Los autores desean agradecer a Nicole Hasenkampf y Amanda Tardo para soporte técnico. También queremos agradecer a los Dres. Linden Hu y Adriana Marques por recomendación del dispositivo de contención LeFlap, y el Dr. Lise Gern para obtener instrucciones sobre el método de alimentación capilar. Este trabajo fue apoyado por el NIH / CNRR Beca 8 P20 GM103458-09 (MEE) y por el Centro Nacional para Recursos de Investigación y la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación (ORIP) de los Institutos Nacionales de Salud a través de P51OD011104/P51RR000164 subvención.

Un esquema experimental de la inoculación de la garrapata y la alimentación de los animales para la investigación La enfermedad de Lyme se representa en la figura 1. 1. Inocular ninfas Ixodes garrapatas con B. burgdorferi Uso Capilar-La alimentación por sonda Al realizar manipulaciones con las garrapatas, se usan batas blancas con mangas elásticas, guantes y gorras bouffant desechables. <ol><li> Nuestra técnica es una versión modificada de la reportada por Broadwater et al. 49. Preparar tubos capilares calentando y tirando pipetas Pasteur para romper la delgadez con un extractor pipeta. Con unas pinzas de disección y alcance, romper los consejos para el diámetro óptimo (aproximadamente 0,2 mm). Un tubo estandarizado para el tamaño mouthpart garrapata se utiliza como guía de tallas. Un protector de la cara debe ser usado en la preparación de las pipetas. </li><li> Crecer B. burgdorferi a entre 2-8 x 10 7 / ml (fase semilogarítmica) en BSK-H medio (Sigma) CONconteniendo 6% de suero de conejo. </li><li> Utilice las garrapatas ninfa que se han almacenado a 23 ° C durante 4-6 semanas después de la muda de las larvas. Marque, a un pequeño de 60 x 15 mm placa de Petri con cinta de doble cara en la superficie inferior externa del plato. Coloque el lado ventral garrapatas hacia arriba. </li><li> Sumerja la punta del tubo capilar en el B. tubo de cultivo burgdorferi después de la mezcla. Coloque el tubo capilar sobre el hipostoma de las partes de la boca garrapata con un microscopio de disección. Utilice la arcilla de moldeo para fijar el tubo en su lugar, como se muestra en la Figura 2A. </li><li> Coloque las placas de Petri con las garrapatas Colocada en el interior de una gran bañera de plástico transparente para un mayor nivel de contención. Se añaden las toallas de papel húmedas para proporcionar la humedad. Coloque las garrapatas en un incubador térmica 37 ° C durante 30 h min-2 hasta la defecación es aparente. Esto indica que los medios de comunicación que contienen espiroquetas ha pasado a través de la garrapata. </li><li> Descanse las garrapatas durante 2-4 semanas a 23 ° C para permitir la adaptación al medio de garrapatas antes de alimentarellos en animales. </li></ol> 2. La infección de ratones con B. burgdorferi por Tick <ol><li> Diluir ketamina Stock 1:10 en agua estéril. Se anestesia cada ratón con 100 mg / kg de ketamina por inyección intraperitoneal con una jeringa de tuberculina </li><li> Una vez que el ratón está totalmente anestesiado, afeitarse el ratón de los oídos a la media de la espalda utilizando una multa (Remington suave y sedoso) condensador de ajuste eléctrico. </li><li> En una cacerola blanca con ningún otro objeto cercano, transfiera las garrapatas ninfa (aquel puerto B. burgdorferi) por un pincel humedecido a la zona sin pelo del ratón. Alternativamente, las garrapatas no infectadas se pueden colocar en los ratones para xenodiagnóstico de ratones con infección sospechoso. El uso de una superficie limpia y blanco para la colocación de garrapata ayuda a asegurar que las garrapatas no unidas se verán fácilmente. </li><li> Coloque el ratón en jaulas especializada (Allentown introducción en jaula, Allentown, PA). La introducción en jaula consiste en una parrilla de acero inoxidable elevado desde el fondo de la jaula. Tél cima de la jaula fue modificada por nuestro propio taller de máquinas para elevar el soporte para botellas de agua suficiente como para permitir el libre movimiento del ratón debajo. La bandeja está llena de alrededor de ½ pulgada de agua para atrapar cualquier garrapata que se caen de los ratones (Figura 3A). Para minimizar el riesgo de hipotermia, almohadillas de calor reutilizables, cocinados en el microondas antes de su uso, se colocan debajo de las jaulas hasta que los ratones despiertan completamente de la anestesia. Los animales son a menudo atáxica mientras se recupera de la anestesia y rozar la alimentación y bandejas de agua, por lo que estos deben ser removidos. El nivel del agua es lo suficientemente baja para evitar las extremidades de los ratones de la sumersión. </li><li> Coloque la jaula dentro de una bandeja que se ha alineado con la trampa de Maraña pasta (Contech, Victoria, BC, Canadá) y cinta adhesiva para asegurar el atrapamiento de los artrópodos. Los ratones se enjaularon individualmente y se observaron continuamente durante el período de la anestesia. </li><li> Dentro de 2 horas, cuando los ratones son completamente despierto de la anestesia, la bandeja de la comida y la botella de agua son reemplazados a la jaula. Después de 24 horas, se sustituye el enriquecimiento de la vivienda que consta de una cabaña de plástico y Nylabone. </li><li> Después de 3, 4 y 5 días, verifique el ratón, la jaula y el agua jaula por garrapatas alimentadas. El agua jaula se tamiza a través de un recipiente de metal blanco (es decir, &quot;el lavado de oro&quot;). Enjuague alimentado las garrapatas en agua limpia y almacena en frascos de plástico (Figura 3B). En los días 3 y 4, reemplazar el agua en la jaula con agua limpia. El día 5, comprobar no sólo la jaula, pero el ratón a fondo en busca de garrapatas. Por lo general, a estas alturas todas las garrapatas han alimentado y los ratones pueden ser vuelto a introducir en la jaula regular. </li><li> Coloque todos los residuos de las jaulas de ratones, incluyendo líquidos, en cajas de seguridad para el autoclave y la eliminación. Mantenga un registro del número de garrapatas colocados en los ratones y los recuperados en todo momento. </li></ol> 3. La alimentación de las garrapatas en primates no humanos para la infección por B. burgdorferi o xenodiagnóstico <ol><li> Prepare el dispositivo de contención de garrapata: Cortar un círculo de diámetro 1 ¾ de pulgada de la pulgada x 33 pulgadas LeFlap (colgajo), utilizando un bisturí limpio y la guía de medición. Utilice la corte como una plantilla para cortar círculos del mismo tamaño en la espuma Biatane y Duoderm. La espuma se usa para elevar solapa sobre la superficie de la piel y evitar la posible aplastamiento de garrapata. El Duoderm añade otra capa de amortiguación y se superpone a los bordes del dispositivo de contención para mayor seguridad de escapar de la garrapata. Un diagrama del dispositivo de contención se representa en la Figura 4. </li><li> El personal veterinario anestesiar al animal con 5-8 mg / kg de Telazol por inyección intramuscular. </li><li> Clip el pelo del animal usando condensador de ajuste eléctrico (Oster) equipado con el tamaño de 40 cuchillas. Todas las áreas que serán cubiertas por la chaqueta se recortan: espalda, frente, brazos. El uso de la crema de afeitar y maquinillas de afeitar desechables de doble cuchilla, afeitado de cerca un área de aproximadamente 25 cm x 20 cm vertical, horizontal. Limpie con toallas de papel húmedas y secar con calor bajo para secar la piel. </li><li> Coloque la tapa en tél de animales dorso, justo debajo de la escápula, a cada lado de la columna vertebral. Use un marcador para trazar el círculo en ese lugar. Prepare el área de la piel alrededor del círculo frotándola con SkinPrep. Esto elimina el aceite en la piel que podrían afectar a la adhesión de los dispositivos de pegamento y contención. Dejando alrededor de una circunferencia de 1 cm de espacio alrededor del círculo, aplicar una capa de pegamento de la piel (SkinBond) con un ancho de ~ 4 cm. </li><li> Retire el adhesivo de la espuma Biatane y colocar sobre la piel en el lugar apropiado. Los animales son nuevamente anestesiados por el personal veterinario con 5 mg / kg Telazol. Selle los bordes con pegamento de la piel y la cinta Hypafix. Retire el adhesivo de la solapa y colocar en la parte superior de la Biatane. Coloque cinta Hypafix alrededor de los bordes de la LeFlap, a continuación, con cinta adhesiva la solapa de malla de la solapa y colocar la chaqueta en el animal. Pasta de cinta y Trampa Maraña se aplica al suelo en un perímetro que rodea a la introducción en jaulas de primates no humanos para mayor seguridad. </li><li> Para minimizar los efectos de chemicals utilizados en Step 3,4 sobre la alimentación de garrapatas, las garrapatas se añaden 24 horas después de que el dispositivo de contención está en su lugar. En este punto, la seguridad del dispositivo también es inspeccionado y reforzado si es necesario. Por lo general, se añaden 20 ninfas sin alimentar (muda 4-8 semanas post-larval) a la piel en el dispositivo utilizando un pincel. </li><li> Retire el adhesivo de la malla de la tapa y el sello en su lugar. Por último, retire el respaldo Duoderm para exponer el adhesivo y colocar en la parte superior del dispositivo de contención. Añadir un trozo de cinta Hypafix a través del círculo de malla abierta, y vuelva a colocar la cubierta. El dispositivo de contención completado se muestra en la Figura 5A. </li><li> Después de 5 días, anestesiar a los animales como anteriormente y se eliminan las chaquetas. Retire la cinta primero para inspeccionar marcar la alimentación a través de la malla (Figura 5B). Retire con cuidado el Duoderm lejos de la solapa. </li><li> Tire hacia atrás de la porción de malla en los bordes para facilitar el acceso a las garrapatas. Garrapatas de la Fed se encuentran con frecuencia cerca o debajo deel círculo de espuma (Figura 5 C) y se retiran y se colocan en agua limpia con un pincel. Retire el dispositivo una vez que se recogen todas las garrapatas alimentadas visibles (Figura 5D). </li></ol> Nota: A menudo, el dispositivo de contención simplemente se puede despegar de la piel. Si la adherencia es fuerte y potencialmente podría dañar la piel, Unisolve disolvente se aplica a la zona para la eliminación suave. La piel se limpia con isopropanol y garrapatas se almacenan a 23 ° C. Si se utiliza para la infección, las garrapatas pueden ser aplastados para confirmar el número que contenía B. burgdorferi. Si se utiliza para el xenodiagnóstico, las garrapatas se mantienen durante 1-3 semanas antes del análisis del contenido del intestino medio.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Con el fin de obtener las garrapatas que puerto B. burgdorferi para estudios posteriores, las garrapatas pueden ser: (1) que se nutre de los ratones infectados en la etapa larval, (2) sumergido en B. culturas burgdorferi, ya sea en la etapa de larva o ninfa; 48 (3) microinyectaron con B. burgdorferi 47; o (4) alimentado-tubo capilar B. burgdorferi 49. Aunque cada uno de estos métodos tiene su propósito, para asegurar que una gran porción de...

En 2011, la enfermedad de Lyme es la sexta enfermedad de declaración obligatoria a nivel nacional más común en América del Norte ( <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi es un microbio versátil, tanto genética y antigénicamente (revisado en 1). Su constitución genética incluye un grande (&gt; 900 kB) cromosoma y hasta 21 plásmidos (12 lineales, circulares 9), con un contenido variable plásmido entre los aislados. Hay mucho que aprender acerca de esta espiroqueta, ya que más del 90% de los marcos de lectura abierta de plásmidos no están relacionados con ninguna de las secuencias bacterianas conocidas 2,3. B. burgdorferi presenta una amplia variedad de antígenos como posibles objetivos de la inmunidad del huésped. Sin embargo, una infección no tratada a menudo persiste. La interacción de las espiroquetas con el medio de la garrapata y el medio ambiente hospedador vertebrado exige una adaptación de B. burgdorferi en todo el proceso de infección. Codificada-plásmido Varioslos genes son conocidos por ser expresadas diferencialmente en respuesta a cambios en la temperatura, el pH, la densidad celular e incluso etapa del ciclo de vida de garrapata 4-8. El estudio de B. adaptación burgdorferi lo largo de su ciclo de enzoótica, y las respuestas del huésped después de la infección por la ruta natural se basa en la capacidad de alimentar las garrapatas en modelos animales apropiados. Este tipo de estudios se reunieron con los retos técnicos de la generación de garrapatas que albergan B. burgdorferi, y garantizar el transporte y / o alimentación eficiente de garrapatas en el modelo de acogida. Además, la contención y la recuperación de las garrapatas infectadas es esencial. Entre los modelos utilizados son ratones y primates no humanos, cada uno de los cuales sirve como una herramienta valiosa en la investigación de la enfermedad de Lyme. Al igual que con el ratón de patas blancas, que es un huésped reservorio natural para B. burgdorferi, el ratón de laboratorio es un anfitrión muy susceptibles que apoya la infección persistente por parte B. burgdorferi 9. FolLowing infección de ratones susceptibles de enfermedades, como la cepa C3H, las espiroquetas difunden a varios tejidos, incluyendo la piel, la vejiga, los músculos, las articulaciones y el corazón. Las respuestas inflamatorias a la infección conducen al corazón enfermo y el tejido articular. Mientras que las espiroquetas persisten en este host y siguen siendo infecciosas, lesiones inflamatorias pueden llegar a ser intermitente, no muy diferente del proceso en los seres humanos. Así pues, el modelo de ratón ha proporcionado mucha información sobre B. la patología inducida por burgdorferi, incluyendo la artritis y la carditis y respuestas inmunes del huésped 10-12. Desde la perspectiva del patógeno, ciertos genes expresados ​​diferencialmente durante la infección de mamíferos se han caracterizado, como tener algún necesario para la transmisión a partir del vector garrapata 13-21. Aunque varias especies de animales se han utilizado para estudiar la enfermedad de Lyme 22, macacos rhesus imitan más de cerca el carácter multi-órgano de la enfermedad humana 23. A diferencia de otrosmodelos animales, la amplitud de manifestaciones de la enfermedad tales como eritema migratorio, la carditis, la artritis, la neuropatía y de los sistemas nerviosos periférico y central se observaron en macacos. En ratones, el huésped reservorio de B. burgdorferi, la enfermedad varía según la cepa de ratón y los 24 años, mientras que las manifestaciones tempranas y tardías diseminada son infrecuentes 9. Además, otros roedores, lagomorfos, y caninos todos fallan en exhibir enfermedad neurológica de B. burgdorferi infección 25. Es importante destacar que los macacos muestran signos característicos de las tres fases de la borreliosis de Lyme, a saber,,-diseminada temprana temprana localizada, y la enfermedad de Lyme en etapa tardía 26-28. Eritema migrans (EM) se cree que ocurre en el 70-80% de los casos en humanos 29, y también se observaron en macacos rhesus 28,30. Después de la infección, las espiroquetas difunden desde el sitio de la inoculación a múltiples órganos. ADN espiroquetas se ha detectado en MU esqueléticoscles, corazón, la vejiga, los nervios periféricos y del plexo, así como en el sistema nervioso central (cerebro, tronco cerebral y cerebelo, médula espinal, y duramadre) 31. Marque alimentándose de ratones ha sido utilizada por nosotros y otros equipos de investigación para la propagación de las colonias de garrapatas, en competencia como reservorio estudia 32-36 y en los estudios de B. burgdorferi patogenia 37-40. Esta técnica también se ha utilizado para xenodiagnóstico y pruebas de eficacia de la vacuna en ratones 41-44. Hemos alimentado Ixodes garrapatas en primates no humanos para el desarrollo del modelo 28, un estudio de la eficacia de la vacuna de 45 años, y para el xenodiagnóstico en la evaluación de la persistencia del tratamiento post-antibiótico 46. Las garrapatas que puerto B. burgdorferi se puede mantener en un ciclo enzoótico naturales por la alimentación de las larvas en los ratones infectados y el uso de las ninfas de los estudios, como las espiroquetas se transmiten a través de las etapas de la vida. En este informe, Instruimos sobre cómo generar garrapatas infectadas con el tipo salvaje o mutante B. burgdorferi, con alimentación por tubo capilar. Esto también se puede lograr mediante microinyección 47 y por inmersión 48. El propósito de la introducción artificial de B. burgdorferi en las garrapatas pueden ser para estudiar cepas mutantes cuya transmisibilidad es desconocido, para generar un grupo de garrapatas con una alta tasa de infección, y para reducir el potencial de error mediante el mantenimiento de una colonia garrapata limpio y de lo contrario no infectada. Además, demostramos marcar la alimentación en ratones y primates no humanos, así como para asegurar la contención y recuperación de las garrapatas repletas. El uso de marcar la alimentación es esencial para futuros estudios de la respuesta inmune a B. burgdorferi infección, el potencial de eficacia de la vacuna de Lyme y xenodiagnóstico para la detección de infecciones ocultas.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

La transmisión del agente etiológico de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi, se produce por la unión y la alimentación de la sangre de la especie Ixodes garrapatas en huéspedes mamíferos. En la naturaleza, este patógeno bacteriano zoonótico puede utilizar una variedad de reservorios, pero el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) es el principal reservorio de larvas de garrapatas y de ninfas en América del Norte. Los seres humanos son huéspedes accidentales más frecuentemente infectados con B. burgdorferi por la picadura de garrapatas en la etapa de ninfa. B. burgdorferi se adapta a sus anfitriones durante todo el ciclo enzoótica, por lo que la capacidad de explorar las funciones de estas espiroquetas y sus efectos en huéspedes mamíferos requiere el uso de la alimentación de la garrapata. Además, la técnica de xenodiagnóstico (utilizando el vector natural para la detección y la recuperación de un agente infeccioso) ha sido útil en los estudios de la infección críptica. Con el fin de obtener de ninfa garrapatas que puerto B. burgdorferi,garrapatas se alimentan espiroquetas vivas en la cultura a través de tubos capilares. Dos modelos animales, ratones y primates no humanos, son los más utilizados para los estudios de la enfermedad de Lyme que involucran la alimentación de la garrapata. Demostramos los métodos por los cuales estas garrapatas pueden ser alimentados en, y se recuperaron de los animales, ya sea para una infección o xenodiagnóstico.

Tras la finalización de la alimentación capilar, las garrapatas son típicamente descansaban a 23 ° C durante 2-3 semanas antes de que se alimentan de animales para la transmisión. El uso de la técnica de alimentación capilar, se ha encontrado que más del 90% de la Fed garrapatas puerto B. burgdorferi. El porcentaje de las garrapatas positivas se determina mediante lavado garrapatas en peróxido y etanol, y luego aplastarlas en PBS estéril con una mano de mortero en forma de tubo de microcentrífuga. Lo...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K vistas.  Tulane University Health Sciences Center.  La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí. 

Video: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

La interferencia de ARN en las garrapatas

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Investigación

Inmunología e Infección

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La saliva, la glándula salival, y la Colección hemolinfa de las garrapatas Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Los protocolos para la investigación de la distribución original de los tejidos, modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de un anfitrión Densovirus en el gusano de la cápsula del algodón

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Ensayo estándar de alimentación por membrana para la detección de la infección por Plasmodium falciparum en mosquitos vectores Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...