O. Kurtulus y D. Dimlioglu el apoyo de un laboratorio de investigación Comisiones Award Program de la Universidad de California 12-LR-237197. P. Daggumati con el apoyo de la Universidad de California Davis, las inversiones en investigación en el (RISE), Premio de Ciencias e Ingeniería. CA Chapman con el apoyo de un Departamento de Áreas de Asistencia Graduados de Educación de Beca Nacional de Necesidad. Este trabajo fue apoyado por el Programa UC Lab Comisiones de Investigación, Universidad de California en Davis RISE y UC Davis Facultad de Ingeniería de los fondos de puesta en marcha.

1. Nanoporosa Fabrication Oro <ol><li> Sustratos limpios en solución Piranha <ol><li> Añadir 25 ml de peróxido de hidrógeno (30%) a 100 ml de ácido sulfúrico (96%) en una cubeta de cristalización y se calienta la mezcla a 65 ° C sobre una placa calefactora. PRECAUCIÓN: Los líquidos son sumamente corrosivo y debe manejarse con cuidado. La solución gastada no se debe almacenar en un contenedor sellado, ya que puede explotar. </li><li> Place de 1 pulgada por portaobjetos de 3 pulgadas en la mezcla utilizando pinzas resistentes a los ácidos y limpiarlos durante 10 min. Utilice un barco inmunotinción porcelana para lotes pequeños de limpieza cubreobjetos. Tratar pequeñas cubreobjetos con plasma de aire a 10 W durante 30 segundos antes de la inmersión en la solución. </li><li> Enjuague las muestras limpias en platos de cristalización bajo el chorro de agua desionizada (DI) durante 3 min. Muestras Blow-seca con una pistola de nitrógeno más toallas sin pelusa. </li></ol></li><li> Preparar la máscara de la plantilla (Método 1: Utilice esto para crear patrones a escala milimétrica) <ol><li> Ponche de 250 micras de espesor, hojas de elastómero de silicona con biopsia golpes y / o incisión a regiones con un bisturí sobre una superficie de plástico semi-duro. Limpiar las hojas de elastómero procesados ​​en el 70% de isopropanol y secar con pistola de nitrógeno. </li><li> Coloque la hoja troquelada en una toalla sin pelusa para salas blancas y alinear los cubreobjetos pirañas limpios sobre la plantilla con la superficie de la muestra frente a la plantilla. </li></ol></li><li> Patrón fotoprotector despegue (Método 2: Utilice esto para crear patrones submilimétrica escala) <ol><li> Coloque una piraña limpiado portaobjetos en el hilado mandril y soplar las partículas con pistola de nitrógeno. Dispensar 1,5 ml de promotor de la adhesión (hexametildisilazano) sobre el portaobjetos de vidrio usando una pipeta de plástico. Extender el promotor haciendo girar la diapositiva sucesivamente a 500 rpm durante 5 segundos y 1500 rpm durante 30 seg. Hornear la diapositiva sobre una placa caliente a 115 º C durante 7 minutos y dejar que se enfríe durante 5 min. </li><li> Dispensar 4 ml de resina fotosensible sobre el portaobjetos de vidrio (3 pulgadas by 1 pulgada). Corre la resina fotosensible haciendo girar la corredera con el mismo protocolo que para el promotor de adhesión. Hornee el fotoprotector en una placa caliente a 115 ° C durante 1,5 minutos y dejar enfriar durante 10 minutos. </li><li> Exponga la diapositiva fotosensible recubierto con luz UV (intensidad: 22 mW / cm 2) a través de una máscara de transparencia durante 15 s. Hornear la resina fotosensible en una placa caliente a 115 ° C durante 1,5 min y esperar durante 45 min. Disolver el fotoprotector expuesto en el revelador durante al menos 3,5 minutos. Enjuague bien con agua DI. Inspeccione los patrones desarrollados bajo un microscopio óptico. </li></ol></li><li> Depósito metales precursores para producir películas delgadas np-Au <ol><li> Cargar las muestras en una máquina de pulverización catódica que puede depositar de forma independiente de oro, plata y cromo. Pulverización catódica a limpiar las muestras de 90 segundos a 50 W menos de 25 mTorr atmósfera de argón procesamiento antes de iniciar la deposición de metal. </li><li> Pulverización catódica cromo durante 10 minutos a 300 W menores de 10 mTorr argón. Pulverización catódica de oro por 90 segundos a 400 W sinder 10 mTorr de argón. Co-pulverización catódica de oro y plata durante 10 minutos con la plata en 200 W y Au potencia en 100 W. Apague oro pulverización fuente de aproximadamente 10 segundos antes de apagar la fuente de plata por pulverización catódica. </li></ol></li><li> Obtener micropatrones metálicos precursores <ol><li> Sonicar muestras fotoprotector recubiertos en aproximadamente 180 ml de separador fotoprotección durante 10 ciclos de 20 seg de sonicación y 2 min de pausa entre los ciclos. Lavar las muestras con agua desionizada y secar con una pistola de nitrógeno. Inspeccione los patrones de metal bajo un microscopio. </li><li> Pelar la plantilla elastómero de muestras recubiertas no fotosensible con dos pinzas para revelar el metal depositado. </li></ol></li><li> Dealloy metálico precursor y nanoestructura modificar mediante tratamiento térmico <ol><li> Llenar un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml con 170 ml de ácido nítrico (70%) y mantener la temperatura de la solución a 55 ° C sobre una placa calefactora. ATENCIÓN: El ácido nítrico es extremadamente corrosivo y debe manejarse con equipo de protección adecuado. </li&gt; <li> Tratar pequeños cubreobjetos con plasma de aire a 10 W durante 30 segundos antes de la inmersión en ácido nítrico. Place de 1 pulgada por portaobjetos de 3 pulgadas en el vaso con unas pinzas antiácido y dealloy ellos durante 15 min. Utilice un barco inmunotinción porcelana para lotes pequeños dealloying cubreobjetos. </li><li> Enjuague las muestras dealloyed sucesivamente por inmersión en dos vasos llenos de agua DI fresca tres veces. Almacene las muestras en agua DI y cambie el agua con agua DI fresca todos los días durante al menos una semana. Muestras Blow-seca con una pistola de nitrógeno sobre toallas sin pelusa antes de su uso. </li><li> Cargar las muestras sobre una oblea de silicio limpia en un equipo de procesamiento térmico rápido. Ajustar la temperatura a entre 200 ° C y 450 ° C y la velocidad de rampa de 10 ° C / seg. Exponer las muestras a la temperatura prescrita durante 10 min en atmósfera de nitrógeno ambiente. Deje que la cámara de frío (&lt;100 ° C) y retire las muestras. Por otra parte, poco a poco poner las muestras en la placa calefactora para Tratamiento térmicoent. </li></ol></li></ol> 2. Cultivo Celular <ol><li> Prepare np-Au muestras para cultivo celular <ol><li> Coloque np-Au muestras en platos de poliestireno y tratamiento con plasma de aire de 10 W durante 30 segundos y transferir las muestras a placas de cultivo tisular de 24 pocillos. </li><li> Añadir 500 l medio de cultivo completo (medio Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina / estreptomicina) a cada pocillo. Almacenar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que la siembra de las células (&lt;1 hora). </li></ol></li><li> Mantener, de paso, y la semilla de células <ol><li> Mantener las células de interés (en este caso los fibroblastos NIH 3T3-o astrocitos murinos) en matraces T75 con medios de cultivo y el paso cuando las células son un 70% confluentes. </li><li> Para pases las células, eliminar los medios de comunicación desde el frasco, lavar dos veces con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadir 2 ml de 1x tripsina / EDTA y se incuba hasta que las celdas de desconexión (~ 5 minutos). Añadir 3 ml de medio fresco ycentrifugar a 1200 rpm durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y se resuspende el precipitado en los medios de comunicación 2 ml. </li><li> Retirar los medios gastados de los pocillos y las semillas de células en los cubreobjetos de vidrio a una densidad de 25.000 células / cm 2 con un volumen final de 1 ml. Agite la placa de cultivo de adelante-atrás y de derecha a izquierda para garantizar un recubrimiento uniforme de las células sobre las muestras. Se incuban las células hasta su análisis mientras que la inspección diaria. </li></ol></li></ol> 3. Célula y análisis de materiales <ol><li> Mancha de las células para visualizar citoesqueleto y núcleos <ol><li> Retire los medios gastados de pocillos y lavar las células dos veces con PBS. Fijar las células en paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min. </li><li> Preparar la solución de tinción de 300 nM Alexa Fluor 488 faloidina en PBS con 1% de albúmina sérica bovina. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS, y permeabilizar en 500 l 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 5 min. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS y transferirlos para limpiar pozos. Blot 50-200 solución de tinción l en las muestras y almacenar en oscuridad durante 20 min. </li><li> Lavar las células con PBS y tinción de contraste con 3 nM de DAPI en PBS durante 5 min. </li><li> Lavar las células con PBS y sumergir en agua desionizada antes de su montaje en portaobjetos de vidrio cubierta con los medios de fijación y sellado con esmalte transparente. </li></ol></li><li> Adquirir imágenes de np-Au muestras y cultivos celulares de np-Au superficies <ol><li> Superficies Image np-Au con microscopio electrónico de barrido (SEM) con 50,000 X ampliación a 10 kV de energía de electrones usando un detector de electrones secundarios. </li><li> Captura de imágenes compuestas de células en diferentes puntos sobre las muestras usando un microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 10 veces con los cubos de filtros apropiados. </li></ol></li><li> Imágenes de proceso para determinar la morfología de los poros y células <ol><li> Abrir imágenes en ImageJ y dividido en canales individuales si es aplicable. Convertir las imágenes a 8 bits, restar el fondo, y suavizarlos por filteri medianang. Ajuste del umbral, ya sea manualmente o por una función de algoritmos de umbralización para resaltar los poros (huecos) y cuerpos celulares / núcleos. </li><li> Utilice el comando cuenca para separar los poros o células fusionadas. Establezca los parámetros de análisis de partículas y ejecutar el comando para extraer el número de partículas, zona media y la cobertura ciento por partículas. Usar imágenes de células teñidas con DAPI para el recuento de células y las imágenes de células teñidas con faloidina para la cuantificación de cobertura de la célula por ciento. </li><li> Modificar los archivos de macros incluidas para realizar el análisis de lotes de varias imágenes. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).</li><li>Weissm&#252;ller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theme+Article+-+Nanoporous+Metals+by+Alloy+Corrosion:+Formation+and+Mechanical+Properties.">Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties.</a> Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).</li><li>Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+nanoporosity+in+dealloying.">Evolution of nanoporosity in dealloying.</a> Nature. 410, 450-453 (2001).</li><li>Okman, O., Lee, D., Kysar, J. 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Mater. 19, 3902 (2007).</li><li>Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+free+prostate+specific+antigen+(fPSA)+on+a+nanoporous+gold+platform.">Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform.</a> The Analyst. 133, 319-322 (2008).</li><li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fabrication+of+low-impedance+nanoporous+gold+multiple-electrode+arrays+for+neural+electrophysiology+studies.">The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies.</a> Nanotechnology. 21, 125504 (2010).</li><li>Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication-Compatible+Nanoporous+Gold+Foams+as+Biomaterials+for+Drug+Delivery.">Microfabrication-Compatible Nanoporous Gold Foams as Biomaterials for Drug Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. 1, 172-176 (2012).</li><li>Okman, O., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+Nanoporous+Gold.">Microfabrication of Nanoporous Gold.</a> Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69 (2012).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+and+mechanical+properties+of+nanoporous+gold+at+the+nanoscale.">Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale.</a> Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).</li><li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+post-fabrication+annealing+on+the+mechanical+properties+of+freestanding+nanoporous+gold+structures.">The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures.</a> Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).</li><li>Parida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+change+during+the+formation+of+nanoporous+gold+by+dealloying.">Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying.</a> Phys. 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Los autores no tienen ningún interés financiero en conflicto.

Demostramos dos técnicas diferentes para micropatrón np-Au películas para expandir el uso de estas películas en microsistemas y los estudios biológicos. Oro-recubrimiento por pulverización catódica y la plata es un método versátil para crear patrones de NP-Au, como pulverización catódica es compatible con procesos convencionales de microfabricación y la composición de la aleación y el grosor se puede controlar fácilmente mediante la variación de las potencias pistola de pulverización individuales (para ...

<p class="jove_content"&gt; Los materiales con características de nano-escala han mostrado prometedores en la mejora de varias aplicaciones, como las pilas de combustible<sup&gt; 1</sup&gt;, Sensores<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Y dispositivos biomédicos<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Un material relativamente nuevo es oro nanoporoso (NP-Au), que es producida por un proceso de auto-ensamblaje escala nano. El precursor de NP-Au es una aleación de oro que más comúnmente se compone de plata en 60% a 80% en porcentaje atómico. En pocas palabras, la nanoestructura de poro abierto característica es el resultado de la reordenación de los átomos de oro en racimos como la plata se disuelve por un ácido fuerte (<em&gt; Por ejemplo,</em&gt; Ácido nítrico al 70%) o bajo un potencial electroquímico<sup&gt; 6-8</sup&gt;. Np-Au beneficios de varios atributos deseables, incluyendo el área de gran superficie efectiva, alta conductividad eléctrica, las técnicas bien establecidas funcionalización de la superficie, y la biocompatibilidad<sup&gt; 9</sup&gt;. A pesar de que se ha producido una rápida expansión de los estudios sobre np-Au, la mayoría de ellos se centran en las propiedades mecánicas de np-Au<sup&gt; 10,11</sup&gt;, La actividad catalítica<sup&gt; 12</sup&gt;, Y el rendimiento de detección biomolecular<sup&gt; 13-15</sup&gt;. Mientras que los atributos deseables son altamente útiles para varias herramientas biomédicas<sup&gt; 16,17</sup&gt;, Las aplicaciones en esta área han sido limitados. Una posible razón para esto es que la mayoría de los estudios han utilizado predominantemente muestras macro escala (<em&gt; Por ejemplo,</em&gt; Hojas, láminas, y lingotes) y las técnicas para la incorporación de NP-Au en los sistemas miniaturizados han permanecido inadecuada. De hecho, hay sólo un puñado de ejemplos de la utilización de técnicas de microfabricación convencionales que emplean películas np-Au<sup&gt; 16-20</sup&gt;. Con el advenimiento de la tecnología de la miniaturización y la necesidad de nuevas herramientas biomédicas, se ha convertido en esencial para ser capaz de integrar nuevos materiales en los dispositivos. Esto normalmente requiere que los materiales pueden ser depositados y se modela con las técnicas convencionales de microfabricación. Además, es comúnmente necesario para evaluar la biocompatibilidad de un nuevo material rápida cuantificación de las interacciones célula-materiales. El objetivo de este trabajo es demostrar las técnicas básicas para micropatrón np-Au películas y cuantificar tanto nanoestructura y las interacciones célula-material a través de procesamiento de imagen digital.</p

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gold target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTAUXX403A2</td>
 <td >Precursor to alloy for producing np-Au</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chrome target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTCRXX353A2</td>
 <td >Adhesive layer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTAGXX403A2</td>
 <td >Precursor to alloy for producing np-Au</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Porcelain boat</td>
 <td>Thomas Scientific </td>
 <td>8542E40</td>
 <td >Used for processing small samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>43873</td>
 <td >Used at 70% for dealloying</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sulfuric acid</td>
 <td>J.T Baker </td>
 <td>7664-93-9</td>
 <td >Used at 96% for piranha cleaning</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide</td>
 <td>J.T Baker </td>
 <td>7722-84-1</td>
 <td >Used at 30% for piranha cleaning</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biopsy punches</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>150xx</td>
 <td >Available in several sizes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone elastomer sheets</td>
 <td>Rogers Corporation </td>
 <td>HT 6240</td>
 <td >Available in several thicknesses</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexamethyldisilazane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>440191-100ML</td>
 <td >Used as adhesion promoter for positive resist</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microposit MF CD26</td>
 <td>Shipley</td>
 <td>38490</td>
 <td >Positive photoresist developer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRS 3000</td>
 <td>J.T Baker</td>
 <td>JT6403-5</td>
 <td >Positive photoresist stripper</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circular glass coverslips (12 mm)</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>26023</td>
 <td >Used as substrate for metal patterns and cell culture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass slides (1 x 3 inch)</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>26007</td>
 <td >Used as substrate for metal patterns</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kapton polyimide tape</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82030-950</td>
 <td >Used for securing elastomer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transparency masks</td>
 <td>Output City</td>
 <td></td>
 <td>Used in photolithography <a href="http://www.outputcity.com/" target="_blank">http://www.outputcity.com/</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plasma cleaner</td>
 <td>Harrick Plasma</td>
 <td>PDC-32G</td>
 <td >Used for activating glass surfaces</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sputtering machine</td>
 <td>Kurt J. Lesker</td>
 <td>LAB18</td>
 <td >Used for depositing metals</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

microfabrication of nanoporous gold patterns for cell-material interaction studies

Los materiales nanoestructurados con tamaños de la característica en decenas de nanómetros han mejorado el rendimiento de varias tecnologías, como las pilas de combustible, biosensores, recubrimientos de dispositivos biomédicos, y las herramientas de administración de fármacos. Oro nanoporosa (np-Au), producida por un proceso de auto-ensamblaje escala nano, es un material relativamente nuevo que presenta gran área efectiva de superficie, alta conductividad eléctrica y la actividad catalítica. Estas propiedades han hecho np-Au un material atractivo para la comunidad científica. La mayoría de los estudios sobre np-Au emplean muestras macro-escala, y se centran en la ciencia fundamental de sus aplicaciones catalíticas y el sensor de material y. Las muestras de macro escala limitan el potencial de np-Au en sistemas miniaturizados, como dispositivos biomédicos. Para hacer frente a estos problemas, que inicialmente describen dos métodos diferentes para micropatrón películas delgadas np-Au sobre sustratos rígidos. El primer método emplea máscaras plantilla manualmente producidos para la creación a escala milimétrica patrones np-Au, while el segundo método utiliza fotolitografía despegue de modelado modelo submilimétrica escala. Como las películas delgadas np-Au se obtienen por el proceso de deposición por pulverización catódica, que son compatibles con las técnicas de microfabricación convencionales, de este modo susceptibles de fácil integración en microsistemas. Estos sistemas incluyen eléctricamente-direccionables plataformas de biosensores que se benefician de área de alta superficie efectiva, conductividad eléctrica, y bioconjugación superficie-tiol-basado en el oro. Se describe el cultivo de células, inmunotinción, y las técnicas de procesamiento de imágenes para cuantificar la interacción de NP-Au con células de mamíferos, que es un parámetro de rendimiento importante para algunos biosensores. Esperamos que las técnicas ilustradas aquí ayudarán a la integración de np-Au en plataformas a diferentes escalas de longitud y en numerosas aplicaciones, como biosensores, sistemas de almacenamiento de energía, y los catalizadores.

La figura 1 resume las principales etapas del procedimiento, incluida la creación de los patrones np-Au, el cultivo de células, la cuantificación de la nanoestructura, y caracterización de morfologías celulares. La plantilla elastómero se muestra en la Figura 2a (parte superior) se utiliza para la creación de los patrones de NP-Au que se muestran en las imágenes debajo. Figura 2b es una fotografía de la embarcación porcelana para especímenes de procesamiento ...

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Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Se presenta en las técnicas a micropatrón nanoporoso películas delgadas de oro a través de la impresión y la fotolitografía plantilla, así como los métodos a células de cultivo en los patrones de microfabricados. Además, se describen los métodos de análisis de imágenes para caracterizar la morfología de las células cultivadas utilizando electrónica de barrido y técnicas de microscopía de fluorescencia y de material.

Microfabricación de los patrones de oro Nanoporous de Estudios de interacción célula-materiales

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

microfabrication-nanoporous-gold-patterns-for-cell-material

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vistas.  University of California, Davis. Se presenta en las técnicas a micropatrón nanoporoso películas delgadas de oro a través de la impresión y la fotolitografía plantilla, así como los métodos a células de cultivo en los patrones de microfabricados. Además, se describen los métodos de análisis de imágenes para caracterizar la morfología de las células cultivadas utilizando electrónica de barrido y técnicas de microscopía de fluorescencia y de material.

Video: Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

El estudio de las trayectorias celular Rolling en los patrones del receptor asimétrica

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Investigación

Bioingeniería

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntesis, de la Asamblea, y caracterización de una sola capa de nanopartículas de oro protegidas Films de Electroquímica de proteínas monocapa

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.

A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.

Lengua electrónica Generar Patrones reconocimiento continuo para el análisis de proteínas

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Análisis preparación y fotoacústica de Vehículos celulares que contienen oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Síntesis de funcionalizados 10 nm recubierto de polímero partículas de oro para apuntar el endotelio y el suministro de medicamentos

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Síntesis de nanoclusters de oro de emisión de infrarrojo cercano para aplicaciones biológicas

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico para dimensionamiento de nanopartículas de oro en suspensión

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...