Damos las gracias a Wendy Chao por su apoyo en la revisión crítica. Este trabajo fue apoyado por Bausch &amp; Lomb Vitreoretinal Fellowship (HM), el Instituto Nacional del Ojo subvención EY014104 (JWM), Investigación para Prevención de la Ceguera Fundación (DGV), el Fondo de Investigación del Ojo Lions (DGV), y una generosa donación de la familia Yeatts (JWM y DGV).

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y las directrices y normas establecidas por el Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comité de Cuidado de Animales. 1. Pretratamiento <ol><li> Se anestesia a 8 semanas de edad de ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de 60 mg / kg de ketamina y 6 mg / kg de xilazina. </li><li> Cortar los bigotes. Esto se hace debido a que interfieren con la visualización y la colocación del instrumento. </li><li> Dilata la pupila con un 5% fenilefrina y tropicamida al 0,5%. </li><li> Cortar los cilios. Esto también se hace debido a que interfieren con la visualización y la colocación del instrumento. </li><li> Aplicar anestesia tópica (0,5% de clorhidrato de proparacaína solución oftálmica). </li></ol> 2. Cirugía Bajo el microscopio <ol><li> Ajuste el ratón en una pos lateralition con la nariz hacia el cirujano. Un pellizco del dedo del pie se realiza para confirmar la anestesia quirúrgica y guantes estériles se puso antes de comenzar la cirugía. </li><li> Una incisión en la conjuntiva temporal en el limbo posterior y separar la conjuntiva de la esclerótica. Evitar penetrar en la esclerótica. Después de este paso, tome la conjuntiva en el limbo con una pinza para controlar el ojo. </li><li> Hacer una incisión escleral de auto-sellado utilizando la punta de una aguja de 30 G con el bisel apuntando hacia arriba. Hacer un túnel escleral través de la esclerótica y penetrar en la esclerótica en la coroides (Figura 1). No penetrar la retina. Si la hemorragia coroidea se produce y sale a través de la herida escleral, realizar una astriction con una lanza quirúrgica hasta que el sangrado se detenga. Esta herida escleral será auto-sellado con presión intraocular. </li><li> Pinche la córnea con una aguja de 30 G para reducir la presión intraocular. Utilice la aguja paralela al iris para evitar lesiones en el iris y la lente durante enIntente en la cámara anterior. La presión intraocular se causar la herida a la auto-sellado. </li><li> Inserte una aguja de 33 conectado a una jeringa Hamilton de 10 l en el espacio subretiniano con el bisel apuntando hacia abajo (hacia el interior del ojo), e inyectar hialuronato de sodio 3.5 l suavemente para desprender la retina neurosensorial del EPR subyacente. Evite que penetra en la retina con la aguja de 33 G, porque hialuronato de sodio voy a entrar en el espacio vítreo, pero no el espacio subretiniano si la retina se penetra. También, evitar la inyección rápida porque creará un desgarro oral y hialuronato de sodio se escape en la cámara anterior. </li><li> Deje que el humor acuoso fluya fuera de la punción de la córnea empujando la córnea alrededor de la perforación corneal con fórceps para ajustar la presión intraocular. </li><li> Confirmar la ausencia de fugas de la herida escleral utilizando una lanza quirúrgica. </li><li> Para reducir el riesgo de fugas de hialuronato de sodio, colocar pegamento quirúrgico de cianoacrilato enla herida escleral. </li><li> Vuelva a colocar la conjuntiva a su posición original utilizando pegamento quirúrgico cianoacrilato. Esto reducirá aún más el riesgo de fugas de hialuronato de sodio. </li><li> Compruebe el fondo de ojo mediante una cubierta de vidrio y confirme la creación de un RD ampollar sin hemorragia subretiniana. </li></ol> 3. Después del tratamiento <ol><li> Aplicar ungüento antibiótico bacitracina al ojo para reducir el riesgo de infección. </li><li> Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica para evitar la anestesia (mezcla de ketamina y xilazina) cause baja temperatura corporal después de la presión arterial baja. </li><li> Ponga los ratones de nuevo a la jaula de los animales después de que se despiertan de la anestesia. Monitorear los ratones diarios para las complicaciones. Si surgen complicaciones, la eutanasia a los ratones como se describe a continuación. </li></ol> 4. Sacrificio <ol><li> La eutanasia a los ratones por dislocación cervical después de la inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sodio, y enucleate El ojos en los puntos de tiempo apropiados para cada experimento (no se muestra). Evite aplicar presión en el ojo durante la enucleación debido hialuronato de sodio puede salirse. DR ampollosas deben ser persistentes durante al menos 14 días. </li></ol>

<ol>
	<li>Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+recovery+in+the+reattached+retina.">Morphological recovery in the reattached retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).</li><li>Cook, B., Lewis, G. P., Fisher, S. K., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+photoreceptor+degeneration+in+experimental+retinal+detachment.">Apoptotic photoreceptor degeneration in experimental retinal detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 990-996 (1995).</li><li>Zacks, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+Activation+in+an+Experimental+Model+of+Retinal+Detachment.">Caspase Activation in an Experimental Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 1262-1267 (2003).</li><li>Zacks, D. N., Han, Y., Zeng, Y., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Signaling+Pathways+and+Stress-Response+Genes+in+an+Experimental+Model+of+Retinal+Detachment.">Activation of Signaling Pathways and Stress-Response Genes in an Experimental Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 1691-1695 (2006).</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytokine+responses+to+retinal+detachment+in+rats.">Characterization of cytokine responses to retinal detachment in rats.</a> Mol. Vis. 12, 867-878 (2006).</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Necrosis+Factor-Mediates+Photoreceptor+Death+in+a+Rodent+Model+of+Retinal+Detachment.">Tumor Necrosis Factor-Mediates Photoreceptor Death in a Rodent Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. 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Eye Res. 24, 161-172 (2002).</li><li>Nakazawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 2425-2430 (2007).</li><li>Trichonas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinases+mediate+retinal+detachment-induced+photoreceptor+necrosis+and+compensate+for+inhibition+of+apoptosis.">Receptor interacting protein kinases mediate retinal detachment-induced photoreceptor necrosis and compensate for inhibition of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 21695-21700 (2010).</li><li>Roh, M. I., Murakami, Y., Thanos, A., Vavvas, D. G., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edaravone,+an+ROS+Scavenger,+Ameliorates+Photoreceptor+Cell+Death+after+Experimental+Retinal+Detachment.">Edaravone, an ROS Scavenger, Ameliorates Photoreceptor Cell Death after Experimental Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3825-3831 (2011).</li><li>Mantopoulos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauroursodeoxycholic+acid+(TUDCA)+protects+photoreceptors+from+cell+death+after+experimental+retinal+detachment.">Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) protects photoreceptors from cell death after experimental retinal detachment.</a> PLoS One. 6, e24245 (2011).</li><li>Yang, L., Bula, D., Arroyo, J. G., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+retinal+detachment-associated+photoreceptor+cell+loss+in+Bax-deficient+mice.">Preventing retinal detachment-associated photoreceptor cell loss in Bax-deficient mice.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 648-654 (2004).</li><li>Cebulla, C. M., Ruggeri, M., Murray, T. G., Feuer, W. J., Hernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+murine+retinal+detachment+model.">Spectral domain optical coherence tomography in a murine retinal detachment model.</a> Exp. Eye Res. 90, 521-527 (2010).</li><li>Secondi, R., Kong, J., Blonska, A. M., Staurenghi, G., Sparrow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundus+Autofluorescence+Findings+in+a+Mouse+Model+of+Retinal+Detachment.">Fundus Autofluorescence Findings in a Mouse Model of Retinal Detachment.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 5190-5197 (2012).</li><li>Machemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+retinal+detachment+in+the+owl+monkey.+IV.+The+reattached+retina.">Experimental retinal detachment in the owl monkey. IV. The reattached retina.</a> Am. J. 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Sci. 53, 1685-1695 (2012).</li><li>Leon, S., Yin, Y., Nguyen, J., Irwin, N., Benowitz, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+injury+stimulates+axon+regeneration+in+the+mature+rat+optic+nerve.">Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve.</a> J. Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).</li><li>Murakami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+choroidal+neovascularization+via+brief+subretinal+exposure+to+a+newly+developed+lentiviral+vector+pseudotyped+with+Sendai+viral+envelope+proteins.">Inhibition of choroidal neovascularization via brief subretinal exposure to a newly developed lentiviral vector pseudotyped with Sendai viral envelope proteins.</a> Hum. Gene Ther. 21, 199-209 (2010).</li><li>Kong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV5+vector+facilitates+quicker+transgene+expression+in+photoreceptor+and+retinal+pigment+epithelial+cells+of+normal+mouse.">Self-complementary AAV5 vector facilitates quicker transgene expression in photoreceptor and retinal pigment epithelial cells of normal mouse.</a> Exp. Eye Res. 90, 546-554 (2010).</li></ol>

El Massachusetts Eye y Ear Infirmary tiene un interés de propiedad en tres patentes estadounidenses dirigidas al uso de verteporfina. Además, la Massachusetts Eye and Ear Infirmary tiene interés de propiedad en determinadas solicitudes de patente dirigidas a la destrucción selectiva de la neovasculatura coroidea subretiniana para el tratamiento de la degeneración macular y otros trastornos. El Massachusetts Eye y Ear Infirmary recibe las regalías como resultado de estas patentes y solicitudes de patentes y el Dr. Miller recibe una parte de la misma de acuerdo con el Massachusetts Eye y Ear Política de Enfermería institucional de Patentes y Procedimientos, que incluye disposiciones sobre la distribución de regalías. El autor, el Dr. Joan W. Miller, es miembro de la junta anterior y ex accionista de Alcon, Inc., y actualmente se desempeña como asesor de Alcon, Imagen Biotech, Inc.; Isis Pharmaceuticals; Kalvista farmacéuticos; Regeneron Pharmaceuticals, Inc y ONL Therapeutics, LLC. Dr. Demetrios G. Vavvas sirvecomo consultor para Roche, Genentech, Kala Farmacéuticos.

Existen varios métodos para el establecimiento de un modelo de desarrollo rural en los ojos de roedor se han reportado 3-15, 22. La mayoría de ellos utilizan la inyección subretiniana de hialuronato de sodio debido a que es un material viscoso utilizado comúnmente durante la cirugía intraocular en seres humanos, y no se asocia con ninguna toxicidad ocular conocido 1-15. El hialuronato de sodio, en lugar de solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato (PBS), aumenta la duración de la RD. Los métodos para la inyección subretiniana de hialuronato sódico usan uno de dos enfoques: un enfoque transvítrea 3-6 o un enfoque transescleral 7-15. Ambos métodos se llevan a cabo con la observación del fondo de ojo. En el enfoque transvítrea, un inyector de subretiniano se introduce en la cavidad vítrea, un retinotomía se crea en la retina periférica, y el hialuronato de sodio se inyecta en el espacio subretiniano. En este método, se hacen dos lágrimas de la retina, lo que aumenta el riesgo de la retinal hemorragia que podría ir en el espacio subretiniano. Además, hay un riesgo de lesión de la lente cuando se crea el retinotomía. Hay varios métodos modificados para el enfoque transescleral. En la mayoría de estos métodos 7-12, después de reducir la presión intraocular con un pinchazo de la cámara anterior, una aguja de 30 G conectada a una jeringa llena de hialuronato de sodio se inserta directamente en el espacio subretiniano través de la conjuntiva, la esclerótica, la coroides, y el RPE. El hialuronato de sodio se inyecta a continuación en el espacio subretiniano. El riesgo de desgarro de la retina y el cristalino lesión utilizando este método transescleral es menor que usando el enfoque transvítrea. Sin embargo, el agujero hecho en la esclerótica por una aguja de 30 G es grande, especialmente para los ojos del ratón, y el hialuronato de sodio se inyecta en el espacio subretiniano se escapa fácilmente fuera del ojo a través de la herida escleral. Esto conduce a una, RD menos persistente inferior y la muerte de las células fotorreceptoras más variable. Por otra parte, si la hemorragia coroidea se produce enla etapa de perforación de la esclerótica, la hemorragia se extienda en el espacio subretiniano porque la presión intraocular se ha reducido antes de la inyección de hialuronato subretiniano. Varios factores pueden influir en el efecto de RD en el desprendimiento de retina, incluyendo tanto la hemorragia subretinal y la altura y la persistencia de RD 16-21. Células fotorreceptoras muerte aumenta con el aumento de altura de RD 16, 17, y el daño de las células fotorreceptoras pueden ser más extensa debido a la menor difusión de oxígeno y nutrientes esenciales de los coriocapilar con mayor RD en comparación con RD poco profunda. Hemorragia subretiniana también es tóxico para las células fotorreceptoras 18-21; posibles mecanismos de esta toxicidad en el desprendimiento de retina incluyen la hipoxia y la alteración metabólica por la hemorragia subretiniana como barrera de difusión, y la neurotoxicidad directa inducida por los componentes de la sangre (como el hierro). Lesión de la lente, que ha sido divulgado para tener un efecto protector sobre Retilas células ganglionares nal 23, también pueden afectar a la muerte de las células fotorreceptoras después de la inducción de la RD. Además, si el sitio de entrada de la herida no está sellado, hialuronato de sodio puede salirse con la manipulación ojo durante la enucleación. Esto puede conducir a una clasificación errónea de un RD tan superficial, que a su vez puede afectar a la interpretación de los resultados. Hemos modificado el método transescleral para inyección subretiniana de hialuronato de sodio para aumentar la reproducibilidad de RDS y reducir la tasa de hemorragia subretiniana. El paso crítico de este protocolo es la creación de una incisión escleral de auto-sellado utilizando una aguja de 30 G, que evita la fuga de hialuronato de sodio después de la inyección. A diferencia de los métodos anteriores, este protocolo se realiza sin la observación del fondo de ojo por lo que se presta mayor atención a la herida escleral. Aplicación de pegamento también evita que el hialuronato de sodio se salga del ojo. En nuestra experiencia, la tasa de hemorragia subretiniana con este protocolo wcomo significativamente menor que con otros protocolos. Si la hemorragia coroidea se produce durante la etapa de incisión escleral, saldrá del ojo a través de la herida escleral porque este paso se lleva a cabo antes de reducir la presión intraocular. Si la hemorragia coroidea se produce después de la reducción de la presión intraocular y desprendimiento de la retina neurosensorial, la sangre se diseccionar en el espacio subretiniano. Encontramos que esto suceda en aproximadamente el 5% de los casos, en contraste con un 10-20% con las otras técnicas. Estos animales deben ser excluidos del análisis. Esta técnica también se puede utilizar para la inyección subretiniana de la transferencia de genes mediada por vectores para dirigir las células fotorreceptoras o RPE 24, 25. Debido a que el típico vehículo (PBS, solución salina) para estas inyecciones es significativamente menos viscoso que el hialuronato de sodio, técnicas estándar están plagados de más fugas. La técnica descrita en el presente documento, mediante la reducción de este riesgo, hace experimentos de transferencia de vector más reproducible yconfiable.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50660/">Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate</a>. The footnotes were removed from the abstract due to redundancy in the introduction.

Erratum: Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

La muerte de las células fotorreceptoras y la posterior disminución visual se produce cuando los fotorreceptores se separan del epitelio pigmentario de la retina subyacente. La separación física de los fotorreceptores se observa en diversos trastornos de la retina, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), coriorretinopatía serosa central, retinopatía diabética, y retinopatía de la prematuridad, así como regmatógeno (es decir, causada por una rotura en la retina) desprendimiento de retina ( RD). Inyección subretiniana de hialuronato sódico es un modelo ampliamente aceptado para crear un RD que conduce a la muerte de células fotorreceptoras, proporcionando información sobre la fisiopatología de la degeneración de los fotorreceptores 1-15. Degeneración de los fotorreceptores inducida por la inyección subretiniana hialuronato de sodio, por primera vez en 2001 7, tiene la ventaja de un curso de tiempo razonable (días a semanas). Sin embargo, puede tener una variabilidad significativa de la pérdida de las células fotorreceptoras del animal al ánimal debe a dos factores principales que afectan a la muerte de las células fotorreceptoras después RD: 1) la altura y duración de la RD, y 2) la ocurrencia de hemorragia subretiniana. Hay una curva de aprendizaje empinada técnica al método que contribuye a ambos factores. Aumenta la degeneración de las células fotorreceptoras con la altura de la RD, como la distancia entre el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y fotorreceptores capa aumenta 16-17. De acuerdo con estos informes, los experimentos anteriores mostraban más muerte de los fotorreceptores en los DR ampollosas que RDs poco profundas. También se ha informado de que la hemorragia subretinal es tóxico para las células fotorreceptoras y afecta a la muerte de las células fotorreceptoras 18-21. Asimismo, hemos observado más muerte de los fotorreceptores en los DR con hemorragia subretiniana que RDs sin hemorragia subretiniana. Por lo tanto, las técnicas para minimizar la variabilidad tienen que centrarse en la consecución de alturas consistentes de RD evitando la hemorragia subretiniana. Nuestro método modificado de enducir RD puede hacer bullosa reproducible y RD persistente en la misma posición del ojo con baja incidencia de hemorragia subretiniana. Se realizó la cirugía utilizando un enfoque temporal debido a que es más fácil de lograr un campo operativo más amplio en comparación con otros sitios. Después de la incisión conjuntival, una incisión escleral de auto-sellado se realiza utilizando una aguja de 30 G. Se crea un túnel escleral, seguido por la penetración de la esclerótica en la coroides. Si la hemorragia coroidea se produce en esta etapa, la hemorragia se sale del ojo a través de la herida escleral, y el sangrado puede ser detenido por astriction con una lanza quirúrgica. Una punción de la cámara anterior se lleva a cabo a continuación de la córnea para reducir la presión intraocular. Este es un paso importante, ya que la inyección subretiniana solo dará lugar a un aumento de la presión intraocular con la oclusión de la arteria retiniana resultante y la isquemia de la retina interna. Una aguja de calibre 33 conectada a una jeringa Hamilton l 10 se inserta entonces en el espacio subretiniano, y 3,5 μ; L hialuronato de sodio se inyecta suavemente para desprender la retina neurosensorial del EPR subyacente. En contraste con otros métodos de inducción de RD que se lleva a cabo bajo la observación del fondo de ojo, esta técnica se realiza bajo observación directa. Desde la herida escleral cuenta con un sello, el hialuronato de sodio no se saldrá después de la inyección. Por último, el pegamento se coloca en la herida escleral, y la conjuntiva se vuelve a unir a su posición original. Estos dura pasos también reducen el riesgo de fugas de hialuronato de sodio. La inyección de hialuronato de sodio 3.5 l crea RDs reproducibles (50% de la retina) en los ojos de ratones de 8 semanas de edad. La creación de la herida auto-sellado es el paso más importante en nuestro procedimiento modificado, ya que evita que el hialuronato de sodio inyectado se salga del ojo, permitiendo así bullosa reproducible y RDs persistentes.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketaject</td>
 <td>Phoenix</td>
 <td>2010025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AnaSed</td>
 <td>LLOYD</td>
 <td>4004821</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide</td>
 <td>Massachusetts Eye and Ear Pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution</td>
 <td>AKORN</td>
 <td>17478-263-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Provics</td>
 <td>Alcon</td>
 <td>8065183085</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Webglue</td>
 <td>Patterson Veterinary</td>
 <td>07-8566128</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MG90</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30G1/2 PrecisionGlide Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weck-Cel Eye Spears</td>
 <td>Beaver-Visitec</td>
 <td>0008685</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 Microliter Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7635-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>33 gauge, 0.5 inch needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18mm Cover Glass</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>18-548A</td>
 <td></td>
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retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate

Subretiniana inyección de hialuronato de sodio es un método ampliamente aceptado de inducir el desprendimiento de retina (DR). Sin embargo, la altura y la duración de la RD o la aparición de hemorragia subretiniana pueden afectar a la muerte de las células fotorreceptoras en la retina desprendida. Por lo tanto, es ventajoso para crear los DR reproducibles sin hemorragia subretiniana para evaluar la muerte celular de fotorreceptores. Hemos modificado un método reportado previamente para crear bullosa y RDs persistentes en una zona reproducible con baja incidencia de hemorragia subretiniana. El paso crítico de este método modificado es la creación de una incisión escleral de auto-sellado, que puede evitar la fuga de hialuronato de sodio después de la inyección en el espacio subretiniano. Para hacer la incisión escleral de auto-sellado, se crea un túnel escleral, seguido por la penetración de la esclerótica en la coroides con una aguja de 30 G. Aunque se puede producir hemorragia coroidea durante este paso, astriction con una lanza quirúrgica reduce la tasa de dobladillo coroideaorrhage. Este método permite un modelo más reproducible y fiable de la muerte de los fotorreceptores en enfermedades que implican RD tales como regmatógeno RD, retinopatía del prematuro, retinopatía diabética, coriorretinopatía serosa central, y degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

Para evaluar la persistencia de la RD realizadas por este protocolo, cryosections se realizaron los días 3, 7 y 14 después de la inducción de la RD. Seis ojos se utilizaron para cada punto de tiempo. Hematoxilina y eosina (HE) tinción se utiliza para visualizar las secciones. Todas las secciones mostraron un RD bulloso acercarse a la lente (Figura 2). Un ojo mostró hemorragia subretiniana en el día 7. No hay ojos mostraban algún signo de infección o lesión de la lente. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig1highres.jpg" /> Figura 1. Creación de una incisión escleral de auto-sellado. Este esquema muestra una imagen en sección transversal de un ojo normal de ratón. La línea roja indica la incisión escleral de cierre automático. Un túnel escleral seguido por la penetración de la esclerótica en la coroides con una aguja de 30 G crea una incisión escleral de auto-sellado. Esta herida escleralserá auto-sellado con la presión intraocular, que puede evitar la fuga de hialuronato de sodio después de la inyección en el espacio subretiniano y lograr desprendimientos de retina ampollosas persistentes. <img src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50660/50660fig2highres.jpg" /> Figura 2. Evolución temporal de desprendimiento de retina. Esta foto del fondo de ojo muestra un desprendimiento de retina bulloso sin hemorragia subretiniana inmediatamente después de la cirugía. Criosecciones con hematoxilina y eosina (HE) tinción espectáculo persistente desprendimiento de retina bulloso sin hemorragia subretiniana través de por lo menos 14 días.

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Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Creación de los desprendimientos de retina experimentales con una altura reproducible y sostenida de desprendimiento, y sin hemorragia subretinal, es importante para el estudio de la fisiopatología de la pérdida de células de fotorreceptores en la enfermedad de la retina y la evaluación de las intervenciones terapéuticas potenciales. Aquí, se presenta un procedimiento de este tipo en detalle.

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

retinal-detachment-model-rodents-subretinal-injection-sodium

Research

JoVE Journal

Medicine

20.7K vistas.  Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Harvard Medical School.  Creación de los desprendimientos de retina experimentales con una altura reproducible y sostenida de desprendimiento, y sin hemorragia subretinal, es importante para el estudio de la fisiopatología de la pérdida de células de fotorreceptores en la enfermedad de la retina y la evaluación de las intervenciones terapéuticas potenciales. Aquí, se presenta un procedimiento de este tipo en detalle. 

Video: Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Investigación

Medicina

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Intrarrenal Inyección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En un modelo de rata de pielonefritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Studying Left Ventricular Reverse Remodeling by Aortic Debanding in Rodents

To better understand the left ventricular (LV) reverse remodeling (RR), we describe a rodent model wherein, after aortic banding-induced LV remodeling, mice undergo RR upon removal of the aortic constriction. In this paper, we describe a step-by-step procedure to perform a minimally invasive surgical aortic debanding in mice. Echocardiography was subsequently used to assess the degree of cardiac hypertrophy and dysfunction during LV remodeling and RR and to determine the best timing for aortic debanding. At the end of the protocol, terminal hemodynamic evaluation of the cardiac function was conducted, and samples were collected for histological studies. We showed that debanding is associated with surgical survival rates of 70-80%. Moreover, two weeks after debanding, the significant reduction of ventricular afterload triggers the regression of ventricular hypertrophy (~20%) and fibrosis (~26%), recovery of diastolic dysfunction as assessed by the normalization of left ventricular filling and end-diastolic pressures (E/e&#39;&#160;and LVEDP). Aortic debanding is a useful experimental model to study LV RR in rodents. The extent of myocardial recovery is variable between subjects, therefore, mimicking the diversity of RR that occurs in the clinical context, such as aortic valve replacement. We conclude that the aortic banding/debanding model represents a valuable tool to unravel novel insights into the mechanisms of RR, namely the regression of cardiac hypertrophy and the recovery of diastolic dysfunction.

Here we describe a step-by-step protocol of surgical aorta debanding in the well-established mice model of aortic-constriction. This procedure not only allows studying the mechanisms underlying the left ventricular reverse remodeling and regression of hypertrophy but also to test novel therapeutic options that might accelerate myocardial recovery.

Estudio de la remodelación inversa del ventrículo izquierdo por desbanding aórtico en roedores

To better understand the left ventricular (LV) reverse remodeling (RR), we describe a rodent model wherein, after aortic banding-induced LV remodeling, ...

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the pathophysiological changes of human OA. However, as the main symptom in the late stage of OA, pain affects the patients&#39; daily life, and there are not many available models. The mono-iodoacetate (MIA)-induced model is the most widely used OA pain model, mainly used in rodents. MIA is an inhibitor of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, which causes chondrocyte death, cartilage degeneration, osteophyte, and measurable changes in animal behavior. Besides, expression changes of matrix metalloproteinase (MMP) and pro-inflammatory cytokines (IL1 &#946; and TNF &#945;) can be detected in the MIA-induced model. Those changes are consistent with OA pathophysiological conditions in humans, indicating that MIA can induce a measurable and successful OA pain model. This study aims to describe the methodology of intra-articular injection of MIA in rats and discuss the resulting pain-related behaviors and histopathological changes.

This study describes the method of intra-articular injection of mono-iodoacetate in rats and discusses the resulting pain-related behaviors and histopathological changes, which provide references for future applications.

Modelo de dolor de osteoartritis inducido por inyección intraarticular de monoyodoacetato en ratas

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. To investigate pathological mechanisms of retinal ischemia, relevant experimental models need to be developed. Anatomically, a main retinal blood supplying vessel is the ophthalmic artery (OpA) and OpA originates from the internal carotid artery of the common carotid artery (CCA). Thus, disruption of CCA could effectively cause retinal ischemia. Here, we established a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion (tBCCAO) to tie the right CCA with 6-0 silk sutures and to occlude the left CCA transiently for 2 seconds via a clamp, and showed that tBCCAO could induce acute retinal ischemia leading to retinal dysfunction. The current method reduces reliance on surgical instruments by only using surgical needles and a clamp, shortens occlusion time to minimize unexpected animal death, which is often seen in mouse models of middle cerebral artery occlusion, and maintains reproducibility of common retinal ischemic findings. The model can be utilized to investigate the pathophysiology of ischemic retinopathies in mice and further can be used for in vivo drug screening.

Here, we describe a mouse model of retinal ischemia by transient bilateral common carotid artery occlusion using simple sutures and a clamp. This model can be useful for understanding the pathological mechanisms of retinal ischemia caused by cardiovascular abnormalities.

Un modelo murino de lesión retiniana isquémica inducida por la oclusión bilateral transfronteriza de la arteria carótida común

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...