Los autores desean agradecer a Lirui Du para construir el vector pCAGAdDU y Oliver Gorka para la prestación del protocolo de fijación.

1. La clonación de un gen de interés en un vector de entrada <ol><li> Clonar el gen de interés en un vector de entrada. Amplificación por PCR del gen seguido por ligación de extremos romos en un vector de la topoisomerasa-acoplado (por ejemplo pENTR / D-TOPO) o la enzima de restricción mediada por clonación puede ser usada para este procedimiento. </li></ol> 2. Transferencia del gen de interés en la pCAGAdDu Destino vectorial <ol><li> La transferencia del gen de interés a partir del vector de entrada en el vector de destino por LR recombinación (por ejemplo, puerta de enlace LR Clonase II mezcla de enzimas). Esto creará el vector de expresión adenoviral (Figura 1). </li><li> Alineado de 10 ug del vector de expresión adenoviral en una digestión de restricción PacI, precipitar el ADN y se resuspende en agua a una concentración de 3 g por 100 l. Linealización libera las repeticiones invertidas virales (ITR), que son necesarios para la replicación y encapsidación de la VDNA iral en partículas virales. </li></ol> 3. Generación del lisado de virus primaria <ol><li> Semilla 1 x 10 5 células HEK293A en 2 ml de medio de cultivo celular (DMEM, FBS al 10%, 5% PenStrep) en un pocillo de una placa de 6 pocillos y se incuban las células durante 6 - 14 horas a 37 ° C en un 10% CO 2 incubadora para permitir que se adhieran. Las células deben ser entonces en aproximadamente 50% de confluencia. </li><li> La lipofección: Transferencia de 6 l de reactivo jetPEI en 94 l de 50 mM de NaCl, agitar brevemente. Añadir la solución mixta a 100 l vector de adenovirus linealizado mientras agitación e incubar esta mezcla de transfección durante 15 - 30 min a temperatura ambiente. </li></ol> Realice todos los pasos siguientes en las condiciones de bioseguridad apropiadas para la infección por adenovirus! <ol start="3"><li> Dispensar la solución gota a gota sobre la célula que contiene así HEK293A y se incuban las células a 37 ° C y CO 2 al 10%. Cuando se utiliza un marcador de fluorescencia, evaluar la transfeeficiencia cción visualmente después de 12 a 36 horas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. Añadir 0,5 ml de medio fresco cada 3 días. </li><li> Compruebe cada 2 - 3 días con un microscopio de luz o fluorescencia para efectos citopáticos (CPE), que son áreas con células alargadas y redondeadas que comienzan a desprenderse. Esto es indicativo de la generación eficiente de virus. Tras la aparición de zonas más amplias de la CPE (Figura 3), que se llevará a 24-72 horas antes de que todas las células están infectadas. </li><li> Cuando todas las células muestran signos de ECP, pero antes de que se produce un desprendimiento total de las células, separar las células por pipeteo suave y de transferencia de las células con el sobrenadante (SN, 3 - 5 ml) a un tubo de poliestireno de 15 ml. </li><li> Congelar las células en el SN en hielo seco durante 15 - 20 min y descongelar rápidamente a 37 ° C después de la ruptura de las células. Repita este-y--ciclo de congelación-descongelación (C / TC) dos veces más. Mantenga el lisado de virus de la primaria en hielo para el uso dentro de un día o congelar a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Cualquier F adicional/ TC reducirá el título del virus por 30 - 50%. </li></ol> 4. Virus Amplification <ol><li> Semilla y crecer células HEK293A a 90% de confluencia en una placa de cultivo de 14 cm de tejido. </li><li> Infectar las células con medio de lisado de virus de la primaria (1.5 - 2,5 ml) y se incuban las células durante al menos 36 horas. Casi todas las células deben ser infectados a continuación, que puede determinarse por microscopía de fluorescencia. Para la re-amplificación de un stock de virus ya amplificada (es decir, más concentrada), HEK293A infectar a una multiplicidad de infección (MOI) de 50 (véase el apartado 6.3). </li><li> Las células deben ser cosechados cuando todos ellos muestran CPE, pero antes de la separación. Con la producción eficiente del virus este estado se alcanza dentro de las 48 horas después de la infección. (Si se tarda hasta una semana, considerar otra ronda de amplificación mediante el aumento de la cantidad de acciones adenovirus utilizado para la infección se ha descrito en el punto 4.2.) </li><li> Separar las células por pipeteo suave y células de transferencia y SN a un tubo de poliestireno de 50 ml. Girar las células hacia abajo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Retire el SN y resuspender el sedimento en un volumen adecuado de medio o SN (aprox. 1 ml). </li><li> Realizar 3 F / CT para romper las células y centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Quítese la SN que contiene las partículas de virus (es decir, el lisado de virus concentrado), y alícuota del lisado de virus para almacenarlo a -80 ° C. </li></ol> 5. El título de virus Determinación <ol><li> Semillas 10 5 A549 células por pocillo en 5 pozos de una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio y dejar que las células se adhieran durante 6 horas. </li><li> Usar 1 l de adenovirus concentrada (descongelado en hielo) para realizar una dilución en serie en medio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) y añadir 10 l por pocillo. Deja un pozo sin infectar para ajustar la compuerta en la citometría de flujo. </li><li> Después de 36 horas, quite la SN, lavar con PBS y las células de desconexión (por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina). Para las precauciones de seguridad, se recomienda fijar cells en 100 l de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y lavado con PBS una vez. </li><li> Realizar un análisis FACS de la expresión de marcadores infección. Parcela &#39;l de lisado viral aplica&#39; contra el número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar el intervalo lineal de la infección y calcular el título por ml de virus de la sin diluir de la curva estándar por encima del intervalo lineal con x = 1000 l. </li></ol> 6. T infección de la célula <ol><li> Aislar las células T CD4 naive / reposo de DO11.10 tg; tg CARΔ1 utilizando MACS (T celda de aislamiento Kit II ingenuo CD4 +) o FACS clasificación (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Para los experimentos a pequeña escala, una pipeta un volumen apropiado de lisado viral para alcanzar una MOI de 50 en un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. </li><li> Añadir hasta 10 5 células T 4 x en un volumen final de la infección de 50 l en medio de células T (RPMI 1640, FBS al 10%, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM esencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, 10 mM de HEPES). Ejemplo: El Ministerio del Interior de 50 se utilizará para infectar 3 10 5 células T x; el título viral es 3 x 10 9 ml -1 Volumen Virus MOI = x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Nota: para la infección del número de células grandes, escala hasta el uso de una MOI de 50 en un volumen infección de 165 l por 10 6 células T ingenuas en un tubo de poliestireno con la taza floja (hasta tp 3 ml por tubo). <ol start="4"><li> Se incuban las células durante 90 minutos a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, quite SN, resuspender en 200 l de PBS. Se centrifuga de nuevo y quitar SN. </li></ol> (Opcional: las células se pueden lavar de nuevo para eliminar el virus de la manera más eficiente) <ol start="6"><li> Resuspender las célulasen 200 l de medio de células T sin anticuerpos estimulantes y sin IL-2 o de otras citoquinas y descanse durante 40 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora para permitir la expresión del gen de interés antes de la activación. </li></ol> 7. Activación de las células T y la polarización <ol><li> Pipeta un volumen de anti-CD3 y anti-CD28 bolas acoplados a que es igual al número de células (por ejemplo, 4 x 10 5) en una taza pequeña reactivo, añadir el volumen 10 veces mayor de PBS y ponerlos en un imán durante 2 minutos . Retirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 200 medio de polarización l (para células T reguladoras: medio de células T + 1 ng / ml de TGF, 100 U / ml de IL-2). </li></ol> Nota: Las células también se pueden activar utilizando placas de cultivo tisular recubiertas con anti-CD28 y anti-CD3 anticuerpos, o de una manera específica del receptor de células T DO11.10 usando irradiados esplenocitos BALB / c pulsadas con péptido antígeno ovoalbúmina 323-339. <ol start="2"><li> Centrifuge la apoyó las células como antes, quitar la Resuspender las células SN y en 200 l de medio de polarización que contiene anti-CD3 y anti-CD28 de anticuerpos acoplados a perlas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora sin cambiar medio. </li></ol> 8. T fijación de células y tinción para citometría de flujo <ol><li> Lavar las células: Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, quite SN, resuspender en 200 l de PBS. Se centrifuga de nuevo y quitar SN. Realice todas las siguientes etapas de lavado en consecuencia. </li><li> Resuspender las células en 100 l solución de tinción de células muertas puede arreglar y se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células, se resuspenden en 100 l de PBS, añadir 100 ml de paraformaldehído al 4% en PBS, incubar 15 min a TA. </li><li> Lavar las células, resuspender en 200 l de metanol enfriado con hielo 70% en PBS y se incuba durante 30 min en hielo. </li></ol> Nota: Las celdas pueden ser tratados a partir de ahora sin precaución biohazard!<ol start="5"><li> Preparar 60 l master-mix de 60 l de PBS + 10 mg / ml Fc-block (anti-FCR3 para bloquear la unión inespecífica). Lavar las células, resuspender en 40 l de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a TA. </li><li> Añadir 20 l de PBS + anti-FCR3 que contiene 1 g de PE-junto anticuerpo anti-Foxp3, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar las células dos veces en PBS y analizar las células en un citómetro de flujo. </li></ol>

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	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Virus Generación y Titulación Para obtener resultados óptimos de transfección, la calidad y la cantidad de vector linealizado parecen más importantes. No se observaron efectos negativos en la producción primaria de lisado de un crecimiento excesivo inicial del cultivo ya que la infección se procederá rápidamente una vez que se produce la producción de virus eficiente. Sin embargo, la producción de virus por las células HEK293A puede verse afectado por las inserciones largas que dism...

Tregs son cruciales para mantener la tolerancia inmunológica y para amortiguar la respuesta inmune rebasamiento. Treg suprimen la activación de células T espectador. En consecuencia, la ablación de células T reguladoras conduce a la autoinmunidad fatal y la autodestrucción impulsado por las células T activadas 1. Desarrollar células T reguladoras en el timo durante la selección negativa de células CD4-positivas precursores sola, pero también puede diferenciar en la periferia de las células T naive CD4 tras la estimulación de antígeno con dosis baja subóptima 1,2 co-estimulación. Tímico células T reguladoras parece suprimir la autoinmunidad tejido contra antígenos propios, mientras que periférica células T reguladoras han sido implicados en el suministro de la tolerancia en el intestino o el pulmón. Estos inducida por células T reguladoras potentemente prevenir la activación de células T tras el reconocimiento de los antígenos extraños en la mucosa, incluyendo antígenos ambientales de los alimentos y el aire, las bacterias comensales, y los alérgenos 3,4. Además, células T reguladoras son cruciales para establecer la tolerancia materna a la fetal péptidos 5 y preventilación de la enfermedad de injerto contra huésped 6. Al mismo tiempo, células T reguladoras también median efectos no deseados mediante la atenuación de la vigilancia inmune de las células tumorales 7,8. La característica más distintiva de células T reguladoras es la expresión del subconjunto-especificando Foxp3 factor de transcripción, un factor de transcripción que contiene el dominio tenedor-cabeza que es necesario y suficiente para conferir función 9,10 Treg. Se sabe que algunas vías de señalización que pueden inducir la expresión de Foxp3. Sin embargo, los procesos moleculares que controlan, regulan o modulan Treg diferenciación en respuesta a la activación del receptor de células T son menos conocidos. Tregs puede ser inducida de manera muy eficaz in vitro a través de la estimulación de las células T ingenuas CD4 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en la presencia de TGF y la IL-2 11. A medida que el Tregs emergentes son funcionales in vivo, la manipulación de moléculas que promueven la diferenciación Treg lleva un enorme potencial para el futuro therapies, por ejemplo, el tratamiento del asma, la enfermedad de Crohn, y el trasplante 11,12. Por el contrario, la modulación terapéutica de las moléculas para bloquear la diferenciación de Treg puede proporcionar beneficio para futuros enfoques de tratamiento combinado de pacientes con tumores. En ensayos de diferenciación in vitro han sido instrumentales para la descripción de los cambios moleculares que están asociados con T diferenciación subconjunto de células. Por el momento, los intentos experimentales para buscar en pantalla o para los productos de genes que controlan la diferenciación de células T se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos más comunes de la expresión génica ectópico no en las células T vírgenes. Por ejemplo, la electroporación y la transducción retroviral sólo son eficaces en las células T activadas. En contraste con las expectativas iniciales, la transducción lentiviral, que es normalmente eficaz en las células en reposo, requiere pre-activación de las células T ingenuas por citocinas 13. Además, la transferencia de ADNc o ARNm durante la electroporaciónimplica la despolarización de la membrana plasmática, que a su vez confiere características de activación de células T e incluso puede movilizar Ca 2 + señalización y activar las proteínas NFAT (observaciones no publicadas y ref. 14). Del mismo modo, para la transducción retroviral, las células T vírgenes tienen que activarse para 18 - 40 horas. Durante este tiempo, la ruptura de la membrana nuclear en el curso de la división celular se produce y permite la integración genómica posterior del vector retroviral 15. Estos métodos por lo tanto no son capaces de hacer frente a la temprana regulación molecular de encuentro de células T con el antígeno inicial, que es la fase decisiva de la diferenciación de células T ayudante. Transducción adenoviral es conocido para conferir expresión génica ectópica transitoria en un número de tipos de células humanas que expresan el receptor de adenovirus Coxsackie humano (CAR). Se procede sin requisito para la activación de las células o la progresión del ciclo celular. La expresión en la superficie de CAR es esencial para la fijación del virus y la internalización eficiente, y la expresión transgénica de la versión truncada CARΔ1 bajo un promotor de células T específica fue encontrado para hacer timocitos de ratón y células T susceptibles a la infección adenoviral 16. Es importante destacar que, el transgén no altera desarrollo de los timocitos o en la diferenciación in vitro de células T CD4 + naïve en diferentes subconjuntos (datos no mostrados; 17 ref.). Adenovirus mediada por la transducción de las células T se utilizó anteriormente para la sobreexpresión 17,18 y knock-down enfoques 19,20. Las células T transgénicas pueden purificarse a partir comercialmente disponible DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. y 17 ref.). Es importante destacar que, transducción adenoviral permite una alta expresión de un gen de interés en células T vírgenes sin inducir signos evidentes de activación. Las células T permanecen ingenua (CD44 baja, CD62L alta) y descanso (CD25 -, CD69 -) después infectien y se puede activar y diferenciado en Treg similares a las células no infectadas. La producción de adenovirus recombinantes se puede lograr después de la transfección de las células con plásmidos HEK293A adenovirales (Figura 1). Estos plásmidos contienen típicamente el genoma del adenovirus tipo 5 humano con genes E1 y E3 eliminados para hacer que los adenovirus recombinantes de replicación incompetente 21. Células HEK293A complementan la deficiencia de replicación, ya que han sido inmortalizados a través de la integración estable de adenovirus cortado 22. Desde vectores adenovirales son grandes (~ 40 kb) y por lo tanto no es apropiado para la enzima de restricción mediada por clonación tradicional, empleamos el sistema de puerta de enlace. El gen de interés se clonó inicialmente en un vector de entrada más pequeña, de la que se pueden transferir fácilmente en el vector adenoviral de destino a través de reacción de recombinación lambda (LR) 23. Hemos construido el vector pCAGAdDumediante la combinación del promotor CAG (promotor de actina de pollo y el potenciador de CMV) con un casete de expresión que contiene sitios LR que flanquean el marcador de selección ccdB procariota 24. Este casete de expresión está fusionado a un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) elemento que permite la coexpresión de la proteína eucariota infección marcador verde fluorescente mejorada (eGFP), que está fusionado a una secuencia que contiene la hormona de crecimiento bovino poli (A)-señal. Elegimos los CAG cis-secuencias reguladoras, ya que se encontró que el promotor de CMV prototípico para ser altamente dependiente de la activación y por lo tanto, desfavorable para la expresión génica en las células T vírgenes. Aquí, proporcionamos un protocolo para la eficiente en la diferenciación de Treg in vitro y un método para transducir células naive T CD4 sin activación (Figura 2). El método permite la expresión génica ectópico o derribar CD4 precedentes diferenciación de las células T en el estado ingenuo. Se permite probar el efecto de un overexpressed gen de interés durante los primeros eventos de señalización a la estimulación TCR inicial hasta el compromiso de T subconjunto de células. Nuestros experimentos de validación también proporcionan la base para establecer la aplicación de adenovirus similar en la diferenciación de otros subconjuntos de células T tales como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o células Tfh.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Las células T reguladoras (Treg) son esenciales para proporcionar la tolerancia inmune a auto, así como a ciertos antígenos extraños. Tregs puede ser generada a partir ingenuas CD4 en las células T in vitro con TCR-y co-estimulación en presencia de TGF y la IL-2. Esto tiene un enorme potencial para las terapias futuras, sin embargo, las moléculas y vías de señalización que la diferenciación de control son en gran parte desconocidos. Las células T primarias se pueden manipular a través de la expresión del gen ectópico, pero los métodos comunes no atacan el estado ingenua más importante de la célula T antes del reconocimiento al antígeno primario. Aquí, ofrecemos un protocolo para expresar genes ectópicos de células T naive CD4 in vitro antes de inducir la diferenciación de Treg. Se aplica la transducción con el adenovirus de replicación deficiente y explica su generación y producción. El adenovirus puede tardar hasta grandes inserciones (hasta 7 kb) y se puede equipar con los promotores para lograr una alta y transitorios Sobreexpresión en las células T. Se transduce eficazmente las células T de ratones ingenuos si expresan un receptor de adenovirus Coxsackie transgénico (CAR). Es importante destacar que, después de la infección las células T permanecen ingenua (CD44 bajo, CD62L alta) y en reposo (CD25 -, CD69 -) y se pueden activar y diferenciarse en células T reguladoras similares a las células no infectadas. Por lo tanto, este método permite la manipulación de la diferenciación de células T CD4 desde sus inicios. Se asegura de que la expresión del gen ectópico ya está en su lugar cuando los eventos de señalización temprana de la estimulación inicial TCR induce cambios celulares que finalmente conducen a la diferenciación de Treg.

Producción Virus Para la generación de altos títulos de virus, el tiempo de cosecha de células HEK293A en la producción de virus primario o amplificación del virus es crucial. Representativos imágenes de contraste de fase fluorescentes y con signos visuales de la producción de virus se muestran en la Figura 3. El CPE se observaron 10 días después de la transfección de células HEK293A con pCAGAdDu vector de control sin inserto. CPE se caracteriza por la aparición de...

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T reguladoras<em&gt; In vitro</em&gt;.

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.8K vistas.  Helmholtz Zentrum München. Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T reguladoras In vitro.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

El trasplante de la cola de la piel para el Estudio alogénico de células T CD4 respuestas en ratones

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Descifrando el compromiso temprano de las células T auxiliares foliculares en la infección aguda por LCMV

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

Autor destacado: Elucidación de las vías de diferenciación celular de TFH en desafíos agudos de LCMV

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...