Este trabajo fue financiado en parte por el BBSRC (BB/1006478/1). PRR es el beneficiario de una beca de investigación de la Universidad de la Royal Society.

1. Consideraciones Estratégicas <ol><li> La elección de las semillas-cristales utilizado para los experimentos de microsiembra variará dependiendo del objetivo del experimento. Al inicio de un proyecto es de gran ayuda para encontrar varios éxitos de cristalización que pueden proporcionar puntos de partida alternativos para la optimización de cristal. Rmms reduce en gran medida la necesidad de optimización de cristal porque los cristales de buena calidad son más propensos a crecer en la zona metaestable del diagrama de fases, es decir, en la región en la que después de una perturbación o nucleación el sistema vuelve al equilibrio. Por lo tanto sugerimos utilizar RMM rutinaria, tan pronto como se obtengan los primeros cristales (o, más exactamente, tan pronto como los primeros cristales dejan de crecer). </li><li> Para la ronda inicial de RMM, una reserva de semillas debe hacerse con la mayor cantidad de material cristalino como sea posible. Si sólo hay un bien disponible que contiene cristales o si los cristales son pequeños, puede ser útil crear múltiples repeticiones de laéxito original (sin siembra) para aumentar la oferta de los cristales. Si, sin embargo, se obtienen varios resultados diferentes, cristales de siembra se pueden cosechar a partir de varias condiciones y se mezclan juntos. </li><li> Para evitar la separación de fases, los cristales que crecen en condiciones de alto contenido de sal deben ser cosechados por separado a partir de cristales que crecen en condiciones de alto PEG. Si se mezclan cristales de varios pozos, una solución de reserva que es menos probable para dar cristales de sal debe ser seleccionado para suspensión de siembra. Por ejemplo, altas concentraciones de fosfato, sulfato, calcio y magnesio se deben evitar. </li><li> Más tarde, en un proyecto que puede ser importante para buscar cristales con diferentes células de la unidad con el fin de mejorar la difracción, evitar cristales maclados y obtener cristales que son adecuados para los ligandos de unión. En esta etapa sólo los cristales más adecuados (por ejemplo, los que difractan mejor) se debe utilizar para hacer que la población de siembra. A veces se necesitan rondas repetidas de microsiembra, donde sólo la &quot;mejor&quot;Cristales se utilizan para hacer la reserva de semillas para la siguiente ronda. Si es posible, una&quot; precipitante neutro &quot;tal como PEG 3000 debe ser utilizado para suspender los cristales de siembra en animar a nuevos contactos de cristal y para cristalizar complejos que pueden ser inestables en alto soluciones salinas-12. </li><li> Experimentos microsiembra clásica, donde se utiliza una sola condición de cristalización, a menudo son útiles después de la identificación de una condición prometedora y durante la optimización posterior. A menudo es necesario para diluir la población de semillas con el fin de obtener el número deseado de cristales por gota. A &quot;combinatoria&quot; experimento microsiembra (donde se añaden una serie de reservas de semillas para aumentar la dilución a una condición de cristalización) es un método rápido para encontrar la dilución óptima de las existencias de semillas. Este enfoque se describe a continuación. </li></ol> 2. Preparación de Semilla de la Bolsa <ol><li> Hacer una sonda de vidrio redondeada de una pipeta Pasteur de vidrio utilizando una llama Bunsen. <ol><li> Calentar la pipeta cerca de la mitad hasta que se ablande, luego retire rápidamente del fuego y sacarlo tirando de los extremos. Objetivo para tirar el vaso a un diámetro inferior a 0,25 mm. </li><li> Romper el vidrio en el punto en el que es de alrededor de 0,25 mm y sumergirse brevemente el extremo roto en la llama. Repita este procedimiento hasta un hemisferio de vidrio con un diámetro de ~ 0,75 mm está formada en el extremo. Esta sonda es útil para la trituración de material cristalino, ya que tiene el tamaño adecuado para golpear objetos sólidos en la escala de 0,01 a 1,0 mm y que no daña la superficie de plástico de una cristalización bandeja sub-bien o cubreobjetos. Sondas más grandes (~ 1,0 mm) se pueden aplastar a los pequeños cristales de manera más eficaz porque los cristales se encuentran atrapados entre el vidrio y el plástico. </li></ol></li><li> Coloque un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene una semilla de bolas de hielo. </li><li> Inspeccionar una bandeja de cristalización pre-establecido mediante un microscopio binocular o sistema de imagen cristalina y seleccione uno o más apapropiado pozos de la bandeja desde la que cosechan material cristalino para la generación de semillas. Cualquier material puede ser utilizado incluyendo agujas finas, esferulitas, microcristales y cristales irregulares, mal formados. La reserva de semillas debe hacerse tan pronto como sea posible después de que los cristales dejen de crecer, como material de más edad es más probable que sea reticulado parcialmente, reduciendo así su idoneidad para el uso en experimentos de siembra. Si existe alguna duda en cuanto a si el material cristalino para ser cosechado es la sal o la proteína del pozo puede ser visualizado usando un microscopio de fluorescencia UV o sistema de imagen antes de la apertura, o el material cristalino puede ser sometido a in situ análisis de difracción de rayos X en la bandeja. Al utilizar los antiguos cristales de proteínas enfoque será fluorescente bajo irradiación UV, aparecerán incoloro cristales de sal. </li><li> Abra bien la bandeja de cristalización seleccionada. Para 96 ​​pocillos sentado bandejas gota cortar a través de la lámina de sellado superior de plástico alrededor del pozo seleccionado using una hoja de bisturí. Para las bandejas gota colgante 24-así quitar el cubreobjetos usando un par de pinzas. Invierta el cubreobjetos y colóquelo en una superficie limpia y estable. Retire 50 l de la solución de reserva y la transferencia de este líquido al tubo de microcentrífuga que contiene la Semilla de bolas de asegurar que el tubo permanece en el hielo en todas partes. </li><li> Aplastar a fondo los cristales en el subwell (bandeja de 96 pocillos) o cubreobjetos (bandeja de 24 pocillos) gotas, usando la sonda de vidrio preparado en la sección 2.1, se muestran los resultados bajo un microscopio. Pequeños cristales pueden tardar varios minutos para aplastar a fondo. Este paso permite que el experimentador para comprobar que los cristales son fáciles de aplastar y por lo tanto no están reticulados, y también que no son cristales de sal. Los cristales de sal producen un chasquido característico que se puede escuchar y sentir cuando son aplastados. Si los cristales son duras y difíciles de triturar intento de obtener y utilizar el material más fresco. </li><li> Retire 5 l de la solución de reserva desde el tubo de bolas de semillas y transfer al equivalente sub-well (sentado experimento de la gota) o cubreobjetos (colgando experimento de la gota) que contiene el material cristalino para ser cosechado. Pipetear este líquido hacia arriba y abajo 5-6 veces para resuspender como gran parte de los contenidos de sub-así o cubreobjetos como sea posible. Volver a la suspensión en el tubo de bolas de semillas y repita este paso dos veces más, asegurarse que el material cristalino como mucho se cosecha posible. </li><li> El vórtice grano de la semilla durante dos minutos, deteniéndose cada 30 segundos para enfriar el tubo en hielo. </li><li> Hacer una serie de dilución, la dilución de la solución de stock de semillas en depósito por un factor de 4 a 10 en cada etapa. Típicamente, demasiados cristales se obtienen cuando se utiliza un stock de semillas sin diluir, a fin de utilizar las reservas de semillas diluidas para controlar el número de cristales por pocillo. En la primera ronda de RMM, es importante no para diluir la solución madre de semillas, ya que a mayor concentración de semillas se pueden obtener los más golpes de cristalización. </li><li> Si no es para ser usado inmediatamentetamente, transferir el stock de semillas de suspensión y el stock de semillas diluida a un -20 ° C o -80 ° C congelador para el almacenamiento. Para evitar los ciclos de congelación-descongelación, lo que puede reducir la eficacia de las acciones de la semilla, almacene este material en pequeñas alícuotas de volumen, es decir, 10 a 20 l. Una vez congeladas, las reservas de semillas pueden mantenerse de forma indefinida hasta que se necesite. </li></ol> 3. Establecimiento de cristalización bandejas <ol><li> Dependiendo de la disponibilidad de instalaciones de cristalización y las preferencias del experimentador, el cribado de cristalización Rmms se puede realizar utilizando cualquiera de las bandejas de 24 pocillos empleando el método de difusión de vapor de gota colgante, o bandejas de 96 pocillos usando el método de difusión de vapor de gota sentado. Bandejas de cristalización para Rmms se pueden establecer ya sea a mano, utilizando un dispensador de manejo de líquidos robótico, o una combinación de los dos. </li><li> Un experimento típico de RMM configurar manualmente comprenderá, 1,0 l solución de proteína, condiciones de cristalización 1,0 l, y0,5 l de semillas. Un experimento típico creado usando un robot de cristalización comprenderá, solución de proteína de 0,3 l, 0,2 l condiciones de cristalización, y 0,1 l de semillas. </li><li> Para llevar a cabo el cribado Rmms en 24-así colgando bandejas de gota, en primer lugar, utilizando una pipeta manual, transferir 300 l de cada condición de una pantalla de condiciones de cristalización de 96 pocillos en 10 ml de formato de un solo tubo en cada pocillo de 4 x 24 pocillos cristalización engrasados bandejas. <ol><li> Transferencia de 1 l de cada condición de cristalización a partir de cada 300 l depósito sobre la superficie de un cubreobjetos de plástico correspondiente a partir del cual se han eliminado ambas tiras de respaldo de protección delanteros y traseros. </li><li> A los 1 l de cada condición de cristalización añadir 1 l de solución de proteína, seguido de 0,5 l de cristales de siembra de valores. Invertir cada cubreobjetos de tal manera que la gota de líquido se enfrenta y la posición por encima de la adecuada bien hacia abajo. </li><li> Presione hacia abajo sobre el cubreobjetos, comprimiendo el sealing grasa y la formación de un sello seguro. Una vez que todas las gotas 96 se establecen, la bandeja debe ser transferido a una incubadora o sala a temperatura constante, por lo general en el rango de 4-18 º C para el almacenamiento. </li></ol></li><li> Para llevar a cabo el cribado Rmms en 96-así sentado bandejas gota en primer lugar, transfieren 20-50 l de cada condición de una pantalla de condiciones de cristalización de 96 pocillos en formato de bloque así profundamente en cada pocillo correspondiente de la bandeja de cristalización. Esta etapa de transferencia puede llevarse a cabo utilizando ya sea un robot de cristalización, o por transferencia manual usando una pipeta de 8 canales. <ol><li> Soluciones de reserva de depósito de transferencia, proteínas y semillas a las gotas a mano o con un robot utilizando los volúmenes que se detallan en el apartado 3.1. Algunos robots de cristalización disponibles comercialmente no entren en contacto de dosificación, y la semilla rendimiento Stock transferencia utilizando un sistema de este tipo puede dar lugar a la obstrucción de dispensar consejo o tubos asociados. El orden de dispensación es variable: algunos robots dispensan todas las soluciones de forma simultánea. Siesto no es posible, prescindir de proteínas en primer lugar, a continuación, embalse, luego sembrar valores. </li><li> Si un contacto de dispensación robot no es de transmisión disponible en las semillas usando una jeringa de vidrio de bajo volumen con una aguja roma. Enjuague la aguja haciéndola pasar a través de la solución de reserva a continuación dispensar la población de semillas en cada gota. </li><li> Sellar la bandeja utilizando lámina adhesiva transparente y transferir a una incubadora o sala de temperatura constante para su almacenamiento. </li></ol></li></ol> 4. Inspección de cristalización Bandejas <ol><li> Visualizar todos los experimentos de cristalización utilizando un microscopio binocular o un sistema de imágenes de cristal. El ex general ofrece al usuario un mayor control sobre la profundidad de vista y el grado de ampliación que el segundo, pero es más lento. </li><li> Inspeccione cada sub-well/coverslip en secuencia y grabar cualquier evidencia de la formación de cristales. Los experimentos deben ser inspeccionados una vez cada 24 horas durante 5 días tras el establecimiento y lan, posteriormente, una vez cada 7 días para un máximo de 4 semanas. </li><li> Múltiples ciclos de RMM se requieren a menudo antes de que se producen cristales de calidad de difracción óptima. </li></ol>

<ol>
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Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En este trabajo se ha descrito un método general para la detección de la cristalización de proteínas RMM. Hemos demostrado el uso de dos proteínas de prueba una mejora significativa en la tasa de éxito de cristalización usando este método. El análisis de difracción usando radiación de sincrotrón de un subconjunto de cristales generados usando Rmms y métodos no Rmms reveló poca variación en la calidad de difracción entre cristales crecidos usando cualquiera de los métodos, aunque los autores anteriores h...

Desde su aplicación inicial por Perutz, Kendrew y compañeros de trabajo en la determinación de las estructuras de la hemoglobina y la mioglobina, a los modernos de alto rendimiento tuberías automatizados de la genómica estructural consorcios, cristalografía de rayos X macromolecular nos ha proporcionado una visión estructural sin precedentes en el mundo de la proteína . Esta técnica sigue siendo el método experimental más ampliamente aplicable que permite la visualización directa de la estructura de la proteína en atómica, o cerca de resolución atómica (es decir, en el rango de 1-3). Un requisito previo para la difracción de rayos X para ser aplicado a una proteína es que primero debe ser cristalizado, y es esta etapa del proceso que sigue siendo el paso limitante de la velocidad mayor solo en la determinación de la estructura por métodos de difracción 1, 2. A pesar de los avances significativos en nuestra comprensión del proceso de cristalización de proteínas, y mejoras importantes en la calidad y disponibilidad de pantallas de cristalización,bandejas, y las tecnologías relacionadas, sigue siendo imposible predecir con fiabilidad la probabilidad de éxito de cristalización 3. Los métodos bioquímicos y biofísicos se pueden aplicar para evaluar si una proteína de interés muestra características favorables para la nucleación y el crecimiento cristalino, es decir, es bien plegada-, homogénea, monodisperso, etc, sin embargo, estos puntos de vista de ninguna manera proporcionan un predictor definitiva de cristalización propensión. Siembra mucho tiempo se ha pretendido ser un método viable para mejorar el número, el tamaño, y la calidad de los cristales existentes o material cristalino 4-7. Este enfoque se basa en la premisa de que una condición que soporta la nucleación de cristales puede no ser óptima para posterior crecimiento del cristal y viceversa. Al transferir el material nucleado de una condición a otra, se puede tratar de desacoplar efectivamente estos procesos, dando así acceso a nuevos, el espacio de cristalización todavía inexploradas,y como resultado el aumento de la tasa de éxito general de un experimento de cribado. Los métodos establecidos se han documentado para (i) macroseeding, la transferencia de un solo cristal en su totalidad de una condición a otra 8, (ii) siembra consecutivas, la transferencia de material nucleado, generalmente obtenido por la aplicación de presión direccional utilizando, por ejemplo bigote de un gato a la superficie de un cristal existente, seguido de posterior paso de la barba a través de una nueva gota de cristalización 9, y (iii) microsiembra &quot;clásica&quot;, la transferencia de cristal &quot;semillas&quot;, generados por la recolección aplastado cristales (o cristalina materiales), en condiciones similares a las que se produjeron las semillas 10. Cabe destacar que los tres de estos métodos son mucho tiempo y poco escalable, sobre todo en comparación con lo que se puede lograr con modernas robótica cristalización de manejo de líquidos. Estos factores han contribuido, en algún nivel, al menos, a la percepción de que la semillación es un método para ser visitado sólo cuando otros métodos han fallado en dar sus frutos. Microsiembra matriz aleatoria (RMM) es una innovación metodológica reciente que combina los beneficios de microsiembra tradicional con las de detección y escalabilidad 11-13 de alto rendimiento. Este enfoque se basa en la generación de una población de semillas, producido a partir de material cristalino nucleada, que puede estar dividió en alícuotas en / sobre cada sub-well/coverslip dentro de una pantalla estándar de cristalización de 96 condiciones. Este método es aplicable a ambos sentados o colgando experimentos de difusión de vapor de gota, establecidos ya sea a mano o con la robótica de manipulación de líquidos, en formato de 96 pocillos de la bandeja de 24 pocillos o. Rmms se ha demostrado experimentalmente para aumentar significativamente la tasa de éxito de cristalización, y producir cristales de mayor calidad y la cantidad 11, 13, 14 de difracción, y representa una herramienta innovadora en el arsenal de los cristalógrafos &#39;de enfoques en el ONgoing esfuerzo hacia el éxito de la cristalización. Aquí se describe un método general para RMM y proporcionar datos de ejemplo que ilustran la eficacia de esta técnica.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Detección matriz microseed aleatorio (RMM) es una técnica de cristalización de proteínas en el que se añaden cristales de siembra a las pantallas de azar. Al aumentar la probabilidad de que los cristales crezcan en la zona metaestable del diagrama de fases de una proteína, cables adicionales de cristalización se obtienen a menudo, la calidad de los cristales producidos se puede aumentar, y se proporciona una buena cantidad de cristales para la recopilación de datos y de remojo experimentos. Aquí se describe un método general para la RMM que se pueden aplicar a cualquiera que se sienta gota o colgando experimentos de difusión de vapor de gota, establecidos ya sea a mano o con la robótica de manipulación de líquidos, en formato de 24 pocillos de la bandeja de 96 pocillos o.

(A) Ejemplo de un experimento Rmms Para demostrar la eficacia del cribado Rmms aplicamos este método para la cristalización de huevo de gallina lisozima (HEWL) y el hígado de bovino catalasa (BLC). Tanto estas enzimas son eminentemente cristalizable y están estructuralmente objetivos 15, 16 bien caracterizados. Como tal ambos proporcionan excelentes sujetos de prueba con los que ilustrar la mayor tasa de éxito cristalización alcanzable con RMM. Experimentos de cristalización s...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Aquí se describe un método general para la detección de la matriz microseed al azar. Esta técnica se muestra para aumentar de manera significativa la tasa de éxito de la proteína experimentos de cribado de cristalización, reducir la necesidad de optimización, y proporcionar un suministro fiable de cristales para la recopilación de datos y experimentos ligando-spa.

La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K vistas.  University of Bristol.  Aquí se describe un método general para la detección de la matriz microseed al azar. Esta técnica se muestra para aumentar de manera significativa la tasa de éxito de la proteína experimentos de cribado de cristalización, reducir la necesidad de optimización, y proporcionar un suministro fiable de cristales para la recopilación de datos y experimentos ligando-spa. 

Video: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Investigación

Biología

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

Preparación de la proteína de recombinación Mgm101 por Estrategia de etiquetas MBP basado

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...