Usando nuestra técnica, podemos probar posibles sustancias antiepilépticas dentro de muestras cerebrales humanas para ayudar en el desarrollo de fármacos para la epilepsia del lóbulo temporal. El tejido cerebral humano tiene la ventaja de romper la tapa traslacional entre la investigación básica y las aplicaciones clínicas. El día del procedimiento o tan tarde como sea posible el día anterior, descongelar 50 mililitros de una solución de aCSF de colina 10x en un baño de agua de 37 grados Celsius y añadir la solución descongelada y 50 mililitros de solución de 10x dos a aproximadamente 300 mililitros de agua doble destilada.
Añadir las concentraciones finales de glucosa y cloruro de calcio a la mezcla y remover hasta que se disuelva. A continuación, agregue agua de doble destilado a un volumen final de 500 mililitros. Mida la osmolaridad.
Y llenar una botella con aproximadamente 100 mililitros de la 1x colina aCSF. El día del procedimiento, enfriar el 1x colina aCSF sobre hielo y utilizar un dispensador de gas de vidrio conectado al gas car carbógeno para carbogenar la solución durante al menos 10 Para 15 minutos. Al menos 10 a 15 minutos antes del procedimiento, precalienta el aCSF de almacenamiento, potasio alto más 4-aminopiridina aCSF, y bajo magnesio más bicucullina a 35 grados Celsius con carbogenación.
Para preparar la cámara de interfaz, corte dos trozos de papel de filtro de cuatro por dos centímetros para cada compartimiento de sujeción de rodajas y apile las piezas una encima de la otra. A continuación, coloque cuerdas de algodón delgadas alrededor de los trozos de papel de filtro dentro de los compartimentos para romper la tensión de la solución y para asegurar un flujo uniforme. Y coloque de tres a cuatro trozos de papel de filtro de 1,5 por uno centímetro en la parte superior de la hoja más grande de papel de filtro en cada compartimiento.
Antes de adquirir las rodajas de tejido, utilice 70% etanol para limpiar el área de preparación y coloque una cubierta sobre el área. Coloque súper pegamento, dos pinzas afiladas, una espátula, un bisturí con cuchillas y una hoja para el corte brusco del tejido cerebral cerca del vibratome. Limpie la bandeja tampón y la placa de muestra del vibratome con 70%etanol.
Cuando la bandeja de tampón esté completamente seca, cúbrala con papel de aluminio y coloque la bandeja en el baño de hielo. Llene el baño de hielo con hielo triturado y mantenga el baño a menos 20 grados centígrados hasta la preparación. A continuación, limpie el vibratome y la cuchilla de afeitar con 70% de etanol y calibre el vibratome para minimizar las vibraciones verticales y el daño tisular durante el procedimiento de corte.
Inmediatamente después de adquirir la muestra de tejido, retire el tejido de la colina de transporte aCSF y corte las porciones quemadas de tejido. Cortar una superficie uniforme para facilitar el encolado de la pieza de tejido en la placa de la muestra y utilizar el vibratome para cortar el tejido cerebral en rodajas de 400 micrómetros de espesor, ajustando la amplitud y velocidad del vibratome según sea necesario durante el corte. Algunas partes del hipocampo humano pueden ser más resistentes al corte que otras.
Tener un cuidado y un tiempo adicionales puede mejorar en gran medida la calidad de la muestra. Use un bisturí para recortar las rebanadas cerebrales para encajar en la cámara de grabación y utilice una espátula y pequeños fórceps para colocar cuidadosamente las rodajas en los pequeños trozos de papel de filtro en la cámara de interfaz durante al menos una hora. Para el registro de actividad epileptiforme, coloque una membrana semipermeable pegada a un anillo de plástico en la cámara y conecte los tubos de entrada y salida de la cámara a una bomba peristáltica.
Llene los tubos y la cámara con aCSF carmogenado precalentado. Para preparar los electrodos de grabación, llene las pipetas de vidrio de uno a dos megaohm con 154 solución de cloruro de sodio milimolar. Coloque las pipetas en un soporte de electrodo y utilice pinzas y una espátula para transferir una rebanada de hipocampo de la cámara de interfaz a un plato de Petri lleno de aCSF carbogenado.
Retire el papel del filtro sin voltear la rebanada y coloque la rebanada en la cámara de grabación. Sostenga la rebanada en su lugar con la malla de corte y coloque los electrodos en la región de interés. Comience la grabación.
La actividad de ráfaga inducida por el potasio alto más 4-aminopiridina debe ser visible de dos a cinco minutos después del lavado, mientras que la inducción de eventos similares a convulsiones por bajo magnesio más bicucullina puede tomar hasta 30 minutos. La aplicación de potasio alto más 4-aminopiridina induce actividad epileptiforma en forma de eventos de ráfaga en pocos minutos. Los eventos similares a las convulsiones con una duración de más de 10 segundos se pueden inducir con la aplicación de magnesio bajo más bicicucullina.
El número de eventos de ráfaga disminuye tanto durante la aplicación de lacosamida como durante la aplicación de dimetiletanolamina, aunque las amplitudes no se ven afectadas en su mayoría. La calidad del tejido cerebral también se puede mejorar mediante la reducción de la contaminación y el daño durante la preparación. Las rebanadas cerebrales humanas preparadas con nuestros métodos también se pueden utilizar para investigar las funciones fisiológicas básicas de las neuronas usando la abrazadera de parche o investigar la expresión génica utilizando diversas técnicas.
Laboratorios de todo el mundo han comenzado a estudiar mecanismos básicos dentro del cerebro humano, y estos conocimientos se pueden utilizar para ayudar en el desarrollo de drogas y se pueden probar utilizando nuestros métodos propuestos.
