Este trabajo fue apoyado por un largo plazo beca EMBO (ABW), una Ciencia de la Fundación Internacional de Investigación Postdoctoral Fellowship Nacional (ABW), el Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), una beca DIGS-BB (AO), y el Consejo de Investigación Europeo, en las Comunidades Europeas del Séptimo Programa Marco STG-207634 (DS, ACO). Damos las gracias a Ravi Desai por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. También nos gustaría dar las gracias a la facilidad de expresión de la proteína MPI-CBG para la producción del fragmento de pez cebra Fibronectin1, el personal de las instalaciones de peces MPI-CBG para el cuidado y mantenimiento de nuestras líneas de pescado y las instalaciones de microscopía de luz MPI-CBG para el apoyo de imágenes.

1. Antes de la disección <ol><li> En el día antes de la disección, los embriones obtener a partir de un Incross de pares de pez cebra heterocigotos para el alelo transgénico. <ol><li> Levante embriones en medio E3 sin azul de metileno a 28 º C hasta la etapa de protección (6 horas después de la fecundación). </li><li> Transferencia de embriones en medio E3 sin azul de metileno al 20 o CO / N. A los 20 o C, los embriones se forman 1 somito por hora una vez que alcanzan la etapa tailbud. Después de 17 a 20 hr O / N a 20 º C, los embriones deben estar en 5 a 8 somite etapa a la mañana siguiente al inicio del protocolo de disección. </li></ol></li><li> Montar herramientas y reactivos necesarios para la disección. <ol><li> Pipeta de vidrio pulido al fuego para la transferencia de embriones y tejido </li><li> Par de pinzas finas para la eliminación de chorions a partir de embriones </li><li> Recubierto de Sylgard plato de 35 mm para la disección - Vierta polímero Sylgard en una placa de 35 mm y curar O / N en un 37 ° C. Hacer la disección bien utilizandouna punta de la aguja para extraer una pequeña cantidad de polímero curado. El plato se puede limpiar y reutilizar posteriormente. </li><li> Afilados, herramientas de alambre de tungsteno aplanados para la manipulación de tejidos PSM </li><li> Micro-bisturí para cortar piezas deseadas del PSM a la cultura </li><li> 35 mm de plato de plástico para la incubación de tripsina </li><li> Medio L15 que contiene suero bovino fetal al 10% </li><li> Solución de tripsina / EDTA 0,25% </li><li> Puntas de carga de gel Sigmacoted para la dispersión </li><li> Placas de Petri de plástico que contenían medio E3 sin azul de metileno. </li></ol></li><li> Cubrir el plato de imágenes de fondo de cristal con sustrato Fibronectin1 (10 g / ml en PBS). Deja el plato en el banco para cubrir durante la disección. </li><li> Utilice estereoscopio con filtros de fluorescencia apropiadas para identificar y embriones transgénicos tipo positivos (fase 5 a 8 somito). <ol><li> Identificar embriones transgénicos mediante el examen de la presomitic mesodermo (PSM) para la expresión de YFP bajo canal de fluorescencia (Figura 1A). Sho Fluorescenciauld ser visible en la región desde el último somito formada para la tailbud. Seleccionar embriones con la señal más brillante; 25% de la descendencia debería ser embriones homocigotos que llevan 2 copias del transgén. El número de embriones identificados necesarios varía en función de la experiencia. Una pieza tailbud diseccionado producirá 1.000 células, en promedio. Típicamente, unos pocos embriones positivos adicionales son útiles en caso de errores se realizan durante la disección. </li><li> Use luz transmitida como una referencia posicional para distinguir cualquier autofluorescencia, en particular en la célula de huevo, de la señal. </li><li> Transferencia de embriones positivos a una placa petri de plástico separada que contiene medio de E3 sin azul de metileno. </li></ol></li></ol> 2. PSM Disección y Dispersión <ol><li> Preparar embriones para la disección. <ol><li> Bajo un microscopio de disección, usando unas pinzas finas, retire con cuidado el corion de cada embrión a medio E3. Asegúrese de no dañar el embrión o interrumpir la célula huevo. </li&gt; <li> Llenar Sylgard recubiertos de disección plato con medio L15 con suero. El uso de pinzas u otra herramienta plana, eliminar las burbujas de aire de la superficie de la Sylgard. </li><li> Transferencia de embriones dechorionated utilizando la pipeta de vidrio pulido al fuego al plato de disección. </li><li> Usando las herramientas de alambre, mover todos los embriones a un lado del plato de disección. </li></ol></li><li> Diseccionar PSM de un solo embrión. <ol><li> Orient un solo embrión en su lado lateral en el pequeño pozo hecho en la capa de Sylgard en el plato de disección (Figura 1B). </li><li> Utilizando el micro bisturí, cortar a través del embrión y las células yema justo por delante de la parte posterior del cerebro y por el polo ventral del embrión (Figura 1B, línea roja punteada). </li><li> Retire la pieza anterior del embrión desde el pozo y hacer que pase a un lado del plato, y luego usar las herramientas de alambre para raspar restantes gránulos de células de la yema de la sección posterior incluyendo el PSM. </li><li>Una vez que la yema ha sido raspado, aplanar y orientar el PSM con el extremo anterior apuntando lejos del experimentador y la posterior apuntando hacia el experimentador (Figura 1C). </li><li> Si la fina capa de ectodermo no ha tirado fuera por este punto, utilice las herramientas de cable a pelar lejos de la parte superior del tejido PSM. </li><li> Uso de la micro-escalpelo cortó el tailbud, la punta más posterior del PSM allá del final de la notocorda, lejos del resto del tejido (Figura 1C, línea roja punteada). NOTA: Otras piezas de tejido del PSM, para PSM ejemplo anterior más cerca de la última somite formado, también se pueden tener en la cultura, dependiendo de la pregunta experimental. </li><li> Mover la pieza tailbud a una esquina del plato lejos de la zona de disección. Utilice las herramientas de alambre para limpiar los desechos y los tejidos de embriones no deseados desde el campo de disección. </li><li> Repita con el siguiente embrión. </li></ol></li><li> Piezas Piscina tailbud de múltiples embryos, dependiendo del número de células se requiere para el experimento. En promedio, una sola pieza de tejido tailbud produce 1.000 células. </li><li> Llenar vacío 35 mm de plato de plástico con un pequeño volumen de tripsina-EDTA. </li><li> Usando la pipeta de vidrio pulido al fuego, transferir piezas tailbud de disección plato en plato que contiene tripsina / EDTA. Incubar piezas tailbud en tripsina / EDTA durante 20 min a TA. </li><li> Mientras que el tejido se incubaron en tripsina, se retira la solución Fibronectin1 desde el plato de imagen con fondo de cristal. <ol><li> Lavar la solución de vidrio 3 veces con agua MilliQ. Utilice succión para eliminar cada lavado y garantizar el plato esté completamente seco. </li></ol></li><li> Dispersar piezas tailbud en medio para la formación de imágenes. <ol><li> Pipetear 100 l de medio L15 con suero en la fuente de imagen. </li><li> Con una punta de gel recubierto, retire las piezas tailbud de la tripsina / EDTA en el menor volumen posible. </li><li> Pipetear los pedazos tailbud en el medio en elplato de formación de imágenes. Pipetear las piezas arriba y abajo varias veces para separarlos y suspender las células en el medio. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire. Compruebe si hay grupos de células en el microscopio y se dispersan más si es necesario. </li><li> Permiten a las células dispersadas en la suspensión se asienten sobre el vidrio recubierto de Fibronectin1 durante 20 min a TA. </li></ol></li><li> Añadir un pequeño volumen de medio L15 adicional con suero a las células antes de comenzar de formación de imágenes. Tenga cuidado de no romper las células asentadas. </li><li> Ante la pregunta experimental, añadir cualquier suplemento o tratamientos farmacológicos para la cultura. </li></ol> 3. Obtención de imágenes de células dispersas PSM <ol><li> Configure el plato de imagen en la cámara de temperatura en el microscopio time-lapse. Establecer cámara de Warner a la temperatura deseada para el experimento. Permitir plato se equilibre durante al menos 30 min antes de iniciar la adquisición de imágenes. Temperatura Revisión Cruzada con sonda de temperatura externa colocada en el plato, si es necesario. NOTA: Debido ala relación entre la temperatura y tasa de somitogenesis 21 de control de temperatura estable es esencial para mediciones precisas de tiempo en células individuales de PSM. </li><li> Adquirir imágenes de prueba en el canal de fluorescencia para comprobar que el tiempo de exposición y ganancia proporcionan un gran rango dinámico de intensidades sin saturación para asegurar una buena señal a niveles de ruido. Una imagen típica fluorescencia adquirida de células dispersas generados a partir de nuestras líneas utilizando este protocolo requiere 400 ms y 40 ms para una imagen de luz transmitida con una cámara EMCCD operando a una ganancia EM de 85 años. Además, la ganancia del preamplificador y la velocidad de lectura del cámara son también esenciales para maximizar la señal sobre el ruido. </li><li> Usando el canal de luz transmitida, seleccione los campos de las células para la adquisición de lapso de tiempo. </li><li> Ejecutar protocolo de adquisición de lapso de tiempo de tiempo deseado. <ol><li> Adquirir una imagen de fluorescencia por campo una luz y se transmiten. NOTA: Establezca un intervalo entre ro de adquisiciónunds que capturarán dinámica temporal sin foto-blanqueamiento sobre la imagen ampliada o de la toxicidad que induce en las células. Este protocolo utiliza un intervalo de 2 min. </li></ol></li><li> Compruebe lapso de tiempo de establecimiento de vez en cuando durante la grabación para asegurarse de que las células se mantienen en el foco, no hay errores de software o hardware, etc </li></ol> 4. Procesamiento de imágenes de Adquiridos Time-lapse películas <ol><li> Abrir archivo de película para un campo adquirido en un software de procesamiento de imágenes. NOTA: Fiji se utilizó para todo el procesamiento en este protocolo. <ol><li> Dividir transmite luz y fluorescencia marcos de un campo a crear 2 pilas de imágenes. </li></ol></li><li> Seguimiento de una sola célula en el canal de la luz transmitida. <ol><li> Coloque un ROI circular (región de interés) en torno a la celda seleccionada en el primer cuadro en el canal de la luz transmitida. NOTA:.. Sólo las células que 1 son sanas al final de la grabación, 2 no se mueven fuera del campo, y 3 no entran en contacto con otras ce.lls se realiza un seguimiento. </li><li> ¡Ahorre un ROI cada pocos fotogramas a la gerente de ROI. Seguimiento de la célula hasta el último fotograma. </li></ol></li><li> Medir la intensidad de uso de las regiones de interés guardados en el canal de fluorescencia. <ol><li> Seleccione la pila de fluorescencia y con el rendimiento de la inversión guardado, siga el círculo costumbre interpolador plug-in y macro para medir la intensidad de la célula de seguimiento en el tiempo. </li><li> Revise la traza de salida de la macro. Si la traza capta cualitativamente características de la fluorescencia de lapso de tiempo, exportar los valores a una hoja de cálculo de Excel. </li><li> Guarde la lista de ROI para la célula. </li></ol></li><li> Repetir el seguimiento en el canal de transmisión y la medición en el canal de fluorescencia para otras células en el campo. </li><li> Repita todos los pasos para campos adicionales a partir del experimento. </li></ol>

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Contribuciones de autor: ABW desarrolló y perfeccionó la dispersión, la cultura, las imágenes, y los protocolos de seguimiento de la célula. DS generó las líneas transgénicas y supervisó el diseño del microscopio de fluorescencia de lapso de tiempo utilizado en este protocolo. AO fue pionera en los experimentos iniciales de prueba de principio para disociar las células y la imagen de PSM en la cultura. JS escribió la herramienta plug-in círculo interpolador en Fiji se utiliza para medir la intensidad de fluorescencia de películas a intervalos. ABW y ACO escribió el manuscrito.

Para estudiar un proceso celular que tiene lugar durante el curso del desarrollo embrionario, los biólogos utilizan típicamente un enfoque en el contexto de todo el embrión. Sin embargo, para entender completamente cómo una sola célula se comporta dentro de un marco de tiempo de desarrollo, un método para examinar y perturbar las células individuales en aislamiento también es muy beneficioso. Mediante la generación de cultivos de células PSM dispersos con embriones de pez cebra transgénico que ahora tenemos una herramienta para estudiar directamente el carácter autónomo de células de oscilaciones genéticos en el reloj de segmentación de una manera cuantitativa. Es posible medir la dinámica de las oscilaciones en nuestro reportero fluorescente en cientos de células bajo una variedad de condiciones. El período observado de células individuales en cultivo es más largo que el período de somitogenesis en el embrión intacto. Se observa que un explante de PSM intacta en la cultura también exhibe oscilaciones más lento que el embrión intacto (datos no mostrados), lo que sugiere THAT el período más largo observado en células aisladas no es simplemente debido a los daños de la dispersión. Se observa un período variable y amplitud en la mayor parte de nuestra serie de tiempo de una sola célula. El origen de esta variabilidad es desconocida, pero debe revelar detalles importantes sobre circuitos ritmo de decisiones del reloj de segmentación. Con este método podemos estudiar los componentes genéticos de segmentación a nivel celular, y tratar las cuestiones que son difíciles de examinar en todo el embrión. Por ejemplo, mediante la adición controlada de moléculas de señalización conocidas que se encuentran en el embrión en desarrollo a nuestras culturas, podemos examinar sus efectos en el único oscilador celular de PSM en un ensayo robusto y reproducible. Nuestro sistema de cultivo PSM abre la puerta a una rigurosa evaluación de cuáles son los factores, solos o en combinación promover oscilaciones en estas células, ¿qué factores inhiben estas oscilaciones, y para probar la interacción entre dichas moléculas. Con estas herramientas en la mano, nuestro objetivo esevaluar los modelos existentes de somitogenesis que se basan en los datos publicados a nivel de tejido, así como el uso de los resultados en las células individuales para generar predicciones que pueden ser probados en todo el embrión. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo de cultivo de células primarias de pez cebra para la grabación de lapso de tiempo agudo de la fluorescencia en células individuales; desarrollo y perfeccionamiento de este protocolo es sin duda posible. Otros protocolos utilizan a menudo embriones de pez cebra para generar líneas celulares estables que pueden ser transfectadas con los reporteros y utilizados para formación de imágenes a largo plazo 27-29. Mientras que las líneas estables son útiles para crear un proceso que no está vinculada a los plazos de desarrollo, como el reloj circadiano, la cuestión de la segmentación embrionaria requiere de imágenes inmediata mientras que las células están todavía en su oscilatoria, estado progenitor. Una vez que las células dejan oscilante, asumen un destino de la célula diferenciada, y cuando en el tejido, se incorpora en un somite. Es POssible que con el factor o los factores presentes en vitro derecho podríamos generar PSM-como las líneas de cultivo de células de pez cebra que permanecerían oscilatorio, lo que permite observaciones significativamente más largo plazo, múltiples perturbaciones secuenciales o cribado de alto rendimiento. Esperamos que este método de preparación de cultivos primarios de células dispersas para la imagen de lapso de tiempo es muy adecuado para el estudio de cualquier proceso celular que se produce dentro de un marco de tiempo de desarrollo que no es accesible utilizando líneas celulares estables de pez cebra. El aislamiento de los tipos de células diferentes en etapas de desarrollo distintas de las líneas de reportero transgénicos adecuados, ya sea a través de la disección o mediante FACS después de la disociación embrionario, podría proporcionar las células de partida. Algunos optimización de condiciones de cultivo, guiadas por el origen embrionario de las células, puede ser requerida. Al combinar este protocolo flexible y sensible, con el rápido crecimiento de la colección de pez cebra transgénicolíneas, esperamos facilitar un enfoque de la biología del desarrollo in vitro en el que es complementaria a los métodos genéticos y embriológicos clásicos.

La formación periódica de segmentos a lo largo del eje del cuerpo de vertebrados, o somitogenesis, es evidencia de un oscilador espacial y temporal en el embrión en desarrollo. El mecanismo favorecido controlar somitogenesis se describe conceptualmente por un modelo de &quot;reloj y frente de onda&quot; 1, en ​​donde el &quot;reloj&quot; que consiste en osciladores celulares, ahora se piensa para ser conducido intracelularmente por la expresión rítmica de un conjunto de genes cíclicos 2, hace enojar a la formación de somitas del mesodermo presomitic (PSM). Como se desarrolla el embrión, un &quot;frente de onda&quot; maduración en el PSM se mueve en concierto con el tejido regresión hacia la parte posterior, la desaceleración y detención de los osciladores celulares a medida que pasa 3. Juntos, este sistema espaciotemporalmente dinámico se denomina el reloj de segmentación. Los enfoques actuales para el estudio de la extensión del reloj segmentación tres niveles crecientes de organización del oscilador genético en las células individuales a th acoplamiento localespor lo que ocurra entre las células y, finalmente, a la regulación global de información sobre la posición en el tejido PSM colectiva 4. Estudios previos sugieren que el oscilador de segmentación de células autónomas en el pez cebra se compone de genes y productos proteínicos del her / hes transcripción factorfamily, que se cree que forma un bucle de retroalimentación negativa a través de la represión transcripcional 5-7. La vía de señalización Delta / Notch sincroniza oscilaciones entre las células vecinas y regula el período de la colectivización de la población 8-10. Moléculas FGF señalización producidas en el tailbud parecen construir un gradiente a través del pez cebra PSM, y son la hipótesis de ese modo contribuir a ralentizar y detener a las células que oscilan en el anterior 11. Hasta ahora, el papel funcional de cada una de estas moléculas en somitogenesis han sido investigados por la mutación genética, la inyección morfolino, choque térmico sobre-expresión, y trea fármaco antagonistatamento de componentes de reloj y de señalización entre células 5,7,10,12. El uso de estas perturbaciones, la función de reloj de segmentación se ha inferido a partir de descripciones de los niveles de tejido de defectos somite y la pérdida de oscilaciones uniformes en la expresión de los genes cíclicos como HER1, her7, y delta C. Sin embargo, casi todos estos datos son de embriones fijos y no logran captar con precisión los cambios que son inherentes a la función dinámica del reloj de segmentación. Más recientemente, time-lapse de múltiples embriones ha revelado los primeros mutantes con periodo oscilador alterada, pero estas observaciones también fueron compuestos en el 7,13 nivel de los tejidos. Por lo tanto, no se ha observado el comportamiento del oscilador autónomo de la célula durante la hipótesis de somitogenesis. Instantáneas estáticas de somitogenesis dan una imagen incompleta, ya que, por sí, el proceso está impulsado por un sistema oscilatorio. Trabajos anteriores en células de ratón y pollo mostró que los niveles de transcripcióny aumento de proteínas y el otoño, pero el muestreo de una oscilación de aproximadamente 2 horas cada 30 o 45 min restringe necesariamente los datos recogidos y por lo tanto las conclusiones que pueden extraerse 14,15. Estudio de los otros osciladores biológicos, sobre todo, los relojes circadianos, se ha alejado de las mediciones por etapas de genes y expresión de proteínas para monitoreo en tiempo real utilizando fluorescente y reporteros bioluminiscentes 16,17. Estas herramientas son esenciales para la demostración de propiedades del reloj de las células individuales 18. Un reportero bioluminiscente del gen cíclico Hes1 se ha desarrollado y brevemente caracterizado células PSM de ratón individuales 19. Se calculó el período promedio y la varianza para un pequeño número de células, que muestra que las oscilaciones persisten durante varios ciclos in vitro. Sin embargo, estos estudios no abordaron cuantitativamente la estabilidad y robustez de frecuencia del oscilador y la amplitud, si las células de forma espontánea pueden entrar o oscilaciones de salida,y cómo las células mantienen sus relaciones de fase. Además, los efectos de las moléculas de señalización que se encuentran en el embrión en el reloj autónomo de la célula no se han probado directamente. En consecuencia, estas propiedades fundamentales del oscilador de células individuales permanecen completamente desconocido. Recientemente hemos desarrollado líneas de peces transgénicos utilizando recombinería BAC 20 para conducir Venus (YFP) reporteros de fluorescencia de la expresión de HER1 30. Tales líneas explotan las señales reguladoras del locus cromosómico intacta en la que están inmersos y recapitulan la dinámica temporal y patrón espacial de HER1. Este avance permite la supervisión en tiempo real de la expresión génica en el embrión de pez cebra en desarrollo in vivo. Para el estudio de las propiedades fundamentales de las oscilaciones de células autónomas y las modalidades de dicha expresión está regulada a través del tiempo, recientemente hemos desarrollado un método fiable para aislar y registro de las células PSM in vitro. Este protocol describe cómo hemos utilizado nuestras líneas de reportero transgénicos para generar cultivos de células dispersas, de la que podemos caracterizar las oscilaciones del reloj de la segmentación del pez cebra en las células individuales. Podemos abordar de ese modo las cuestiones pendientes en el campo que no eran accesibles con el análisis estático o de nivel de tejido, así como manipular directamente el reloj de segmentación a nivel de una sola célula con moléculas de señalización e inhibidores.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

La segmentación es un proceso morfogenético periódica y secuencial en los vertebrados. Esta formación rítmica de bloques de tejido llamados somitas a lo largo del eje del cuerpo es evidencia de un oscilador genética modelar el embrión en desarrollo. En el pez cebra, el reloj de la segmentación de conducción intracelular está formado por miembros de la familia de factores de transcripción Her / Hes organizados en ciclos de retroalimentación negativa. Hemos generado recientemente líneas fluorescentes reportero transgénicos para el gen HER1 cíclica que recapitular el patrón espacio-temporal de las oscilaciones en el mesodermo presomitic (PSM). El uso de estas líneas, hemos desarrollado un sistema de cultivo in vitro que permite el análisis en tiempo real de las oscilaciones de reloj de segmentación dentro de las células individuales, aislados de PSM. Mediante la eliminación de tejido PSM de embriones transgénicos y luego dispersar las células de las regiones oscilante sobre placas con fondo de vidrio, que generó culturas adecuadas para time-lapse de la señal de fluorescencia decélulas de reloj individuales. Este enfoque proporciona un marco experimental y conceptual de la manipulación directa del reloj de segmentación con la resolución de una sola célula sin precedentes, permitiendo a sus propiedades de células autónomas ya nivel de tejido para ser distinguidos y disecados.

Este protocolo produce cultivos de dispersos, las células viables, solo PSM para time-lapse de la señal de fluorescencia (Figura 2). Nuestra transgén genera un reportero cuyo ciclo de producción y la degradación se produce con una dinámica similar a la del gen y de la proteína endógena en el embrión, en el orden de la mitad de una hora. Debido a su rápida rotación, la señal de YFP en células individuales debe ser detectado rápidamente para minimizar la decoloración y con una alta resolución temporal para capturar las características de cada ciclo oscilatorio. Además, dada la oscuridad relativa de la señal, la cultura y las condiciones de adquisición se han perfeccionado al máximo para garantizar resultados sensibles y robustas. Hemos encontrado los siguientes factores a ser importantes en la generación de cultivos óptimos de células PSM para imágenes:. 1 Un sustrato ECM utilizado para recubrir las placas de cultivo con fondo de cristal. 2. La adición de suero a la disección y medio formador de imágenes. 3. Disección de PSM a partir de embriones identificados tomadas después hete apareamientopares rozygous, cuya descendencia potencialmente llevar 2 copias del transgén. 4. Adquisición de imágenes dentro de un rango de aumento óptimo, utilizando un objetivo de alto NA para asegurar la captura eficiente de la señal de fluorescencia. 5. Iluminación con una fuente de luz de estado sólido para minimizar las fluctuaciones de intensidad que puedan contribuir al ruido de fondo. 6. Detección de señal con una cámara EM-CCD de alta sensibilidad para maximizar la señal de lectura. Culturas subóptimas contendrán células que no permanecen redondeadas y saludable durante toda la grabación. La hipótesis de que nuestro sustrato ECM, un fragmento de fibronectin1 pez cebra mantiene células en un estado PSM-como indiferenciada, en comparación con otros sustratos comúnmente utilizados como poli-lisina o laminina. Otros sustratos que probamos causados ​​células para aplanar en el cristal y la pérdida de la señal fluorescente oscilante en el transcurso de la grabación. También se encontró que la adición de suero al medio durante la disección, la dispersión,y la grabación no sólo era importante para inactivar la tripsina utilizada para la disociación, pero también aumentó la intensidad de fluorescencia sobre el fondo, probablemente debido a la mejora de la viabilidad celular. Para asegurar la captura óptima de la señal de las células individuales se utilizó un objetivo de 40x diseñado específicamente para imágenes de fluorescencia (Zeiss Plan de serie Neofluor) con un alto NA. También se encontró que una fuente de luz de estado sólido proporciona una iluminación más estable que las lámparas de mercurio tradicionales, lo cual es fundamental para minimizar las fluctuaciones de fondo que contribuyen a imágenes ruidosas. Estas modificaciones son importantes para asegurar resultados consistentes. El uso de este protocolo se espera culturas en las que la mayoría de las células en un campo dado son fluorescentes en algún momento durante la grabación. Encontramos que las células fluorescentes suelen permanecer redondeada y son a veces muy móviles durante las grabaciones. Unas pocas células, incluyendo las células fluorescentes, pueden llegar a ser apoptótica durante la grabación. Estas células están excluidos de cualquier unanálisis. También excluimos las células que entran en contacto con otras células o movemos fuera del campo de visión. En promedio, se observa una reducción del 12% en el número de células por campo por el final de la grabación 10 horas tal como se mide contando el número de células sanas en el canal de luz transmitida. Esta pérdida incluye tanto la muerte celular y las células que se han trasladado fuera del campo. Dadas estas advertencias, podemos, en promedio, pista 5 células fluorescentes por campo que siguen siendo viables y visibles, y típicamente grabar 6 campos por condición. Por ejemplo, un experimento con 4 condiciones tendrá 24 campos de totales adquiridos y por lo general alrededor de 30 células rastreados por condición. Bajo condiciones estándar de formación de imágenes con medio L15 que contiene suero bovino fetal al 10%, encontramos que las células PSM (n = 101 células de 4 réplicas experimentales) pueden producir entre 2 y 7 picos, con la media y la desviación estándar de 3 ± 1 picos (2 ciclos de -3). El número máximo mediana, así como el percentil 25%, es de 2 picos y el 75% percentil is 3 picos. Utilizando el seguimiento y el análisis semiautomatizado, podemos generar rápidamente la intensidad de fluorescencia sobre los rastros de tiempo para las células individuales de PSM, con un rastro célula representativa se muestra en la figura 2C. Estas trazas primas se pueden utilizar para hacer las mediciones cuantitativas de las propiedades de las células oscilantes PSM, tales como frecuencia, amplitud, número de ciclos, y el momento de picos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Figura 1. Identificación de embriones transgénicos y esquemas de su disección. (A) Vista lateral de un embrión de pez cebra transgénico que expresa YFP fluorescencia a ~ etapa 5 somitas. La imagen es una superposición de la luz transmitida y el canal de fluorescencia. Las flechas indican las áreas de señal a partir de la punta de la tailbud, a lo largo del PSM, hacia el L<html> ast somito formado. El recuadro muestra un esquema del transgén reportero (para más información sobre su desarrollo y el comportamiento in vivo consulte Soroldoni et al. 30. (B) Esquema de la vista lateral del embrión antes del corte por primera vez durante la disección. Línea roja punteada indica el primer corte realizado a través de la parte posterior del cerebro, aunque la célula yema justo detrás de la tailbud. (C) Representación esquemática de aplanado PSM tras la retirada de los gránulos de yema y capa epidérmica, orientado a lo largo de su eje antero-posterior. línea roja punteada indica el segundo corte para quitar la punta del tailbud para la dispersión y la cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Imágenes representativas y las huellas de una sola célula en una cultura PSM dispersa. (A) Montaje de imágenes de luz transmitida de una sola célula PSM en una grabación de lapso de tiempo de 6 h. Tenga en cuenta que la célula sigue siendo redondeado y saludable durante todo el curso de la grabación. (B) correspondiente montaje de imágenes de fluorescencia de una sola célula de PSM. Los picos en la intensidad de la célula se numeran en el transcurso de la grabación. (C) Intensidad media en el tiempo medido a partir de un retorno de la inversión colocado en esta célula. Los valores se toman de cada fotograma en un vídeo con una velocidad de uno por cada 2 minutos usando el círculo interpolador plug-in y macro personalizado escrito en Fiji. Los picos de intensidad se numeran de nuevo a lo largo de la traza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis es un proceso de desarrollo rítmico que espacialmente los patrones de los ejes corporales de los embriones de vertebrados. Anteriormente, hemos desarrollado líneas de pez cebra transgénico que utilizan los reporteros fluorescentes para observar los genes cíclicos que impulsan este proceso. En este sentido, la cultura dispersamos las células de estas líneas y la imagen de sus oscilaciones en el tiempo en vitro.

Generación de Dispersed presomitic mesodermo Cultivos Celulares for Imaging del pez cebra Segmentación del Reloj en células individuales

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K vistas.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis es un proceso de desarrollo rítmico que espacialmente los patrones de los ejes corporales de los embriones de vertebrados. Anteriormente, hemos desarrollado líneas de pez cebra transgénico que utilizan los reporteros fluorescentes para observar los genes cíclicos que impulsan este proceso. En este sentido, la cultura dispersamos las células de estas líneas y la imagen de sus oscilaciones en el tiempo en vitro. 

Video: Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Investigación

Biología

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...