Damos las gracias a Bernard Foucart de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Belga para la Investigación Científica (FRS-FNRS) y por el Fondo de la Reina Elisabeth de Investigación Médica. Agnès Villers es Investigador Asociado en el Fondo Belga para la Investigación Científica.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de los reglamentos para el cuidado y uso de animales en la investigación y con el acuerdo del comité de ética local. 1. Preparación artificial de fluido cerebro-espinal Los mismos medios de comunicación se utiliza para diseccionar, cortar y perfundir rebanadas (1 ml / min) durante el período de reposo y los registros electrofisiológicos. Este medio está compuesto de 124 mM de NaCl, 4,4 mM de KCl, 26 mM de NaHCO3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4 y 10 mM de D-glucosa. <ol><li> Pesar los diferentes componentes para 2 l de MgSO4 ACSF excepto que ya está en solución (1 M). Usando una solución estándar permite estar seguro de la concentración exacta de Mg 2 + porque MgSO4 en polvo es altamente higroscópico. Ca 2 +: Mg + 2 ratio influye mucho en la inducción y mantenimiento de LTP14 y por lo tanto sus proporciones deben ser siempre respetados. </li><li> Poner todos los componentes, excepto CaCl2 en un vaso aforado y llevar a 2 L con agua destilada H 2 O. </li><li> Agitar vigorosamente. Cuando todo esté disuelto, añadir carbógeno través de un burbujeador de acuario y tubo conectado al depósito (95% O 2, 5% de CO 2). Espere unos minutos y añadir cloruro de calcio cuando el pH se fija en 7,4 por la acción de tampón de bicarbonato. </li><li> Mantenga 600 ml en un plato de cristal rectangular refrigerado y enfriar a 4 ° C con hielo alrededor del plato. Estos medios serán utilizados para la disección hipocampo. </li><li> Filtrar el 1400 ml restantes y mantenerse en un erlenmeyer. </li></ol> 2. Preparación del Rig electrofisiológico y el corte de cerebro Cámara de grabación El circuito de perfusión es de 2 bombas peristálticas, uno bombear fluido fresco de un tanque de reserva y el otro de bombeo de fluidos utilizados en tque la grabación cámara a un bin. Se añade fluido fresco a un sistema de perfusión hecha en casa donde se reoxigene y se calentó antes de llegar a la cámara de grabación de interfaz por gravedad (Figura 1A). La cámara de grabación de interfaz fue diseñada por FST (Herramientas de Bellas ciencia, Vancouver, Canadá, Figura 1B). Rodajas de tejido se colocan en el filtro de red tejida unidos a un anillo bien extraíble y se puede mantener continuamente bajo condiciones de interfaz mediante el ajuste de la altura de la aguja de aspiración así. Un tubo de plástico de fabricación casera bloqueado en su extremo y perforada lateralmente (0,5 mm) se fija a la aguja de aspiración para aumentar la estabilidad de nivel en la cámara. El cabezal de impresión está montado sobre un baño de agua que contiene una piedra de dispersión de gas que ayuda a mantener un ambiente húmedo haciendo pasar aire húmedo a través de los puertos de deflexión en el cabezal de impresión (para disminuir la formación de gotitas de agua). Baño y media temperatura son controlados por la variación continua del nivel de DC th actualáspero una silicona de goma incorporado elemento calentador en el baño de agua. Termistores en el baño de agua y pozos de registro permiten la temperatura de la cámara para ajustar y controlar con precisión en estos sitios. El sistema de calefacción de la cámara se completa con un sistema de calentamiento global de control de la temperatura de todo el equipo de perforación. El software desarrollado por investigadores de la Universidad de Edimburgo ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) supervisa e iguala la temperatura del aire oxigenado, la porción del cerebro, los electrodos y la plataforma queda proporcionando un ambiente estable para grabaciones de larga duración (Figura 1C) . La temperatura usada para cortes de hipocampo de ratón es 28 ° C. <ol><li> Enjuague todo el circuito de perfusión con H2O destilada durante un mínimo de 20 minutos y empezar los sistemas de calefacción. </li><li> Iniciar el burbujeo carbógeno en el circuito. Carbogen llega a los caseros a través de tubos de perfusión fvelas Ilter y en el baño de agua por debajo de la cámara de registro. La velocidad de flujo en el baño de agua está controlada por un medidor de flujo. Si el caudal es demasiado lento, el tejido podría llegar a ser hipóxico. A la inversa, si la tasa de flujo es demasiado alta, el gas podría no ser suficientemente calentada y humectada que conduce a secado del tejido. Tasa de flujo de gas de alta también podría aumentar la posibilidad de pulverización de agua sobre el tejido del baño de agua por debajo que conduce a choque osmótico. Esto se puede evitar mediante la adición de bits de malla de nylon (100 micras) en la salida de los puertos de deflexión. </li><li> Vaciar el circuito y se llenan de ACSF filtrada. </li><li> Coloque el anillo que apoyará el corte en la cámara de retención. Un filtro de red tejida con aberturas de malla que van de 500 a 750 micras se estira y unido al anillo con dos partes de resina epoxi pegamento. El filtro de red tejida está hecha de 87% poliamida y 13% elastano (Panty 15 den). Pegamento se debe aplicar cuidadosamente para evitar la formación de relieves en la superficie del ring. </li><li> Retire con cuidado todas las burbujas de aire del circuito. </li><li> Ajuste el nivel de ACSF en la cámara de registro con el tornillo de la aguja de aspiración. La velocidad de las bombas peristálticas se ajusta a 1 ml / min para la entrada de la bomba y a 5 ml / min para la salida de la bomba. </li></ol> El sistema de perfusión se coloca sobre una mesa de vibración-resistente y rígido rodeado por una jaula de Faraday. 3. Preparación de la zona de disección Los instrumentos quirúrgicos: un bisturí con una hoja # 11, unas tijeras pequeñas estándar disección, tijeras, pinzas de resorte curvas, dos Heidemann espátulas y una cuchara. Material complementario: una guillotina, una almohadilla inferior, un cortador de tejidos McIlwain con una hoja de afeitar, papel de filtro, una pipeta Pasteur de vidrio con una tetina de goma, 2 Pipetas Pasteur plástico uno de los cuales con una boca ancha, una placa de Petri, un cilindro metálico de 7 mm de diámetro (Figura 2A). <ol><li&gt; En el plato de disección llena de frío ACSF (preparado en el paso 1), sumerjo una tapa de vidrio refrigerada de una placa de tinción, envuelto en papel de filtro. Retire con cuidado las burbujas de aire y oxigenar la ACSF a través de un burbujeador de acuario (Figura 2A). </li><li> Diseñar instrumentos con el fin de uso. Añadir tres capas de papel de filtro en la placa de cortador de tejidos y una nueva hoja de afeitar limpia con agua destilada y éter (Figura 2B). La cuchilla debe ser horizontal cuando toca el papel. Fuerza de la cuchilla se ajusta a la mitad del valor máximo y la velocidad a aproximadamente un tercio del valor máximo. </li><li> Atentamente comprobar si todo está listo (instrumentos, temperatura ...) porque no tendrá tiempo después. </li><li> Pídale a alguien que rociar la disección con una pipeta Pasteur llena de ACSF frío. </li><li> Anestesiar el ratón con IP Nembutal (100 mg / kg) antes de la decapitación. Anestesia con halotano también se puede utilizar. Hemos comparado los dos métodos y obtaINED mismos resultados. Decapitación debe realizarse bajo anestesia pero dislocación cervical también puede ser utilizado. Sin embargo dislocación cervical necesita una muy buena práctica para evitar el sufrimiento de los animales. </li><li> Disección de la underpad lo antes posible bajo la ducha continua ACSF frío. </li></ol> 4. La extracción del cerebro <ol><li> Mientras mantiene todavía la cabeza con el dedo índice y el pulgar de una mano en la boca del cañón, hacer una incisión con las tijeras de disección a lo largo de la mitad de la parte superior de la cabeza de partida en el borde del corte de guillotina y funcionando rostral al hueso frontal . </li><li> Cortar a través del músculo cutáneo en cada lado de la cabeza para exponer completamente las placas de cráneo y eliminar los músculos en el lado caudal de la cabeza. </li><li> Con las tijeras de disección, corte el músculo temporal en cada lado, a lo largo de la placa temporal, a continuación, cortar las placas frontales en el medio, transversalmente. A continuación, hacer un pequeño corte en el hueso occipital, entre los dos plates. </li><li> Para cada lado, cortado en la base caudal de las placas occipitales. </li><li> Corte a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras de primavera. </li><li> Con unas pinzas, retire las mitades de cráneo, mediante la difusión de lejos el uno del otro. </li><li> Con el bisturí, cortado transversalmente justo después de que el bulbo olfatorio y justo antes de que el cerebelo entonces sumergirse el cerebro extraído en el plato de disección con ACSF frío. </li></ol> 5. Disección del hipocampo <ol><li> Una vez que el cerebro está sumergido en el plato de disección, cortar los dos hemisferios de uno al otro con un escalpelo insertado en el centro. </li><li> La disección de hipocampo se realiza con espátulas bajo control visual a través de un microscopio quirúrgico binocular (X25, Figura 2A). En uno de los hemisferios, se extendió con cuidado las estructuras para ver el ventrículo lateral. Retirar el tallo cerebral y el diencéfalo. Esto se hace mediante la aplicación de la espátulas en la corteza frontal en un lado y en el diencéfalo en laotro lado. Tenga cuidado de no tocar el hipocampo con espátulas y no estirarlo durante el corte del tejido. </li><li> Sever el fondo de saco y luego empuje suavemente el hipocampo de la corteza (removerá), mediante la inserción de una espátula en el ventrículo. </li><li> Cuando se extrae el hipocampo, eliminar el exceso de tejido de la corteza y el resto de los vasos sanguíneos. </li></ol> 6. El corte de las rebanadas <ol><li> Con un plástico de boca ancha pipeta Pasteur, transferir el hipocampo en una cuchara con su superficie hacia arriba Alvear (lado convexo). </li><li> Retire el exceso de líquido con una pipeta Pasteur de plástico estándar. </li><li> Incline la cuchara verticalmente casi tocando el papel de filtro del helicóptero (Figura 2B) y dejar el hipocampo de la cuchara, tocando rápidamente el papel de filtro y retírese la cuchara. </li><li> Orientar el hipocampo y cortarlo transversalmente a 400 micras con el helicóptero (véase la figura 2C para la orientación del hipocampopus con respecto a la hoja de afeitar). Actuar lo más rápidamente posible. </li><li> Retire el papel de filtro con el hipocampo en rodajas y se envuelve alrededor del cilindro metálico para difundir las rodajas un poco. Entonces, sin los cortes con chorros de ACSF utilizando un plástico pipeta Pasteur y su recopilación en una placa de Petri llena de ACSF fría estándar. </li></ol> 7. La incubación de las rebanadas de la interfaz de <ol><li> Seleccionar rebanadas con un plástico pipeta Pasteur estándar y rápidamente colocarlos en la cámara de registro. Rebanadas recuperarse del trauma disección directamente en la cámara de registro, en la interfaz a 28 ° C. </li><li> El corte lo más probable fregadero. Baje el nivel de líquido para alcanzar el nivel de macro, y luego elevarlo a hacerlo flotar. </li><li> Gire el corte en la posición correcta mientras que la reducción del nivel. Las rebanadas son siempre orientado en la misma forma para facilitar la colocación de los electrodos (2 estimulante y uno electrodos de registro) en la región CA1. </li><li> Deténgase cuandoel fluido es en la interfaz. Un &quot;menisco&quot; de los medios de comunicación alrededor de la rebanada es indicativo de un nivel suficiente de medios de comunicación. El filtro de red debe estar saturado con los medios de comunicación, pero no completamente sumergido. </li><li> Mantenga la cámara cubierta con papel de filtro colocado sobre la tapa perforada. </li><li> Dejar reposar la rebanada durante al menos 1,5 horas a 28 ° C. </li></ol> 8. Grabación de las respuestas sinápticas <ol><li> Grabación de electrodo: capilares de vidrio se retiró para obtener una resistencia a punta de 2-5 mW cuando se llena de ACSF. Un pequeño trozo de papel de filtro se coloca alrededor de la punta del electrodo y la cera de hueso se aplica en la extremidad para reducir la condensación. Electrodos de estimulación: platino iridio electrodos bipolares de racimo con un diámetro de 12,5 micras se compran a FHC (EE.UU.). Con el cuidado adecuado, cada electrodo se puede utilizar al menos 30 veces (Figura 1B). </li><li> La posición de los electrodos en el stratum radiatum de la región CA1, todos los electrodos alineadosarriba (Figura 3A). Los electrodos se bajaron 75 a 150 micras debajo de la superficie de la rebanada con micromanipuladores Narishige. Los dos electrodos de estimulación se colocan para estimular dos paquetes distintos de Schaffer colaterales. Cuando los electrodos se bajan en el sector, filtros de papel son cuidadosamente colocados a su alrededor para cerrar la cámara. </li><li> La estimulación bifásica (0,08 mseg duración del pulso por medio de la onda) se lleva a cabo a un voltaje constante con un estimulador Grass conectado a unidades de aislamiento SIU-V. La respuesta máxima se comprueba mediante el aumento de la intensidad del estímulo de 2 V a un máximo de 12 V. EPSP de campo son amplificados 1000 veces con un amplificador de WPI ISO-80 y se filtraron a 10 Hz y 10 kHz. La señal se envía entonces a un PC a través de un Instrumento Nacional convertidor A / D. Estimulación, adquisición y análisis de datos se realizaron con el programa WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSP de campo se registran al 40% de la amplitud máxima obtenida en una entrada Salidaponer curva. Para cada sector, las laderas fEPSP se normalizaron en contra de la pendiente media en el min 30 anterior LTP inducción. </li><li> LTP se activa mediante la aplicación de un solo tren de estimulación (100 Hz) a la fuerza de prueba en una vía, mientras que la segunda vía sirve como un control. </li></ol> 9. La limpieza de la instalación <ol><li> Enjuague todo el circuito con una solución al 3% de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) por lo menos durante 10 min, luego de drenaje. El circuito se enjuaga cuidadosamente con agua destilada antes de comenzar cualquier experimento. El uso de H 2 O 2 no es absolutamente necesario que otros laboratorios utilizan únicamente agua destilada para limpiar, pero hemos notado la deposición de residuos oscuros en el sistema de tuberías cuando se utiliza sólo agua. </li><li> Cambie el agua en el baño de agua por debajo de la cámara de registro. </li><li> Baño de los electrodos de estimulación consejos en alcohol durante 5 min. </li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos desarrollado en nuestro laboratorio un protocolo resultante de la combinación de los métodos desarrollados y utilizados por otros laboratorios que tienen una gran experiencia en la LTP grabaciones 11,17. Este protocolo está adaptado para adultos hipocampo del ratón y se puede utilizar en animales de cualquier edad y de cualquier genotipo fondo. También permite el análisis de LTP en ratones transgénicos en desarrollo las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer 18,19.</...

Hoy en día, hay una comprensión limitada de cómo se almacenan y recuperan en el plano del circuito neuronal recuerdos complejos. Sin embargo, una hipótesis unificadora de almacenamiento de memoria está disponible y ampliamente aceptado: memorias se almacenan como los cambios en la fuerza de las conexiones sinápticas entre neuronas en el sistema nervioso central. Por su parte, la investigación sobre la plasticidad sináptica se ha beneficiado en gran medida a partir de dos grandes descubrimientos. (1) En un experimento seminal, Bliss y Lomo 1, usando el conejo anestesiado intacta, encontraron que la entrega de un breve de alta frecuencia (1 seg, 100 Hz) la estimulación de la vía perforante del hipocampo causó una larga duración (varias horas) el aumento de las conexiones sinápticas relacionadas. Este fascinante fenómeno se llama &quot;potenciación a largo plazo&quot; o LTP por Douglas y Goddard en 1975 2. (2) Posteriormente, se encontró que un fenómeno similar podría ser activado en rodajas de cerebro (0,4 mm) mantenida artificialmente en activo in vitro </em&gt;. La LTP más ampliamente estudiado se observó in vitro mediante la entrega de uno o varios tetani a un haz de axones (los llamados colaterales de Schaffer) durante la grabación del campo de potencial sináptico excitatorio resultante evocado en las neuronas piramidales de la llamada región CA1. Los mecanismos de inducción de LTP en gran medida han sido revelados. Básicamente, un influjo de Ca2 + a través de los receptores de NMDA activa las enzimas con dos consecuencias: una fosforilación de los receptores AMPA (lo que aumenta su eficiencia) y una incorporación de los receptores AMPA supletorias en la membrana postsináptica 3. Por el contrario, los mecanismos de la fase de mantenimiento de la LTP son en gran parte desconocidos, en particular debido a que es experimentalmente mucho más difícil mantener una rebanada saludable para muchas horas de durante 30 a 60 min. Una gran cantidad de estudios se han dedicado a la comprensión de los mecanismos de LTP y teorías interesantes han sido elaborados durante los años 4-11. Pero sinhasta ahora, los mecanismos moleculares precisos que subyacen en el aumento estable en la fuerza sináptica no se han dilucidado. Esto podría deberse en parte a la dificultad de reproducir los resultados anteriores en distintos laboratorios, utilizando diferentes técnicas para la preparación y el mantenimiento de los cortes de hipocampo. En su documento sobre la metodología, Sajikumar et. Al 12 hizo hincapié en la importancia de las condiciones experimentales para la preparación de rodajas de hipocampo de rata y el registro de LTP estable. En este video se presenta todos los pasos de optimización desarrollados en nuestro laboratorio en los últimos años para poder grabar una LTP muy estable en rodajas de hipocampo de ratón. Esta optimización se ha realizado a partir de protocolos desarrollados y utilizado con éxito por otros laboratorios que estudian los mecanismos de LTP en ratones y ratas 13 11. Se permite a los investigadores experimentados para inducir y grabar un LTP duración muy larga en ratones adultos con una alta tasa de éxito. El physiological base de la LTP inducida fue comprobado cuidadosamente y demostró 14. En este documento sobre la metodología, se muestra que las modificaciones de las condiciones experimentales, como la temperatura o la oxigenación pueden tener un profundo impacto en el mantenimiento LTP, mientras que el procedimiento de disección puede modificar profundamente rebanadas excitabilidad. También debe hacerse hincapié en que el control preciso de todos estos parámetros requiere una formación de varios meses para los estudiantes novatos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

Potenciación a largo plazo (LTP) es un tipo de plasticidad sináptica que se caracteriza por un aumento en la fuerza sináptica y cree que está involucrado en la codificación de la memoria. LTP suscitó en la región CA1 de cortes de hipocampo agudos se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la fase de mantenimiento de este fenómeno son aún poco conocidos. Esto podría deberse en parte a las diversas condiciones experimentales utilizadas por diferentes laboratorios. En efecto, la fase de mantenimiento de la LTP es fuertemente dependiente de los parámetros externos, como la oxigenación, temperatura y humedad. También depende de los parámetros internos como orientación del plano de corte en lonchas y viabilidad rodaja después de la disección. La optimización de todos estos parámetros permite la inducción de una potenciación muy reproducible y muy estable a largo plazo. Esta metodología ofrece la posibilidad de explorar más a fondo los mecanismos moleculares implicados en el aumento estableen la fuerza sináptica en rebanadas de hipocampo. También destaca la importancia de las condiciones experimentales de investigación in vitro de los fenómenos neurofisiológicos.

Esta metodología se ha utilizado para analizar las propiedades de larga duración potenciación a largo plazo inducida en cortes de hipocampo agudos de C57Bl/6J ratones adultos (JANVIER SAS, Francia) 14. Sorprendentemente, la mejora de las condiciones experimentales ha dado lugar a una nueva forma de ver la LTP. Hemos demostrado que aumentan la larga duración en la fuerza sináptica no requiere la síntesis de nuevas proteínas. Aquí, mostramos que la inducción de LTP depende ...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y conservar<em&gt; In vitro</em&gt; Cortes de hipocampo agudos de ratones adultos. Este protocolo permite la grabación de la potenciación a largo plazo duradera muy estable (LTP) durante más de 8 horas con una tasa de éxito del 95%.

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K vistas.  University of Mons. En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y conservar In vitro Cortes de hipocampo agudos de ratones adultos. Este protocolo permite la grabación de la potenciación a largo plazo duradera muy estable (LTP) durante más de 8 horas con una tasa de éxito del 95%.

Video: Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...