Este trabajo fue apoyado por una beca doctoral Wellcome Trust Clínica (ECAT).

1. Fabricación de Patrones Parileno sobre SiO2: Flujo de procesos (Ver Figura 1) <ol><li> Diseño desea la configuración parileno-C utilizando un paquete de software editor de diseño, capaz de leer / escribir CIF (Caltech forma intermedia) o los archivos GDS-II (Base de Datos de gráfico System-II). CIF y GDS-II son formatos de archivo estándar de la industria para el diseño de obras de circuito integrado. </li><li> Máscara foto Comisión fabricar a un centro de microelectrónica apropiadas, o hacer en casa si cuenta con instalaciones. </li><li> Oxidar una oblea de silicio en un horno horizontal atmosférica (H 2 1.88 SLM y O 2 1.25 SLM) a 950 ° C durante 40 minutos para producir una capa de SiO2 200 nm (confirmar espesor con una pequeña mancha espectroscópica reflectómetro). </li><li> Cebe la oblea oxidado con un promotor de adherencia de silano. Ahora depositar parileno-C a 22 ° C a una velocidad de 1.298 nm / mg de dímero utilizando un sistema de deposición al vacío diseñado específicamente para depositar parileno. Un 100recubrimiento nm de espesor de parileno-C se utiliza para todos los ejemplos que se muestran a continuación. </li><li> Siguiente depósito hexametildisilazano (HMDS) promotor de la adhesión en la oblea parylene recubierto utilizando un sistema adecuado recubrimiento fotorresistente. </li><li> Ahora girar la oblea a 4000 rpm durante 30 segundos mientras se aplica positivo fotorresistente (que resulta en un espesor teórico de 1 m), utilizando el mismo sistema de revestimiento de resina fotosensible como anteriormente. </li><li> Soft hornear la oblea de 60 segundos a 90 ° C. </li><li> Inserte tanto la oblea y la máscara de la foto prefabricada en un alineador de la máscara. </li><li> Exponer la oblea de resina fotosensible recubierto con una representación negativa de UV de la configuración de parileno-C deseada. </li><li> Hornee oblea expuesta durante 60 segundos a 110 ° C. </li><li> Retire todos los expuestos fotorresistente de la oblea mediante el desarrollo de una solución de revelado adecuado. </li><li> Grabe de la parylene sin protección. Utilizar un sistema de plasma de oxígeno de grabado (a una presión de la cámara 50 mTorr, 49 sccm O 2, 100 W de potencia de RF a 13,56 MHz, yuna velocidad de grabado de 100 nm / min) para revelar el SiO subyacente 2. </li><li> Dice la oblea usando una sierra cortar en cubitos apropiado (velocidad del husillo de 30.000 rpm, velocidad de alimentación de 7 mm / s). </li><li> Enjuague fichas en H2O desionizada y secar con nitrógeno. </li><li> Tienda fichas (indefinidamente) en cajas libres de polvo hasta que sea necesario. </li></ol> 2. Limpiar las virutas y Activación: Protocolo <ol><li> Eliminar fotorresistente residual de virutas por lavado en acetona durante 10 seg. </li><li> Enjuague con agua desionizada H 2 O destilada 3x. </li><li> Maquillaje ácido piraña fresco (una relación de 05:03 de peróxido de hidrógeno al 30% y ácido sulfúrico al 98%). PRECAUCIÓN: Prepare ácido piraña con gran cuidado. Es un oxidante muy potente, es fuertemente ácido, y la mezcla de peróxido de hidrógeno con ácido sulfúrico es una reacción exotérmica. Lleve a cabo esta etapa en una campana de extracción de ácido. Permita 2 min para pasar después de mezclar el ácido piraña pero utilizan menos de 20 min. </li><li> Virutas limpias y grabado por inmersión en piácido Ranha durante 10 min. </li><li> Enjuague fichas 3x en H2O desionizada y se transfieren a una placa de cultivo estéril. </li><li> Ahora active chips para modelar celular. Por ejemplo, agregue dos chips por pocillo de una placa de 6 pocillos y después agregue 2 ml de suero fetal bovino a fin de sumergirse completamente todos los chips. Realice esto, y todas las etapas posteriores de cultivo de células, en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejido de flujo laminar. </li><li> Incubar fichas en suero durante 3-12 horas a 37 ° C. NOTA: Los pasos 2.4 hasta 2.7 se debe realizar de forma secuencial y sin demora entre los pasos. Si la activación de suero tiene un retraso de 24 horas después de ≥ piraña tratos, patrón celular se deteriora debido a la reducción de repulsión celular de SiO2 regiones. Soluciones alternativas de activación que contienen proteínas específicas de adhesión celular pueden ser utilizados en lugar de suero bovino fetal. Tales soluciones alteran las características de adhesión celular de los dos sustratos contrastantes (ver resultados representativos para un ejemplo). </li&gt; </ol> 3. Plating Líneas Celulares On-chip: Protocolo <ol><li> Quite las virutas de su solución de activación y lavar una vez durante 10 segundos en solución salina equilibrada de Hank. </li><li> Coloque el chip en un pocillo de cultivo y la placa de tipo de célula elegida como una suspensión en su medio de crecimiento habitual. Óptima densidad de placas de células depende tanto del tipo de célula y el patrón geométrico de parileno-C en el chip. Una densidad de 5 x 10 4 células / ml es un punto de partida razonable. </li><li> Imaging se adapta a la motivación subyacente para el patrón celular, pero el comportamiento de células en vivo puede ser fácilmente evaluada utilizando un microscopio de disección y una cámara digital con una lente de relé adecuado. </li></ol>

<ol>
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Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Inmersión de virutas en ácido piraña sirve no sólo para eliminar cualquier material orgánico residual, pero también graba las superficies del substrato. Esto es clave para permitir la activación efectiva con suero fetal bovino. De no hacerlo, evita que la célula-patrón y altera profundamente el comportamiento de células en el chip. No hay ningún requisito para esterilizar los chips después de la limpieza con ácido pirañas. De hecho la esterilización por exposición a rayos UV se ha demostrado para socavar patrón celular de una manera dependiente de la dosis 13. Se debe tener cuidado al lavar toda fotoprotector residual después del proceso de fotolitografía. La persistencia de resina fotosensible puede actuar como una capa de cito-adhesivo no deseado que anula patrón dictado por parylene-C/SiO 2 geometría. La acetona es eficaz cuando se utiliza el proceso de fotolitografía se ha descrito anteriormente y con los reactivos especificados. Sin embargo, otros tipos de resina fotosensible pueden requerir un disolvente diferente. Para evaluar el impacto y el éxito de la difereetapas de fabricación nt, el ángulo de contacto de los dos sustratos contrastantes se pueden medir. Figura 2 ilustra las alteraciones que se producen durante el proceso de activación de chip. Es probable, sin embargo, que el adhesivo específico y componentes de la proteína de repulsión en el suero en última instancia, permiten que el chip de parileno-modelado para ejercer sus respectivas características cito-adhesivas o cito-repulsiva. Todos los resultados representativos utilizan los chips con un espesor parylene de 100 nm, aunque hemos modelado con éxito el uso de capas de parileno tanto más gruesas y más delgadas. Es importante destacar que esta técnica de grabado fotolitográfico permite un control mucho mayor de tres dimensiones de la configuración de parileno que la ilustrada aquí. Por ejemplo, utilizando una combinación de fotomáscaras, es posible crear regiones de parileno de espesor mixta. Esto abre el camino para la creación de cultivos celulares con la topografía tridimensional definida, va más allá de simplemente dictando las regiones de adhesión celular / repulsiónsión, que podría ofrecer un medio para integrar los canales de microfluidos en el constructo. Como se muestra, sin embargo, esta plataforma patrón no es universalmente eficaz en todos los tipos de células. Diferentes líneas celulares, con sus variados perfiles de moléculas de adhesión celular, como era de esperar se comportan de manera diferente cuando se cultivan en esta plataforma. Todavía no hemos identificado los componentes clave en el suero, ni a los receptores de la membrana celular de cortesía, que se basa esta plataforma celular-patrón. Si lo hace, en el futuro promete ampliar su utilidad y especificidad. Por ejemplo, una línea celular de &#39;no-patrones&#39; podría ser modificado genéticamente para expresar la molécula de adhesión necesaria y así promover patrones.

La comprensión de los mecanismos que dictan la adhesión celular y los patrones en materiales sintéticos es importante para aplicaciones tales como la ingeniería de tejidos, el descubrimiento de fármacos, y la fabricación de biosensores 1-3. Muchas técnicas están disponibles y en evolución, cada uno tomando ventaja de los factores biológicos, químicos y físicos que influyen multitud de adhesión celular. A continuación, describimos una técnica de células patrón que utiliza procesos desarrollados inicialmente para fines de fabricación microelectrónica. Como tal, la plataforma es una buena posición para permitir la integración aguas abajo de las tecnologías de la microelectrónica, como los acuerdos ambientales multilaterales, en la plataforma de modelado. La interfaz entre una membrana celular y un material adyacente es bidireccional y compleja. In vivo, las proteínas de la matriz extracelular proporcionan estructura y resistencia y el impacto en el comportamiento celular a través de interacciones con receptores de adhesión celular. De manera similar, las células en vitro interactuar con sustratos sintéticos a través de capas de proteínas absorbidas 4 mientras influencias físico-químicas también modular la adhesión. Por ejemplo, una superficie de polímero puede hacerse más &quot;humectable&quot; (hidrofílico) por iones o irradiación de luz ultravioleta, o grabado por tratamiento con ácido o hidróxido de 5. Los métodos establecidos para el patrón celular se aprovechan de estos y otros mediadores de adhesión celular. Los ejemplos incluyen la impresión de inyección de tinta 6, 7 de estampado por microcontacto, la inmovilización física 8, 9 microfluídica, manipulación en tiempo real 10, y el patrón molecular selectiva de montaje (SMAP) 11. Cada uno tiene ventajas y limitaciones específicas. Un factor clave en nuestro trabajo, sin embargo, es la integración de los patrones de células con los sistemas microelectromecánicos (MEMS). MEMS se refieren a extremadamente pequeños dispositivos mecánicos que funcionan con electricidad. Esto se superpone con la nanoescala equivalente, nanoelectromechsistemas mecánicos. Este concepto se convirtió en práctica sólo cuando las estrategias de semiconductores permitieron la fabricación que tendrá lugar en la microescala. Técnicas de microfabricación desarrollados originalmente para la electrónica de semiconductores inadvertidamente se han encontrado útiles para otros usos, como la electrofisiología celular, por ejemplo. Un objetivo clave es aguas abajo de combinar estas tecnologías microelectrónicos con un proceso de modelado de células de alta fidelidad (formando un dispositivo bioMEMS). Varias técnicas de modelado de células existentes y de otra manera fiables y prácticas son incompatibles con esta idea. Por ejemplo, la alineación precisa de ningún microelectrónica o biosensores integrados es fundamental para su eficacia, pero es extremadamente difícil de conseguir usando una técnica tal como estampado por microcontacto. Para evitar este problema, estamos trabajando en una plataforma de modelado basado en 2 SiO que utiliza fotolitográficamente impresa parileno-C. La fotolitografía implica la transferencia de características geométricas deuna máscara a un sustrato a través de iluminación UV. Una máscara se ha diseñado utilizando un programa de diseño asistido por ordenador adecuado. Después de una placa de vidrio, una capa delgada de cromo no transparente representa el patrón geométrico deseado (una resolución característica de 1-2 mm es posible). El sustrato para ser modelado está recubierta con una fina capa de resina fotosensible (un polímero sensible a UV). El polímero recubierto se alinea entonces y se pone en estrecho contacto con la máscara. Una fuente de UV se aplica de tal manera que las áreas no protegidas son irradiados y por lo tanto se vuelven solubles y extraíble en el siguiente paso de desarrollo, dejando una representación de parileno-C del patrón de máscara detrás. Este proceso se originó durante el desarrollo de dispositivos semiconductores. Como tal, las obleas de silicio se utilizan con frecuencia como un sustrato. Deposición de fotolitografía de parileno-C sobre SiO2 es, por tanto, un proceso sencillo y confiable que se lleva a cabo de manera rutinaria en las instalaciones de sala blanca de microelectrónica. Mientras parileno tienevarias características deseables de bioingeniería (químicamente inerte, no biodegradable), un factor de la restricción de su uso directo en la morfogénesis celular es su innata mala adhesividad celular, que se atribuye en parte a su extrema hidrofobicidad. Sin embargo, parileno-C se ha utilizado anteriormente indirectamente para el patrón de células, por ejemplo, como una plantilla de desprendimiento celular 12,13. Este enfoque está limitado por la mala resolución y requiere múltiples etapas. El proceso descrito aquí en lugar utiliza un paso de grabado ácido, seguido de la incubación de suero, para asegurar que las regiones de parileno-C se convierten en células-adhesivo, a través de una combinación de reducción de la hidrofobicidad de proteínas y suero de unión. El resultado final es una construcción compuesta de dos sustratos diferentes que, después de la activación biológica, manifiestan respectivas características cito-adhesivas o cito-repulsivo y así representa una plataforma eficaz golpeteo celular. Es importante destacar que no hay necesidad de introducir AG biológicapadres en la instalación de sala blanca como los sustratos estructurados se pueden almacenar indefinidamente antes de su uso (después de lo cual se activan utilizando suero bovino fetal u otra solución de activación). Por tanto, esta plataforma de modelado parylene-C/SiO 2 es un buen candidato para una coalición con componentes MEMS, como los procesos de fabricación por lo que reflejan de cerca las utilizadas para la fabricación microelectrónica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Plataformas de modelado celular apoyan las metas generales de la investigación, como la construcción de las redes neuronales predefinidos in vitro y la exploración de algunos aspectos centrales de la fisiología celular. Para combinar fácilmente los patrones de células con electrodos múltiples matrices (AMUMA) y basada en el silicio &quot;laboratorio en un chip &#39;tecnologías, se requiere un protocolo compatible con la microfabricación. Se describe un método que utiliza la deposición del polímero de parileno-C en SiO 2 obleas. La fotolitografía permite patrón preciso y fiable de parileno-C en la resolución a nivel de micras. Activación posterior mediante inmersión en suero fetal bovino (u otra solución de activación específica) se traduce en un sustrato en el que las células cultivadas se adhieren a, o son rechazados por, parileno o SiO 2 regiones respectivamente. Esta técnica ha permitido a los patrones de una amplia gama de tipos de células (incluyendo células primarias del hipocampo murinos, células HEK 293 línea celular de teratocarcinoma, similares a neuronas humanalínea de células, las células granulares del cerebelo primaria murino y células-madre como glioma humanos derivados primarios). Curiosamente, sin embargo, la plataforma no es universal; que refleja la importancia de las moléculas de adhesión de células específicas. Este proceso de modelado celular es rentable, confiable, y esto es importante se puede incorporar en la microfabricación protocolos estándar (fabricación de chips), allanando el camino para la integración de la tecnología microelectrónica.

El proceso fotolitográfico de modelar SiO2 con parileno-C se ilustra en la Figura 1. Una vez preparada, la activación de los chips en el suero bovino fetal permite una amplia gama de tipos de células para ser modelados en la cultura. Nuestro grupo ha modelado con éxito las células del hipocampo primaria murino 14-16, la línea celular HEK 293 17, el teratocarcinoma neurona como humana (hNT) línea celular 18, las células granulares del cerebelo primaria murino y células-madre como glioma humanos derivados primarios. La Figura 3 ilustra el patrón robusto de las células HEK 293 en un patrón de parileno que consiste en nodos circulares con extensiones retícula. La activación de la viruta en este ejemplo fue con suero bovino fetal. Por el contrario, la Figura 4 ilustra el potencial para aumentar la plataforma de patrón mediante el uso de soluciones de activación alternativa. El uso de una solución de albúmina de suero bovino (3 mg / ml) y se<html> fibronectina (1 g / ml) en HBSS, el precepto patrón anterior ha sido invertida. La Figura 5 ilustra un tipo de célula diferente (una línea primaria derivada de humanos de vástago celular derivada de un glioma de alto grado). Aquí, la geometría de la conducta celular impactos patrón subyacente, con el patrón que se muestra en la Figura 4A promover el crecimiento celular a lo largo de proceso delgada de parileno-C pistas como se muestra en las figuras 4B y 4C. Algunos tipos de células no hacen patrón cuando se utiliza el protocolo de activación de suero bovino fetal establecida. Figura 6 ilustra células 3T3 L1 crecimiento hasta confluencia sin diferencia cito-repulsivo o cito-adhesivo discernible entre parileno-C y SiO 2 regiones. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama de flujo que ilustra el proceso para la fabricación de los patrones de parileno-C sobre SiO2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama de flujo que ilustra los cambios en el ángulo de contacto para estampadas parileno-C y SiO 2 dominios durante pasos de activación de chip. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes de células vivas de 293 células HEK cultivadas en parylene-C/SiO 2 después de tres días in vitro. Fichas incubaron durante 3 horas en el suero fetal bovino después de lo cual las células fueronchapado en suspensión a una concentración de 5 x 10 4 células / ml. Parylene-C promueve la adhesión celular mientras desnuda SiO2 repele las células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figura 4. Imágenes de células vivas de células HEK 293 cultivadas en parylene-C/SiO 2 después de tres días in vitro chips activados durante 3 horas en diferentes soluciones de activación racionalizada:. A: suero fetal bovino, B: vitronectina (1 mg / ml) en HBSS, C: albúmina de suero bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 mg / ml) en HBSS, D: albúmina de suero bovino (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) en HBSS. Las células en placas fueron en suspensión a una densidad de 5 x 10 4 células / ml. Tenga en cuenta lo diferente que el tratamiento del chip ha resultado en la inversión del dogma del patrón anterior, con SiO2 ahora adhesiva y parileno-C repulsivo. Parylene-C Diámetro del nodo 250 micras, adaptado de Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figura 5. Inmunofluorescencia imágenes de células-madre como glioma humanos derivados primarios cultivados en varios patrones de parileno-C sobre SiO2 A:. Esquemático que ilustra el diseño parylene reticular se muestra en B y C </strong&gt; B:.. Fluorescencia micrografía de las células fijas (después de 4 días in vitro) se tiñeron para la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) C:. Micrografía de luz de células vivas en mismo chip D: imagen de fluorescencia que muestra células con tinción de GFAP en un parylene diferente . Diseño E:. imagen de reflectancia del nodo y habló diseño parylene reflejado en D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figura 6. Imágenes de células vivas de células 3T3 L1 cultivadas en parylene-C/SiO 2 después de cuatro días in vitro. Fichas activados durante 3 horas en el suero fetal bovino después de wcélulas hich se sembraron en suspensión (3 x 10 4 células / ml). En este caso, la plataforma no permite modelar, con células confluentes convertirse igualmente en parileno-C y SiO2 regiones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K vistas.  The University of Edinburgh.  Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones. 

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Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Investigación

Bioingeniería

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Patrones sustractiva rápida de las capas de células vivas con una sonda de microfluidos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Evaluación de la proliferación del Keratinocyte en dos y tres dimensiones substratos de colágeno de tipo I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...