas de microscopía para investigar las respuestas funcionales de los receptores de la proteína G de acoplamiento en las células vivas. El presente documento también describe el uso de software Metamorph para cuantificar la intensidad de fluorescencia para determinar la cinética de los receptores y las interacciones de las proteínas citosólicas.

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

Este trabajo describe la metodología para determinar la respuesta quimiotáctica de los leucocitos a ligandos específicos e identificar las interacciones entre los receptores de superficie celular y proteínas citosólicas utilizando técnicas de imagen en vivo de la célula.

Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K vistas.  University of Louisville. Este trabajo describe la metodología para determinar la respuesta quimiotáctica de los leucocitos a ligandos específicos e identificar las interacciones entre los receptores de superficie celular y proteínas citosólicas utilizando técnicas de imagen en vivo de la célula.

Video: Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Investigación

Inmunología e Infección

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...