فإن الكتاب أود أن أشكر Lirui دو للبناء ناقلات pCAGAdDU وأوليفر جوركا لأحكام البروتوكول التثبيت.

1. استنساخ الجين من الاهتمام إلى متجه الدخول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ الجين من الاهتمام إلى متجه دخول. PCR التضخيم من الجينات تليها ربط حادة في نهاية إلى ناقلات topoisomerase يقترن (على سبيل المثال pENTR / D-TOPO) أو تقييد انزيم بوساطة الاستنساخ يمكن استخدامها لهذا الإجراء. </li></ol> 2. نقل الجينات في المصالح في pCAGAdDu الوجهة المتجهات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجينات في المصالح من ناقلات دخول ناقلات الوجهة التي كتبها LR إعادة التركيب (على سبيل المثال عبارة LR Clonase الثاني إنزيم ميكس). هذا سيخلق متجه التعبير الغدانية (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي 10 ميكروغرام من ناقلات التعبير الغدانية في باتشي تقييد هضم، ترسيب الحمض النووي و resuspend في الماء بتركيز قدره 3 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر. الخطية يحرر يكرر مقلوب الفيروسي (ITR)، وهي مطلوبة من أجل النسخ المتماثل وencapsidation من الخامسالحمض النووي iral الى جزيئات الفيروس. </li></ol> 3. جيل من الفيروسات المحللة الابتدائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 1 × 10 5 خلايا HEK293A في 2 سائل الإعلام والثقافة الخلية مل (DMEM، و 10٪ FBS، 5٪ PenStrep) في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا واحتضان الخلايا لمدة 6-14 ساعة عند 37 درجة مئوية في 10٪ CO 2 حاضنة للسماح لهم الانضمام. خلايا ينبغي أن يكون ثم إلى حوالي 50٪ confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lipofection: نقل 6 ميكرولتر من كاشف jetPEI في 94 ميكرولتر من 50 ميكرومتر كلوريد الصوديوم، لفترة وجيزة الدوامة. إضافة الحل المختلط إلى 100 ميكرولتر خطي ناقلات اتش بينما vortexing لواحتضان هذا المزيج ترنسفكأيشن لمدة 15 - 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> تنفيذ كافة الخطوات التالية وفقا للشروط السلامة الأحيائية المناسبة لعدوى اتش! <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء الحل نقطه نقطه على الخلية التي تحتوي على HEK293A جيدا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2. عند استخدام علامة مضان، وتقييم حوالةكفاءة كشن بصريا بعد 12-36 ساعة باستخدام المجهر مضان مقلوب. إضافة 0.5 مل من المتوسط ​​الطازج كل 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق كل 2-3 أيام مع المجهر ضوء أو مضان للآثار الاعتلال الخلوي (CPE)، والتي هي مناطق ذات الخلايا الموسع وتقريبه أن تبدأ في فصل. هذا يدل على جيل فيروس فعالة. عند حدوث مناطق أوسع من CPE (الشكل 3)، وسوف يستغرق 24-72 ساعة قبل أن يتم إصابة جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يظهر كل الخلايا علامات CPE، ولكن قبل حدوث انفصال الكلي للخلايا، فصل الخلايا طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا مع طاف (SN، 3-5 مل) إلى أنبوب البوليسترين 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد الخلايا في SN على الجليد الجاف لمدة 15 - 20 دقيقة، وذوبان الجليد منها بسرعة عند 37 درجة مئوية بعد ذلك إلى تمزق الخلايا. كرر هذا التجميد والذوبان دورة (F / TC) مرتين أخريين. إبقاء المحللة فيروس الأولية على الجليد للاستخدام في غضون يوم أو تجميده عند -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. أي F إضافية/ TC سوف يقلل من عيار الفيروس بنسبة 30 - 50٪. </li></ol> 4. التضخيم فيروس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور وتنمو الخلايا HEK293A إلى 90٪ التقاء على طبق سم زراعة الأنسجة 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الخلايا مع نصف المحللة فيروس الابتدائي (1،5-2،5 مل)، واحتضان الخلايا لمدة 36 ساعة على الأقل. تقريبا يجب أن يصاب كل الخلايا ثم، والذي يمكن تحديده عن طريق الفحص المجهري مضان. لإعادة التضخيم من الأسهم تضخيم بالفعل (أي أكثر تركيزا) الفيروس، تصيب HEK293A في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 50 (انظر 6.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تحصد الخلايا عند كل منهم تظهر CPE ولكن قبل مفرزة. مع إنتاج فيروس فعال يتم التوصل إلى هذه الدولة في غضون 48 ساعة بعد الإصابة. (وإذا كان يستغرق فترة تصل إلى أسبوع واحد، والنظر في جولة أخرى من التضخيم عن طريق زيادة كمية من الأوراق المالية اتش تستخدم لإصابة وصفها في 4.2.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا وSN إلى أنبوب البوليسترين 50 مل. تدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة SN و resuspend بيليه في حجم مناسب من المتوسط ​​أو SN (حوالي 1 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ 3 F / TC إلى تعطيل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. خلع SN الذي يحتوي على جزيئات الفيروس (أي المحللة فيروس مركزة)، وقسامة المحللة فيروس لتخزينه في -80 درجة مئوية. </li></ol> 5. فيروس عيار تقدير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 10 5 خلايا لكل بئر A549 إلى 5 آبار من لوحة 12 أيضا في 1 مل المتوسطة والسماح خلايا الالتزام لمدة 6 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم 1 ميكرولتر من اتش المركزة (إذابة على الجليد) لتنفيذ التخفيف المتسلسل في المتوسطة (1:5،000، 1:10،000، 1:50،000، 1:100،000) وإضافة 10 ميكرولتر لكل بئر. ترك واحد غير مصاب جيدا لضبط النابضة في التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 36 ساعة، خلع SN، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وفصل (مثلا عن طريق trypsinization). لاحتياطات بيولوجية، فمن المستحسن لإصلاح جells في 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وغسل مع PBS وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من عدوى التعبير علامة. مؤامرة &#39;ميكرولتر المحللة الفيروسية تطبيق&#39; ضد العدد المطلق للخلايا المصابة (الشكل 4). تحديد مجموعة خطية من العدوى وحساب عيار لكل مل من فيروس مخفف من المنحنى القياسي على نطاق الخطية باستخدام X = 1،000 ميكرولتر. </li></ol> 6. T عدوى الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل ساذج / يستريح CD4 خلايا تي من DO11.10 TG؛ الفئران TG CARΔ1 تستخدم أجهزة ماكينتوش (CD4 + T ساذج زنزانة انفرادية كيت II) أو نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز (CD4 + CD25 + CD44-CD62L-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب على نطاق صغير، ماصة حجم مناسب من المحللة الفيروسية لتحقيق وزارة الداخلية من 50 إلى بئر واحدة من لوحة أسفل لمدة 96 جولة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيف ما يصل إلى 4 × 10 5 خلايا T في حجم الإصابة النهائي من 50 ميكرولتر في T المتوسطة الخلية (RPMI1640، و 10٪ FBS، PenStrep 5٪، 5٪ NaPyruvate، 1X NEAA، 1X MEM الأساسيةفيتامين، 1X L-الجلوتامين، 1:250،000 المركابتويثانول، 10 HEPES ملم). على سبيل المثال: وزارة الداخلية من 50 يجب أن تستخدم للتصيب 3 × 10 5 خلايا T؛ عيار الفيروسي هو 3 × 10 9 مل -1 حجم الفيروس وزارة الداخلية = س T عدد الخلايا / عيار الفيروسية = 50 × (3 × 10 5) / (3 × 10 9 مل -1) = 0.005 مل </li></ol> ملاحظة: بالنسبة للإصابة أعداد أكبر خلية، حتى باستخدام نطاق وزارة الداخلية من 50 في حجم إصابة 165 ميكرولتر لكل 10 6 خلايا T السذاجة في أنبوب البوليسترين مع كوب فضفاض (ما يصل TP 3 مل لكل أنبوب). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وخلع SN، في resuspend 200 ميكرولتر PBS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وخلع SN. </li></ol> (اختياري: الخلايا قد يتم غسلها مرة أخرى لإزالة الفيروس بشكل أكثر كفاءة) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايافي 200 ميكرولتر المتوسطة الخلايا التائية دون تحفيز الأجسام المضادة ودون IL-2 أو السيتوكينات الأخرى والراحة لهم لمدة 40 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة للسماح التعبير عن الجينات في المصالح قبل التنشيط. </li></ol> 7. T تنشيط الخلايا والاستقطاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة وبلغ حجم التداول مكافحة CD3 والخرز مكافحة CD28 يقترن التي يساوي عدد الخلايا (على سبيل المثال 4 × 10 5) في كوب صغير كاشف، إضافة حجم 10 أضعاف من برنامج تلفزيوني ووضعها على مغناطيس لمدة 2 دقيقة . خلع طاف و resuspend حبات في 200 ميكرولتر المتوسطة الاستقطاب (لTregs: T المتوسطة خلية + 1 نانوغرام / مل TGFβ، 100 U / مل IL-2). </li></ol> ملاحظة: يمكن أيضا تنشيط خلايا باستخدام أطباق زراعة الأنسجة المغلفة مع المضادة للCD28 ومكافحة CD3 الأجسام المضادة، أو بطريقة DO11.10 T الخلية مستقبلات محددة باستخدام المشع splenocytes BALB / ج نابض مع ألبومين البيض 323-339 مستضد الببتيد. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugه واستراح الخلايا كما كان من قبل، خلع SN والخلايا resuspend في 200 ميكرولتر المتوسطة الاستقطاب التي تحتوي على مكافحة CD3 ومكافحة CD28 الضد يقترن الخرز. احتضان لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة دون تغيير المتوسطة. </li></ol> 8. T تثبيت الخلية وتلطيخ للالتدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا: تدور باستمرار الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وخلع SN، في resuspend 200 ميكرولتر PBS. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وخلع SN. تنفيذ كافة الخطوات التالية غسل فقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر قابل للتثبيت الخلية الميتة حل تلطيخ واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا، في resuspend 100 ميكرولتر PBS، إضافة 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني، واحتضان 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا، resuspend لهم في 200 ميكرولتر الجليد الباردة الميثانول 70٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. </li></ol> ملاحظة: يمكن علاج الخلايا من الآن فصاعدا دون الاحتياطات بيولوجية!<ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 60 ميكرولتر ماجستير مزيج من 60 ميكرولتر PBS + 10 ميكروغرام / مل FC-كتلة (المضادة للFCR3 لمنع ملزم غير محددة). غسل الخلايا، resuspend لهم في 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + المضادة للFCR3 واحتضان 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + المضادة للFCR3 تحتوي على 1 ميكروغرام PE-إلى جانب الأجسام المضادة لمكافحة Foxp3، تخلط جيدا واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وتحليل الخلايا على تدفق عداد الكريات. </li></ol>

<ol>
	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

الجيل الفيروسات والمعايرة من أجل تحقيق النتائج المثلى ترنسفكأيشن، ونوعية وكمية خطي ناقلات يبدو الأكثر أهمية. نحن لم تراع الآثار السلبية على الإنتاج المحللة الأولية من فرط الأولي للثقافة منذ عدوى ستمضي قدما بسرعة بمجرد أن يحدث إن?...

Tregs حاسمة للحفاظ على التسامح المناعي وكبح الاستجابات المناعية المبالغة. Tregs قمع المارة تنشيط الخلايا T. ونتيجة لذلك، الاجتثاث من Tregs يؤدي إلى المناعة الذاتية القاتلة والتدمير الذاتي مدفوعا تنشيط خلايا T 1. Tregs تطوير في الغدة الصعترية خلال اختيار السلبية للCD4 السلائف إيجابية واحدة، ولكنها يمكن أيضا التفريق في محيط من السذاجة الخلايا CD4 T على جرعة منخفضة من التحفيز مستضد مع الأمثل 1،2 المشترك التحفيز. الغدة الصعترية Tregs يبدو لقمع المناعة الذاتية أنسجة ضد المستضدات عن النفس، في حين قد تورطت الطرفية Tregs في توفير التسامح في القناة الهضمية أو سرطان الرئة. هذه يسببها Tregs منع أكثر قدرة تنشيط الخلايا T بعد الاعتراف مستضدات الخارجية في الغشاء المخاطي، بما في ذلك مستضدات البيئية من الغذاء والهواء والبكتيريا المتعايشة، والمواد المسببة للحساسية 3،4. وبالإضافة إلى ذلك، Tregs حاسمة لإقامة التسامح الأمهات إلى الببتيدات الجنين 5 وإلى ما قبلتنفيس مرض الطعم ضد المضيف 6. في نفس الوقت، Tregs أيضا توسط آثار غير مرغوب فيها من قبل المخففة المراقبة المناعة من الخلايا السرطانية 7،8. ميزة السمة المميزة للTregs هو تعبير عن مجموعة فرعية-تحديد النسخ عامل Foxp3، وهو عامل شوكة الرأس النسخ المحتوية على نطاق ما هو ضروري وكاف لمنح وظيفة Treg 9،10. ومن المعروف أن بعض مسارات الإشارات التي يمكن أن تحفز التعبير Foxp3. ومع ذلك، فإن العمليات الجزيئية التي تتحكم، وتنظيم، أو تعدل Treg التمايز ردا على مستقبلات الخلايا T اثار مفهومة بشكل أقل. يمكن على نحو فعال للغاية أن يتسبب Tregs في المختبر من خلال تحفيز السذاجة الخلايا التائية CD4 مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 في حضور TGFβ وIL-2 11. كما Tregs الناشئة وظيفية في الجسم الحي، والتلاعب من الجزيئات التي تعزز تمايز Treg يحمل إمكانات هائلة لمستقبل therapiوفاق، على سبيل المثال، علاج الربو، مرض الاحساس، وزرع 11،12. على العكس، قد التشكيل العلاجية من الجزيئات لمنع التمايز Treg تقدم فائدة في توجهاته المستقبلية من الجمع بين العلاج من مرضى الأورام. في فحوصات المختبر تمايز كان لها دور أساسي لوصف التغيرات الجزيئية التي ترتبط مع الخلايا التائية التمايز فرعية. في هذه اللحظة، ومحاولات تجريبية للبحث أو شاشة للمنتجات الجينات التي تتحكم في تمايز الخلايا T يصطدمون بحقيقة أن الأساليب الأكثر شيوعا لحمل خارج الرحم التعبير الجيني في الخلايا T تفشل السذاجة. على سبيل المثال، electroporation وتنبيغ فيروسات الرجعية لا تكون فعالة إلا في تنشيط خلايا تي. وعلى النقيض من التوقعات الأولية، تنبيغ lentiviral، وهو فعال عادة في خلايا يستريح، يتطلب قبل تنشيط خلايا T السذاجة بواسطة السيتوكينات 13. وعلاوة على ذلك، ونقل [كدنا] أو مرنا خلال electroporationينطوي على إزالة الاستقطاب لغشاء البلازما، التي تمنح نفسها ملامح تنشيط الخلايا T وربما حتى تعبئة كا 2 + إشارات وتنشيط بروتينات NFAT (المراقبة غير منشورة والمرجع 14). وبالمثل، لتنبيغ فيروسات الرجعية، وخلايا T السذاجة أن يتم تفعيلها ل18 - 40 ساعة. خلال هذا الوقت، وانهيار الغشاء النووي في سياق انقسام الخلية يحدث ويسمح لإدماج الجيني لاحقة من ناقلات فيروسات الرجعية 15. ولذلك فإن هذه الأساليب ليست قادرة على معالجة تنظيم الجزيئية في وقت مبكر من اللقاء الأولي مع مستضد الخلايا التائية، وهي مرحلة حاسمة من المساعد T تمايز الخلايا. ومن المعروف تنبيغ الفيروسة الغدانية للتشاور عابرة خارج الرحم التعبير الجيني في عدد من أنواع الخلايا البشرية التي تعبر عن الإنسان كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). وتشرع دون الحاجة إلى تنشيط الخلايا أو تقدم دورة الخلية. التعبير سطح CAR أمر ضروري لكفاءة مرفق فيروس واستيعاب، والتعبير المعدلة وراثيا من النسخة اقتطاع CARΔ1 تحت المروج خلية محددة T وجد لتقديم thymocytes الماوس والخلايا T عرضة للإصابة الغدانية 16. الأهم من ذلك أن التحوير لا يغير تطوير خلية توتية أو التمايز في المختبر من خلايا CD4 السذاجة الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مختلفة (لا تظهر البيانات؛ المرجع 17). تنبيغ اتش بوساطة الخلايا T كانت تستخدم سابقا لمن overexpression 17،18 واضعا إلى أسفل النهج 19،20. يمكن تنقية الخلايا T المعدلة وراثيا من المتاحة تجاريا DO11.10 TG؛ CARΔ1 TG (تاكونيك، وشركة والمرجع 17). الأهم من ذلك، تنبيغ الفيروسة الغدانية يسمح التعبير عالية من الجين من الفائدة في الخلايا التائية السذاجة دون التسبب علامات واضحة على التنشيط. تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) بعد infectiفي ويمكن تفعيلها ومتباينة في Treg مماثلة لخلايا غير المصابة. ويمكن تحقيق إنتاج الفيروسات الغدية المؤتلف بعد ترنسفكأيشن من الخلايا HEK293A مع البلازميدات الغدانية (الشكل 1). تحتوي هذه البلازميدات عادة نوع الإنسان 5 الجينوم اتش مع الجينات وE1 E3 حذف لتقديم الفيروسات الغدية المؤتلف النسخ المتماثل غير كفء 21. الخلايا HEK293A تكمل نقص النسخ المتماثل كما تم خلدت أنها من خلال التكامل مستقرة من اتش المنفصمة 22. منذ ناقلات الفيروسة الغدانية كبيرة (~ 40 KB) وبالتالي لا مناسبة تماما لقيود التقليدية استنساخ انزيم بوساطة، قمنا بتوظيف النظام عبارة. يتم استنساخ الجينات في المصالح البداية إلى ناقلات دخول أصغر، من التي يمكن نقلها بسهولة إلى ناقلات الوجهة الغدانية عبر امدا رد فعل إعادة التركيب (LR) 23. اقمنا في pCAGAdDu ناقلاتمن خلال الجمع بين المروج CAG (الدجاج المروج الأكتين وCMV محسن) مع كاسيت التعبير التي تحتوي على مواقع LR المرافقة اختيار ccdB بدائي النواة علامة 24. وتنصهر هذه كاسيت التعبير إلى موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES) العنصر الذي يسمح coexpression للعدوى علامة تعزيز الخضراء بروتين فلوري حقيقية النواة (EGFP)، والتي تنصهر لتسلسل يحتوي على هرمون النمو البقري بولي (A) إشارة. اخترنا تسلسل رابطة الدول المستقلة التنظيم CAG، منذ تم العثور على CMV المروج prototypic أن تكون غاية التي تعتمد على تفعيل وبالتالي غير المواتية للتعبير الجينات في الخلايا التائية السذاجة. هنا، ونحن نقدم بروتوكول للكفاءة في المختبر Treg التمايز وطريقة لتنبيغ CD4 خلايا تي ساذجة دون تفعيل (الشكل 2). طريقة تمكن خارج الرحم التعبير الجيني أو نهدم CD4 T السابقة تمايز الخلايا في حالة السذاجة. لأنها تتيح اختبار تأثير من overexpresseد الجينات في المصالح أثناء الأحداث يشير في وقت مبكر على التحفيز TCR الأولية حتى T التزام فرعية الخلية. كما توفر التجارب التحقق من صحة لدينا أساس لإنشاء تطبيق اتش مماثلة في التفريق بين مجموعات فرعية أخرى T خلية مثل TH1، TH2، Th9، TH17، Th22، أو خلايا TFH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ضرورية لتوفير التسامح المناعي في تقرير المصير، وكذلك لبعض المستضدات الخارجية. يمكن أن تتولد Tregs من السذاجة خلايا CD4 T في المختبر مع TCR وشارك في التحفيز في وجود TGFβ وIL-2. هذا يحمل إمكانات هائلة لعلاجات المستقبل، ومع ذلك، فإن الجزيئات ومسارات الإشارات التي تمايز التحكم غير معروفة إلى حد كبير. يمكن التلاعب بها الخلايا التائية الأولية من خلال التعبير الجيني خارج الرحم، ولكن تفشل الطرق الشائعة لاستهداف الدولة السذاجة أهم من الخلية T قبل الاعتراف مستضد الأولية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول للتعبير عن الجينات خارج الرحم في السذاجة خلايا CD4 T في المختبر قبل إحداث تمايز Treg. وهو ينطبق تنبيغ مع اتش النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ويشرح جيل والإنتاج. واتش يمكن أن يستغرق إدراج كبيرة (تصل إلى 7 كيلو بايت) ويمكن أن تكون مجهزة مع المروجين لتحقيق overexp عالية وعابرةression في الخلايا التائية. فإنه transduces فعال السذاجة خلايا T الماوس إذا كانت تعبر عن المعدلة وراثيا كوكساكي مستقبلات الفيروس الغدي (CAR). الأهم من ذلك، بعد الإصابة تبقى الخلايا التائية السذاجة (CD44 المنخفضة، وارتفاع CD62L) ويستريح (CD25 -، CD69 -) ويمكن تفعيلها ومتباينة في Tregs مماثلة لخلايا غير المصابة. وبالتالي، تمكن هذه الطريقة من التلاعب CD4 T تمايز الخلايا من بدايتها. أنه يضمن التعبير الجيني خارج الرحم هو بالفعل في المكان عندما الأحداث يشير في وقت مبكر من التحفيز TCR الأولي يدفع التغيرات الخلوية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى Treg التمايز.

إنتاج فيروس لجيل من التتر فيروس عالية، توقيت الحصاد خلية HEK293A في إنتاج فيروس الأولية أو التضخيم فيروس أمر بالغ الأهمية. يتم عرض ممثل الفلورسنت والمرحلة على النقيض من الصور مع علامات مرئية من إنتاج الفيروس في الشكل 3. وقد لو...

Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

نقل الجينات الفيروسة الغدانية إلى الخلايا التائية CD4 السذاجة مع التعبير المعدلة وراثيا من مستقبلات اتش كوكساكي يتيح للتحليل الجزيئي للالتنظيمية تمايز الخلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt;.

تنبيغ الفيروسة الغدانية من CD4 الخلايا التائية ساذج لدراسة التمايز Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Views.  Helmholtz Zentrum München. نقل الجينات الفيروسة الغدانية إلى الخلايا التائية CD4 السذاجة مع التعبير المعدلة وراثيا من مستقبلات اتش كوكساكي يتيح للتحليل الجزيئي للالتنظيمية تمايز الخلايا T في المختبر.

Video: Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

التمايز في المختبر من خلايا CD4 الإنسان + FOXP3 + المستحثة تنظيم الخلايا التائية (iTregs) من خلايا CD4 + T السذاجة باستخدام بروتوكول تحتوي على TGF-β-

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

فك رموز التزام الخلايا التائية المساعدة المسامية المبكرة في عدوى LCMV الحادة

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

تسليط الضوء على المؤلف: توضيح مسارات تمايز خلايا TFH في تحديات LCMV الحادة

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

الوصول إلى التمايز المبكر للخلية التائية المساعدة المسامية CD4 + الخاصة بالفيروس في الفئران المصابة بفيروس LCMV الحاد

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...