EJV es apoyado por una beca de la enfermedad de Crohn s &amp; Colitis Foundation of America (CCFA). JRM es apoyado por becas de CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) y Premio a la Innovación Nuevo director del NIH, s.

1. Ex generación in vivo de células T del intestino-homing y control (ver Figura 1) <ol><li> Aislar esplenocitos por maceración un bazo de ratones de tipo salvaje. Resuspender la suspensión de las células en PBS y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Eliminar el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por la resuspensión del sedimento de células en 4 ml de solución amortiguadora de lisis ACK durante 2-3 minutos. Después de eso, añadir 5 ml de PBS. Centrifugar durante 5 &#39;a 400 xg y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender esplenocitos totales de 1 x 10 6 / ml en IMDM + 10% de SFB + 50 mM 2-mercaptoetanol + penicilina / estreptomicina (IMDM completo). Separar las células en dos grupos, uno de los cuales se complementa con AR (RAR o sintético-agonistas, como Am80 o Am580) a una concentración final de 100-200 Nm 3. Las células T activadas en la presencia de RA o RAR-agonistas se upregulate a4b7and CCR9 y se convertirá en trópico intestinal de células T, mientras que las células T activadas sin la AR se convierten en células T de control. </li><li> Agregar 1,5-2,0 ml de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 24 pocillos previamente recubiertas con anti-CD3 (10 mg / ml) y anti-CD28 (10 mg / ml) y se incuba a 37 ° C en 5% CO 2 (para el recubrimiento de la placa de 500 ml / pocillo de anti-CD3 más anti-CD28 en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ˚ C y lavar dos veces con 2 ml de PBS). </li><li> Con el fin de evitar la sobreestimulación de las células T, después de 2-3 días la transferencia de las suspensiones de células en una nueva sin recubrimiento de 24 pocillos. Incubar durante otros 2-3 días. Dependiendo de la densidad celular y la proliferación de los medios de comunicación puede convertirse en ácido (amarillo), en cuyo caso podría ser necesario para reemplazar la mitad de los medios de comunicación con IMDM completo fresco. Recoger las células después de 4-5 días (a contar desde el día 0). </li><li> Típico de los rendimientos finales son 1.2 x 10 6 células T efectoras / bien. Por lo tanto, un mínimo de 12.9 de cada uno de los pozos de las células intestinales trópico-T y las células T de control debe ser recubierto con el fin de terminar con 10-20 x 10 6 células T en cada condición. </li></ol> 2. Análisis de la tripa-homing los receptores de las células T activadas Después de 4-5 días de cultivo se debe observar una alta expresión de la tripa-homing a4b7and CCR9 receptores en las células T activadas en la presencia de los agonistas de RA o RAR, mientras que el control de las células T que expresan niveles muy bajos de estos cuatro receptores. La citometría de flujo (FACS) el análisis. <ol><li> Recoger entre 0,2-0,5 x 10 6 células y centrifugar durante 5 minutos a 300 g a 4 ° C. </li><li> Se incuba con anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) y anti-CD8 PerCP por 15 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Después de la incubación, centrifugar durante 5 min a 300 g 4 ° C. Lavar y volver a suspender las células en buffer de tinción y análisis por FACS. </li></ol> 3. T marcado de células con seguidores de células CFSE y CMTMR <ol><li> Mantenga todas las soluciones a 37 ° C antes de comenzar. Lavado de estómago-trópico células T (a4b7 alta CCR9 alta) y el control de las células T (a4b7 Baja / Neg CCR9 Baja / Neg) dos veces con PBS para eliminar el suero. Ajustar la concentración de células T de 10.15 x 10 6 / ml en PBS. </li><li> Añadir CFSE (carboxifluoresceína succinimidil éster) o CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluoróforos a cualquiera de intestino-trópico de células T y T el control a una concentración final de 5 mm y 10 mm, respectivamente, suavemente vortex e incubar durante 20 minutos a 37 ° C. Se recomienda cambiar los etiquetados en el mismo o en otro experimento con el fin de excluir posibles efectos intrínsecos de fluoróforos en la migración de células T. </li><li> Después de la incubación, apagar con un volumen de FBS y se incuba durante 1-5 minutos a temperatura ambiente. Diluir 10 veces con PBS caliente y centrifugar durante 5 minutos a 300 g. Lavar dos veces con PBS y resuspender en IMDM completo. </li><li> Idealmente, 10-20 x 10 6 células T de cada población debe ser mezclado en una proporción de 1:1 y luego se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Por último, volver a suspender las células en 200-250 ml de PBS caliente y se inyecta a través de la vena de la cola. </li><li> Para calcular la proporción exacta de entrada (lo ideal es cercano a 1) salvar a 5-10 ml de la suspensión de células inyectadas y se diluye con 300 ml de PBS y analizar por FACS. </li></ol> 4. El análisis de células T homing Aunque los ratones pueden ser analizados en diversos puntos de tiempo (entre 1 hora y después de varios días de la inyección de células T), mensajeras de las células intestinales trópico-T es la mejor documentada entre 12-24 h después de la inyección. Ya los puntos de tiempo aumentar los posibles efectos de otras variables que afectan el número final de células / relaciones, como la apoptosis de las células T y la salida de las células T de los tejidos. Después de los ratones son suspensiones eutanasia, células de diversos tejidos deben ser aislados de inmediato a fin de reducir la muerte celular, lo que podría afectar los rendimientos y resultados finales. Los tejidos de interés son el intestino delgado, colon, bazo, ganglios linfáticos, las placas de Peyer, hígado, pulmones y sangre. Si elinyectaron células T son de buena fe trópico intestinal de células T, que debe su casa, en promedio de 5-10 veces más (o superior) a la mucosa del intestino delgado, en comparación con el control de las células T. Sin embargo, otros tejidos, como la sangre y el bazo, no debe presentar una migración de las células T preferencial. Aislamiento de linfocitos de la lámina propia intestinal y el compartimiento intraepitelial se ha descrito anteriormente 5. <ol><li> Tinción FACS: Las muestras se resuspendieron en función del número de células recogidas, con una densidad no superior a 3,0 x 10 6 células / ml. Si congenic CD45.1 + o + Thy1.1 ratones fueron utilizados como receptores, las células se tiñen con el marcador correspondiente congenic (por ejemplo, o CD45.2 Thy1.2) en combinación con algún marcador linaje (por ejemplo, TCRbchain, CD4 y CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Durante el análisis de FACS, las células están separadas en el marcador congenic (por ejemplo, CD45.1) y luego en los marcadores de linaje específico (por ejemplo, CD4/CD8) y se analizó la relación entre las células CFSE CMTMR y positivo. </li><li> Los datos generalmente se expresa como el Índice de Homing (HI), que se calcula como el cociente CFSE / CMTMR (o CMTMR / CFSE) en cada tejido, dividido por el ratio de la entrada correspondiente (ver abajo). Si la relación de entrada es muy cercano a 1, las razones de tejido será equivalente a la HI. </li></ol> HI = CFSE tejido / tejido CMTMR: CFSE entrada / CMTMR entrada La sangre también deben ser analizados con el fin de determinar si las dos poblaciones de células T están igualmente representados en la circulación, o si una población de células T es menor respecto a los otros (por ejemplo, por la captura preferencial en los pulmones / el hígado o por disminución de la viabilidad). Esto puede ocurrir cuando se comparan las células de memoria ingenua o T en reposo en comparación con hace poco activa las células T efectoras, ya que estos últimos podrían quedar atrapados en mayor medida en los pulmones. Si el HI en la sangre es significativamente diferente de 1, se puede normalizar la HI en los tejidos por la HI en la sangre. La sangre se puede obtener a través de punción cardíaca de los ratones anestesiados (con la eutanasia avertina o isofluorano antes) y deben ser lisadas dos veces con tampón ACK antes de usarlo para la tinción FACS. Normalización de la sangre = HI tejido / HI sangre 5. Resultados representante Ratones receptores (Thy1.1 +) fueron post euthanized18h la inyección de células. Las suspensiones celulares fueron generados a partir del bazo, los ganglios linfáticos periféricos (PLN), los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y Propia pequeña lámina de intestino (LP). Después de que las células se tiñeron de Thy1.2 y CD8 y luego analizada por FACS de gating en viable Thy1.2 + células CD8 +, que fueron analizados por fin de la relación entre las células CMTMR + (trópico intestinal de células T) y la CFSE + las células (control de las células T) dividida por la relación de entrada. Los resultados se pueden visualizar como se muestra en la Figura 2, en el que se puede apreciar que el trópico intestino y el control de las células T alojados también en el bazo (HI cercano a 1, se indica con una línea roja). Por el contrario, trópico intestinal de células T emigraron alrededor de 10 veces más eficiente que el LP, en comparación con el control de las células T. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1:. Esquema de la generación y el etiquetado de los intestinos-trópico y no-gut células T trópico células T son aislados de los ratones de tipo salvaje y se activa con anti-CD3/anti-CD28 y en la presencia o ausencia de 100-200 nm todos - trans del ácido retinoico (RA). Después de 4-5 días la AR tratados con células T adquieren la expresión de receptores de intestino homing CCR9 y a4b7. Entonces, trópico intestino y el control de las células T son diferencialmente etiquetados con CFSE o CMTMR, lavado, mezclado en una proporción de 1:1 y se inyecta en un ratón receptor a través de la vena de la cola. Algunas células marcadas se utilizan para determinar la relación de entradas CFSE / CMTMR (debe ser cercano a 1). <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2:. Ratones Ejemplo de análisis de recalada analizado 12-18 h después de la inyección de células T y suspensiones de células individuales se obtienen de los órganos de interés. Las células se tiñeron con anti-Thy1.2 (marcador congenic), además de anti-CD8 y Thy1.2 + células T CD8 + se analizan para la relación de CMTMR + + y CFSE células en cada tejido por FACS. El tejido CMTMR / CFSE relaciones se normalizan por la entrada CMTMR / CFSE relación para obtener los índices de homing (HI). En este ejemplo CMTMR + y + CFSE células son intestino tropicales y control de las células efectoras T, respectivamente.

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	<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+Three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues.">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li><li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer's+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li><li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li></ol>

A pesar de que los experimentos homing proporcionar información muy valiosa acerca de la migración de la población total de células en un tejido determinado, se debe tener en cuenta que estos ensayos no analizan directamente de adhesión endoteliales y por lo tanto no discriminar en qué etapa (s) de la adhesión de varios pasos cascada (tethering / móvil, activación o pegue) un determinado receptor homing está actuando. El estándar de oro para definir el papel específico de los receptores de homing en la casca...

Animales: ratones C57BL / 6 se utilizan para el aislamiento de células T. Además, CD45.1 y Thy1.1 cepas congenic están disponibles a través Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los medios de cultivo: IMDM (medio modificado de Iscove Dulbecco + L-Glutamina + Hepes) más el 10% SFB inactivado por calor (bovino fetal endotoxina en suero, baja, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (antibióticos HyClone, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / anfotericina B (Gibco) y 50 mM b-mercaptoetanol. ACK Glóbulos Rojos tampón de lisis (RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), ajustar el pH a 7,2-7,4 y almacenar a temperatura ambiente). PBS (tampón fosfato salino, Hyclone, Waltham, MA). La citometría de flujo (FACS) los medios de comunicación (PBS o IMDM + 2% de SFB + 5 mM EDTA). Cuando la tinción con Selectina-Fc quimeras, los medios de comunicación con 2 mM de Ca + + se debe utilizar en todos los pasos (incluyendo la adquisición de FACS). IMDM se recomienda en este caso. T etiquetado celular y la transferencia adoptiva: CFSE (diacetato carboxifluoresceína, succinimidil éster), CMTMR ((5 - (y-6 )-((( 4-clorometil) benzoilo) amino) tetrametilrodamina) de Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1.000 acciones x debe hacerse en DMSO (5 CFSE mm, 20 mm CMTMR) y almacenados a -20 ° C. La activación policlonal de células T: 24 y 96 o bien placas (cultivo de tejidos tratados, de poliestireno, de fondo plano con tapa, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) se incuban durante 2 horas a 37 ° C con 50 ml de PBS, respectivamente , que contiene anti-CD3 además de los anticuerpos anti-CD28 (10 mg / ml cada uno). A continuación, las placas de cultivo se lavan dos veces con PBS y se utiliza inmediatamente para el cultivo de células T. Por otra parte, Dynabeads recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) se puede utilizar para la activación de células T en lugar de obligado placa de anticuerpos. Citometría de flujo (FACS) de tinción: la activación policlonal: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage MAB: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptores: purificada CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), control de isotipo (IgG2a, k). Homing la piel de los receptores: P-selectina-Fc (purificada ratón P-selectina - IgG proteína de fusión, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectina Fc (E-Selectin/Fc ratón recombinante quimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) más el correspondiente F secundario de cabra reactivo (ab &#39;) 2 anti-IgG humana R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ácido trans-retinoico (Sigma, St. Louis, MO) se vuelve a suspender en etanol absoluto o DMSO con una bombilla de color amarillo o una fuente indirecta de la luz durante la preparación. Alícuotas de almacenar en frascos de vidrio a -80 ° C y protegido de la luz en todo momento. RAR-agonistas sintéticos: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

competitive homing assays to study gut-tropic t cell migration

Con el fin de ejercer su función de linfocitos necesidad de salir de la sangre y migran hacia los diferentes tejidos del cuerpo. La adhesión de linfocitos a las células endoteliales y la extravasación de tejido es un proceso de múltiples pasos controlados por diferentes moléculas de adhesión (receptores homing) expresa en los linfocitos y sus respectivos ligandos (addressins) que aparecen en las células endoteliales 1 2. A pesar de que la función de estos receptores de adhesión puede ser parcialmente estudiado ex vivo, la prueba definitiva de su relevancia fisiológica es para evaluar su función en vivo en la adhesión de linfocitos y la migración. Dos estrategias complementarias se han utilizado para este propósito: la microscopía intravital (IVM) y los experimentos mensajeras. A pesar de IVM ha sido esencial para definir la contribución exacta de los receptores de adhesión específicas en la cascada de adherencia en tiempo real y en diferentes tejidos, IVM es mucho tiempo y mano de obra intensiva, que a menudo requiere el desarrollo de sofisticadas técnicas quirúrgicas, es necesario el aislamiento previo de homogeneidad las poblaciones de células y permite el análisis de un solo tejido / órgano en un momento dado. Por el contrario, la competencia experimentos homing permitir la comparación directa y simultánea en la migración de los dos (o más) subconjuntos de células en el mismo ratón y también permiten el análisis de muchos tejidos y de un elevado número de células en el mismo experimento. A continuación se describe el protocolo de la competencia clásica mensajeras para determinar la ventaja / desventaja de un tipo de célula a la casa a tejidos específicos, en comparación con una población de células control. Hemos elegido para ilustrar las propiedades migratorias de la tripa-tropical frente a las células T no destripar-trópico, debido a que la mucosa intestinal es la mayor superficie del cuerpo en contacto con el medio externo y es también el tejido extra-linfoides con los requisitos de mejor definidos migratorias . Por otra parte, trabajos recientes han determinado que la vitamina A metabolito ácido trans-retinoico (RA) es el principal mecanismo molecular responsable de la inducción al intestino receptores específicos de la adhesión (integrinas receptor de quimiocinas a4b7and CCR9) en los linfocitos. Por lo tanto, fácilmente puede generar un gran número de intestino tropicales y no tropicales los linfocitos al intestino ex vivo mediante la activación de células T en la presencia o ausencia de RA, respectivamente, que pueden ser finalmente utilizado en los experimentos competitivos homing se describe aquí.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K vistas.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Una evaluación cuantitativa de la migración celular mediante el ensayo de la canción Motilidad Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...