Os autores gostariam de agradecer a Nicole Hasenkampf e Amanda Tardo para suporte técnico. Agradecemos também drs. Linden Hu e Adriana Marques por recomendação do dispositivo de contenção LeFlap e Dr. Lise Gern para obter instruções sobre o método de alimentação capilar. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NCRR Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) e pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Escritório de Pesquisa Programas de Infra-estrutura (OriP) dos Institutos Nacionais de Saúde, através de concessão P51OD011104/P51RR000164.

Um esboço experimental de inoculação carrapato e alimentação aos animais para a pesquisa da doença de Lyme é mostrada na Figura 1. 1. Inoculando ninfas Ixodes Carrapatos com B. burgdorferi Usando Tubo Capilar-feeding Ao realizar manipulações com carrapatos, jaleco branco com mangas elásticas, luvas e bonés bouffant descartáveis ​​são usados. <ol><li> A nossa técnica é uma versão modificada do que relatado por Broadwater et al. 49. Prepare tubos capilares através do aquecimento e puxando pipetas Pasteur de quebrar magreza usando um extrator pipeta. Utilizando uma pinça e dissecando escopo, quebrar as dicas para o diâmetro ideal (cerca de 0,2 mm). Um tubo normalizado para o tamanho carrapato mouthpart é utilizado como um guia de dimensionamento. A viseira deve ser usado na preparação das pipetas. </li><li> Crescer B. burgdorferi para entre 2-8 x 10 7 / ml (fase mid-log) em meio BSK-H (Sigma) conFORMAÇÃO 6% de soro de coelho. </li><li> Use carrapatos ninfa que foram armazenados a 23 ° C durante 4-6 semanas de muda pós-larval. Local carrapatos para um pequeno 60 x 15 mm placa de Petri com fita dupla-face na superfície inferior externa do prato. Coloque o ticks do lado ventral para cima. </li><li> Mergulhe a ponta do tubo capilar para a B. tubo de cultura burgdorferi após a mistura. Coloque o tubo capilar sobre o hypostome das partes da boca carrapato usando um escopo de dissecação. Use argila moldagem para fixar o tubo no lugar, como mostrado na Figura 2A. </li><li> Coloque as placas de Petri com carrapatos afixadas no interior uma grande banheira de plástico transparente para um nível adicional de contenção. Toalhas de papel molhadas são adicionados para fornecer umidade. Coloque as carraças em um incubador térmico de 37 ° C durante 30 min-2 h, até a defecação é aparente. Isso indica que a mídia que contém espiroquetas passou pelo carrapato. </li><li> Descanse os carrapatos para 2-4 semanas a 23 ° C para permitir a adaptação ao ambiente carrapato antes da alimentaçãolos em animais. </li></ol> 2. Infectar ratos com B. burgdorferi por Tick <ol><li> Diluir estoque cetamina 1:10 em água estéril. Anestesiar cada rato com 100 mg / kg de cetamina por via intraperitoneal com uma seringa de tuberculina </li><li> Uma vez que o mouse é totalmente anestesiado, raspar o rato das orelhas para o meio de volta usando uma multa (Remington suavizar e sedoso) aparador elétrico. </li><li> Em uma panela branco com nenhum outro objeto próximo, transferir os carrapatos de ninfa (que porto B. burgdorferi) por um pincel umedecido para a área calva do mouse. Alternativamente, carraças infectadas pode ser colocado em ratinhos para xenodiagnóstico de ratinhos com infecção suspeito. A utilização de uma superfície limpa e branca para a colocação carrapato ajuda a assegurar que qualquer carrapatos acopladas será prontamente visto. </li><li> Posicione o mouse em encarceramento especializado (Allentown Jaula, Allentown, PA). O encarceramento é constituído por uma grelha de aço inoxidável de elevada desde o fundo da gaiola. Tele topo de gaiola foi modificado pela nossa in-house oficina mecânica para elevar o suporte da garrafa de água o suficiente para permitir a livre circulação do mouse por baixo. O pan é preenchido com cerca de ½ polegada de água para prender qualquer carrapatos que caem camundongos (Figura 3A). Para minimizar o risco de hipotermia, almofadas de aquecimento reutilizáveis, microondas antes do uso, são colocados debaixo das gaiolas até ratos acordar completamente da anestesia. Os animais são muitas vezes ataxic como eles se recuperar da anestesia e esfregar contra alimentos e bandejas de água, pelo que estes devem ser removidos. O nível da água está baixo o suficiente para impedir que os membros de ratos de submersão. </li><li> Coloque a gaiola dentro de uma bandeja que foi forrado com emaranhado armadilha colar (Contech, Victoria, BC, Canadá) e fita adesiva para garantir o aprisionamento de artrópodes. Os ratos são enjaulados individualmente e observados continuamente durante o período da anestesia. </li><li> Dentro de 2 horas, quando os ratos são completamente acordado da anestesia, a bandeja de comida e garrafa de água são substituídos para a jaula. Após 24 horas, o enriquecimento habitacional composto por uma cabana de plástico e Nylabone é substituído. </li><li> Depois de 3, 4 e 5 dias, verifique o rato, gaiola e água gaiola para carrapatos alimentados. A água gaiola é peneirado através de uma panela de metal branco (ou seja, &quot;a extração de ouro&quot;). Enxágüe alimentados carrapatos em água limpa e armazenar em frascos de plástico (Figura 3B). Nos dias 3 e 4, substituir a água na gaiola com água limpa. No dia 5, verificar não só a gaiola, mas o mouse completamente para carrapatos. Normalmente, neste ponto todos os carrapatos foram alimentados e os ratinhos podem ser devolvidos ao encarceramento regular. </li><li> Coloque todos os resíduos das gaiolas do rato, incluindo líquidos, em recipientes de Biohazard por autoclavagem e disposição. Manter um registo do número de carraças e colocadas em ratinhos aqueles recuperados em todos os momentos. </li></ol> 3. Alimentando Carrapatos em Primatas não humanos para infecção por B. burgdorferi ou xenodiagnóstico <ol><li> Prepare o dispositivo de contenção carrapato: Corte um círculo de diâmetro de 1 ¾ polegadas no 3 polegadas x3 polegadas LeFlap (aba) utilizando um bisturi limpa e o guia de medição. Use o recorte como um modelo para cortar círculos de tamanho idêntico na espuma Biatane e Duoderm. A espuma é utilizado para elevar a aba sobre a superfície da pele e prevenir a possível esmagamento do carrapato. O Duoderm adiciona outra camada de amortecimento e cobre as bordas do dispositivo de contenção para aumentar a segurança da carraça fuga. Um diagrama do dispositivo de contenção está representado na Figura 4. </li><li> Pessoal veterinário vai anestesiar o animal com 5-8 mg / kg Telazol por injecção intramuscular. </li><li> Corte o pêlo do animal com aparador elétrico (Oster), equipado com tamanho de 40 lâminas. Todas as áreas que serão cobertas pelo paletó são cortados: costas, frente, braços. Usando o creme de barbear e lâminas de barbear descartáveis ​​de dupla lâmina, fazer a barba de perto uma área de aproximadamente 25 centímetros verticais x 20 cm horizontal. Limpe com papel toalha úmido e seque com fogo baixo para secar a pele. </li><li> Coloque a aba na tele animais do dorso, logo abaixo da escápula, em ambos os lados da coluna vertebral. Use um marcador para traçar o círculo em que local. Prepare a área da pele ao redor do círculo, limpando-a com SkinPrep. Isso remove óleo em pele que podem afetar a adesão de dispositivos de cola e de contenção. Deixando sobre uma circunferência de 1 cm de espaço ao redor do círculo, aplique uma camada de cola de pele (SkinBond) com uma largura de a 4 cm. </li><li> Retire o adesivo da espuma Biatane e apor na pele no local apropriado. Os animais são novamente anestesiados pela equipe veterinária com 5 mg / kg Telazol. Selar as bordas com cola a pele e fita Hypafix. Retire o adesivo da tampa e fixe no topo da Biatane. Colocar fita Hypafix em torno das bordas do LeFlap, em seguida, para baixo a aba de fita de malha de a aba e colocar o revestimento sobre o animal. Tape e emaranhado Armadilha pasta é aplicada para o chão em um perímetro em torno do encarceramento primata não-humano para maior segurança. </li><li> Para minimizar os efeitos da chemicalals utilizados no Passo 3.4 sobre alimentação carrapato, os carrapatos são adicionados 24 horas após o dispositivo de contenção está no lugar. Neste ponto, a segurança do dispositivo é também inspeccionados e reforçado, se necessário. Tipicamente, 20 ninfas não alimentadas (molt 4-8 semanas pós-larvar) são adicionados para a pele dentro do dispositivo utilizando um pincel. </li><li> Retire o adesivo da malha do retalho e selá-lo no lugar. Por último, remover o suporte Duoderm para expor adesivo, e colocar na parte superior do dispositivo de contenção. Adicionar um pedaço de fita Hypafix através do círculo de malha aberta, e substitua o casaco. O dispositivo de contenção completo é mostrado na Figura 5A. </li><li> Após 5 dias, anestesiar os animais como descrito acima e os revestimentos são retirados. Retire a fita primeiro a inspecionar alimentação carrapato através da malha (Figura 5B). Retire cuidadosamente o Duoderm longe da aba. </li><li> Puxe a parte de malha nas bordas para fornecer acesso aos carrapatos. Carrapatos Fed são frequentemente encontrados perto ou sobo circulo de espuma (Figura 5C) e são removidos e colocados em água limpa com um pincel. Remova o dispositivo de uma vez todos os carrapatos alimentados visíveis são coletados (Figura 5D). </li></ol> Nota: Muitas vezes, o dispositivo de contenção pode simplesmente ser retirado da pele. Se a aderência for forte e pode causar danos à pele, o solvente Unisolve é aplicado à superfície para remoção suave. A pele é limpa com isopropanol e carrapatos são armazenadas a 23 ° C. Se usado para a infecção, os carrapatos podem ser esmagadas para confirmar o número que continha B. burgdorferi. Se for usado para xenodiagnóstico, os carrapatos são mantidos por 1-3 semanas antes da análise do conteúdo do intestino médio.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A fim de obter as carraças que porto B. burgdorferi para estudos a jusante, os carrapatos podem ser: (1) alimentados em camundongos infectados na fase de larva, (2) imersa em B. culturas burgdorferi, quer no estágio larval ou ninfal 48; (3) microinjeção com B. burgdorferi 47, ou (4) do tubo capilar alimentados B. burgdorferi 49. Enquanto cada um destes métodos tem a sua finalidade, para garantir que uma grande parte dos carrapatos a ser u...

Em 2011, a doença de Lyme foi a doença mais comum Nacionalmente Notificável 6 na América do Norte ( <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi é um micróbio versátil, tanto geneticamente e antigenicamente (revisto em 1). Sua constituição genética inclui um grande (&gt; 900 kB) cromossomo e até 21 plasmídeos (12 lineares, 9 circulares), com conteúdo plasmídeo variando entre os isolados. Muito está a ser aprendido sobre este espiroquetas, como mais de 90% dos plasmídeos de leitura aberta quadros são alheios a quaisquer conhecidas seqüências bacterianas 2,3. B. burgdorferi apresenta uma grande variedade de antigénios, como alvos potenciais de imunidade do hospedeiro. No entanto, a infecção não tratada muitas vezes persistir. A interação de espiroquetas com o meio ambiente e carrapato hospedeiro vertebrado exige uma adaptação por B. burgdorferi em todo o processo de infecção. Vários plasmídeo codificadogenes são conhecidos por serem expressos diferencialmente em resposta a mudanças de temperatura, pH, densidade celular e mesmo estágio do ciclo de vida do carrapato 4-8. O estudo da B. burgdorferi adaptação durante todo o seu ciclo de enzoótica, e as respostas do hospedeiro após a infecção por via natural, baseia-se na capacidade de alimentar carrapatos em modelos animais apropriados. Tais estudos estão satisfeitos com os desafios técnicos de geração de carrapatos que abrigam B. burgdorferi, e garantir a transmissão eficiente e / ou alimentação de carrapatos no host modelo. Além disso, a retenção e a recuperação de carraças infectadas é essencial. Entre os modelos utilizados são ratos e primatas não-humanos, cada um dos quais serve como uma ferramenta valiosa para a pesquisa da doença de Lyme. Tal como acontece com o rato branco de pés, o que é um hospedeiro natural para B. burgdorferi, o rato de laboratório é uma série altamente suscetíveis que suporta a infecção persistente por B. burgdorferi 9. Folguinte a infecção de ratinhos susceptíveis a doenças, tais como a estirpe C3H, os espiroquetas difundir para vários tecidos, incluindo a pele, bexiga, músculos, articulações e coração. As respostas inflamatórias à infecção levar a coração doente e articulações. Enquanto as espiroquetas persistir nesse hospedeiro e permanecem infecciosos, lesões inflamatórias, pode tornar-se intermitente, ao contrário do processo em seres humanos. O modelo do rato tem, assim, fornecido muita informação sobre B. patologia induzida por burgdorferi, incluindo artrite e cardite e resposta imune do hospedeiro 10-12. Do ponto de vista do agente patogénico, certos genes diferencialmente expressos durante a infecção de mamíferos têm sido caracterizados, como ter algum necessário para a transmissão a partir do vector carrapato 13-21. Apesar de várias espécies animais têm sido utilizados para estudar a doença de Lyme 22 macacos rhesus imitar mais de perto o caráter multi-órgão da doença humana 23. Ao contrário de outrosmodelos animais, a amplitude das manifestações de doença, tais como eritema migrans, cardite, artrite e neuropatias dos sistemas nervosos periférico e central, observada em macacos. Em camundongos, o anfitrião reservatório para B. burgdorferi, a doença varia de acordo com a tensão do mouse e 24 anos, enquanto que as manifestações precoces e tardias-divulgados são incomuns 9. Além disso, outros roedores, lagomorfos, e caninos tudo não exibem doença neurológica de B. infecção burgdorferi 25. É importante ressaltar que os macacos apresentam sinais que são característicos de todas as três fases da borreliose de Lyme, ou seja, no início localizada, early-divulgada, e fase final de doença de Lyme 26-28. Eritema migrans (EM), pensa-se que ocorre em 70-80% dos casos humanos 29, e é também observada em macacos rhesus 28,30. Após a infecção, as espiroquetas difundir a partir do local de inoculação de vários órgãos. ADN Espiroquetal foi detectada em mu esqueléticoscles, coração, bexiga, sistema nervoso periférico e do plexo, bem como no sistema nervoso central (cérebro, tronco cerebral e cerebelo, espinal medula, e dura-máter) 31. Assinale alimentando-se de ratos tem sido utilizada por nós e por outros grupos de pesquisa para a propagação de colônias de carrapatos, em competência reservatório estuda 32-36 e em estudos de B. burgdorferi patogênese 37-40. Esta técnica também foi usada para xenodiagnóstico e testes de eficácia da vacina em ratinhos 41-44. Temos alimentado Ixodes carrapatos em primatas não-humanos para o desenvolvimento de modelo de 28 anos, um estudo sobre a eficácia da vacina de 45 anos, e por xenodiagnóstico na avaliação da persistência do tratamento pós-antibiótico 46. Carrapatos que porto B. burgdorferi podem ser mantidos em um ciclo natural, por enzoótica alimentando larvas em ratinhos infectados e usando as ninfas de estudos, como as espiroquetas são transmitidos através das etapas da vida. Neste relatório, Instruímos sobre como gerar os carrapatos infectados com o tipo selvagem ou mutante B. burgdorferi, usando capilar tubo de alimentação. Isto também pode ser realizada por micro-injecção 47 e por imersão 48. A finalidade da introdução artificial de B. burgdorferi em carraças podem ser estudar estirpes mutantes cuja transmissibilidade é desconhecido, para gerar um grupo de carraças com uma alta taxa de infecção, e para reduzir a possibilidade de erros através da manutenção de uma colónia carrapato limpo e de outra forma não infectado. Além disso, demonstramos alimentação carrapato em ratos e primatas não-humanos, de modo a assegurar a contenção e recuperação de carrapatos repletos. O uso de alimentação carrapato é essencial para futuros estudos de respostas imunes a B. infecção burgdorferi, o potencial de eficácia da vacina Lyme, e xenodiagnóstico para detecção de infecções ocultas.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

A transmissão do agente etiológico da doença de Lyme, Borrelia burgdorferi, ocorre pelo apego e alimentarem de sangue de espécies Ixodes carrapatos em hospedeiros mamíferos. Na natureza, este patógeno bacteriano zoonótica pode usar uma variedade de hospedeiros, mas o rato branco de pés (Peromyscus leucopus) é o reservatório primário para carrapatos larva e ninfa na América do Norte. Os seres humanos são hospedeiros acidentais mais frequentemente infectados com B. burgdorferi pela picada de carrapatos na fase de ninfa. B. burgdorferi se adapta a seus hospedeiros ao longo do ciclo enzoótica, portanto a capacidade de explorar as funções destes espiroquetas e seus efeitos em hospedeiros mamíferos requer o uso de alimentação do carrapato. Além disso, a técnica de xenodiagnóstico (utilizando o vector natural para a detecção e a recuperação de um agente infeccioso) tem sido útil em estudos de infecção críptica. Para a obtenção de ninfas carrapatos que porto B. burgdorferi,carrapatos são alimentados espiroquetas vivas em cultura por meio de tubos capilares. Dois modelos animais, ratos e primatas não-humanos, são mais comumente usados ​​para estudos de doença de Lyme que envolvem a alimentação do carrapato. Demonstramos os métodos pelos quais esses carrapatos podem ser alimentados em cima, e recuperados a partir de animais para ou infecção ou xenodiagnóstico.

Após a conclusão da alimentação capilar, as carraças são normalmente repousou a 23 ° C durante 2-3 semanas, antes de serem alimentados com animais para a transmissão. Usando a técnica capilar-alimentação, descobrimos que mais de 90% de que o Fed carrapatos porto B. burgdorferi. A percentagem de carrapatos positivas é determinada por lavagem carrapatos em peróxido e de etanol, em seguida, esmagando-as em PBS estéril com um pilão em forma de tubo de microcentrífuga. O conteúdo do intestino médio...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

feeding-ticks-on-animals-for-transmission-xenodiagnosis-lyme-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K visualizações.  Tulane University Health Sciences Center.  A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita. 

Vídeo: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA de interferência em Carrapatos

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Imunologia e Infecção

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Coleta e processamento de linfonodos de animais de grandes porte para a análise do RNA: preparando-se para estudos de linfonodo Transcriptomic de espécies de animais grandes

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

Transmissão sexual de tripanosomas americanas de machos e fêmeas para companheiros de ingênua

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...