Los autores agradecen a sus colegas y al personal de los laboratorios actuales y pasados ​​que han apoyado el desarrollo de esta técnica. El laboratorio de SP es apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud de subvención de funcionamiento MOP-84473 y Alberta Soluciones Innova-Salud (financiado por la Fundación Alberta Heritage Endowment Fund para la Investigación Médica). DP fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones MD001091-01 y GM068855-02.

1. Preparación de los cultivos bacterianos, Herramientas y Reactivos (DAY 1, Tarde) <ol><li> Por la tarde, inocular 1-5 ml de caldo LB en autoclave estéril (por ejemplo, 100 x 13 mm) tubos de ensayo de vidrio de borosilicato con una pequeña alícuota de bacterias (E. coli o V. cholerae). </li><li> Ajuste los tubos de ensayo inoculados en un tambor de rodillo ubicado a 37 ° C de temperatura (ambiente caliente o incubadora), girar en el tambor de rodillos a alta velocidad, y se incuban O / N. </li><li> Preparar un esparcidor de células en la forma de un &quot;palo de hockey&quot; de una varilla de vidrio calentando el medio de la varilla en la llama de un mechero Bunsen hasta que el vidrio se ablanda y después dirigir la curva suavemente con pinzas o alicates en un ángulo de 135 ° . Calentar la varilla una vez más en el punto medio entre el extremo y la primera curva y se dobla en un ángulo de 45 ° hacia el interior (en la dirección opuesta de la primera curva). </li><li> Preparar LB-agar sin antibióticos y se vierte en placas de Petri en la preparación de laprotocolo electrocompetence y LB-agar placas que contienen el antibiótico apropiado (de acuerdo con el marcador de resistencia del vector a por electroporación) y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Preparar un filtro esterilizado 2 mM de CaCl2 solución para V. cholerae, o ddH autoclave de 2 O para E. coli, y se almacena a 4 ° C. </li></ol> 2. El crecimiento de bacterias electrocompetentes (DIA 2, por la mañana) <ol><li> Entregar 100 l de cultivo bacteriano O / N en cada placa de agar LB, stocks de glicerol congelado también se pueden utilizar y entregados directamente en el plato. </li><li> Sumerja el hockey en forma de barra de tamo celular en 100% de EtOH, escurrir brevemente y quemar el resto de EtOH para esterilizarlo antes de su uso y difusión. Difundir el cultivo bacteriano 100 l O / N en forma pareja con el esparcidor celda de vidrio estéril con cuidado de no romper (ruptura) de la superficie del agar. </li><li> Incubar la placa a 37 º C durante 4-6 horas, o hasta que un césped fino del crecimiento bacteriano seaviene distinguibles. Las células son más competentes en crecimiento activo. </li></ol> 3. Preparación de las células electrocompetentes bacterianas (DIA 2, por la tarde) <ol><li> Recoger las bacterias con un asa de inoculación estéril asegurándose de no perforar o romper la superficie del agar. Una masa bacteriana 2 mm de diámetro es suficiente para una sola transformación. Típicamente, esto requiere el raspado de la superficie del césped delgado con el asa de inoculación de dos o tres veces. Varias muestras (normalmente entre 4-6) se podrán recoger en la misma placa. </li><li> Resuspender la masa bacteriana en 1 ml de helado 2 mM CaCl 2 (por V. cholerae) o estéril ddH2O (para E. coli) y mezclar bien hasta que no queden grumos son visibles, mantener en hielo. </li><li> Centrifugar cada suspensión bacteriana durante 5 min a 5.000 xg en una microcentrífuga refrigerada ajustado a 4 ° C, o en una microcentrífuga almacenado en una habitación fría ajustado a 4 º C. </li><li> Desechar el sobrenadante, resuspterminar el sedimento bacteriano en el mismo volumen de helado 2 mM CaCl 2 o estéril ddH2O, y repetir la etapa de centrifugación como se ha hecho antes dos veces más para un total de tres lavados. </li><li> Aspirar el sobrenadante, resuspender, y luego aflojar el sedimento bacteriano a fondo en 40 l helada 2 mM CaCl 2 o estéril ddH2O y mantener en hielo. </li></ol> 4. Transformación de bacterias electrocompetentes (DIA 2, por la tarde) <ol><li> Agregue hasta 1 g de ADN plásmido (en hasta un 1 l de agua o tampón Tris-EDTA) a la suspensión bacteriana 40 ly transferir esta mezcla en un pre-enfriado, estéril cubeta brecha de 0,2 cm. La concentración de sal en la muestra de ADN debe ser bajo una, ya que contribuirá a la formación de arco del pulso en el paso siguiente. </li><li> Inserte la cubeta en la cámara de electroporación del módulo de control de impulsos, y electroporar 1,8 kV, 25 mF. La constante de tiempo debe ser ~ 5,0 mseg, y sin formación de arco debe ocurrir. </li><li> Recuperar rápidamente la suspensión celular mediante resuspensión en 1 ml de caldo LB y transferir en el tubo de ensayo de vidrio de borosilicato previamente esterilizado en autoclave. </li><li> Permitir que las células se recuperan mediante la incubación en condiciones de crecimiento gaseosas (en un tambor de rodillo) a 37 ° C durante 30 min sin selección de antibióticos. </li><li> Placa de las bacterias sobre las placas de agar LB preparados previamente en la presencia del agente selectivo apropiado (antibióticos), y se incuba a 37 ° CO / N. Si las bacterias se transforman con una alta concentración de vector purificado (0,1-1 g de plásmido superenrollado), entregar 10 l de cultivo bacteriano en el borde de la placa de agar LB y con una racha de asa de inoculación estéril para colonias aisladas utilizando el método racha de cuadrante. Si una mezcla de ligación se transformó, entregar 100 l de cultivo bacteriano en cada placa de agar y distribuida uniformemente con el esparcidor celda de vidrio esterilizado. </li></ol> a Si la constante de tiempo es corto (serbaja 3,5 ms), o pulsante conduce a la formación de arco, y luego volver a precipitar la muestra de ADN, se lava con EtOH al 70% dos veces para eliminar las sales antes del secado y resuspensión en tampón TE.

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. 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No hay revelaciones son aplicables.

Eficacia de la transformación está sujeto a una variedad de factores, independientemente del método empleado para preparar células competentes. Las variables análogas se aplican a este método; gran se debe tener cuidado de que una vez que las células se recogen de la placa de agar de tal manera que se mantienen a temperatura fría constante (no superior a 4 ° C). El césped bacteriano debe estar creciendo activamente en el momento de la recogida; células deben estar en mitad de la fase logarítmica de crecimiento. Calidad de ADN (es decir, la contaminación de sales) influye en la eficiencia de transformación. Específicamente, cuando se emplea este método, el agar no debe ser roto como fragmentos de agar en la cubeta causarán la formación de arco del pulso. La mayoría de los problemas encontrados con esta técnica se asocian a dos cuestiones; recoger las bacterias durante la ventana de tiempo apropiado de la placa de agar cuando están creciendo activamente. Su recogida demasiado pronto dará el número de células suficientes y hará que elraspado de la placa de agar LB frustrante porque el &quot;pellicule&quot; que forman es difícil de levantar la superficie de la placa. Recogida de bacterias demasiado tarde disminuirán drásticamente su competencia. La ventana de tiempo, naturalmente, variar dependiendo de la densidad del inóculo se sembraron en las placas de agar LB. El segundo paso crítico es mantener a las bacterias en frío (4 ° C) desde el momento en que se levantan frente a la placa de agar y se resuspendieron en CaCl2 o ddH2O hasta que se sembraron en agar LB siguiente transformación. Los tubos de microcentrífuga que contiene las bacterias, las cubetas y tampón deben ser pre-enfriado y se mantuvieron en hielo en todo momento hasta que se sembraron las bacterias. Sin embargo, pueden surgir problemas adicionales cuando la estéril ddH2O o CaCl2 contienen precipitado o están contaminados. Por este motivo, se recomienda la preparación de este reactivo fresco. Solución de problemas de la transformación se facilita mediante la inclusión de los controles cuando la transformación de bacteria rindió competente por cualquier método. Un control negativo que consiste en un lote de bacterias competentes no transformadas sembradas en placas sobre una placa de agar LB que contiene el marcador selectivo ayudará rápidamente determinar si el antibiótico en la placa es eficaz. Una transformación control positivo con una preparación de plásmido de buena calidad y cantidad que alberga el mismo marcador selectivo que la muestra experimental conocida será útil para determinar si las bacterias son competentes sino también si el ADN experimental transformado era suficiente en cantidad o calidad. Las ventajas de esta técnica son múltiples; el método se puede llevar a cabo en el mismo día en que se prevé una transformación para. Hemos encontrado que los congelados en glicerol bacteriana se puede recubrir directamente sobre el agar LB sin ninguna pérdida en electrocompetence, hemos hecho esto en situaciones de &quot;emergencia&quot; (después de olvidar para iniciar el cultivo de la noche del día anterior). Aunque no hemos podido probar emuy cepa conocida, cualquier E. coli o V. cepa cholerae que se puede transformar por electroporación ha sido susceptible a este protocolo en nuestras manos. La técnica es rápida, eficaz, y produce eficacias de transformación comparables a los obtenidos a partir de la preparación de bacterias electrocompetentes que emplean métodos tradicionales. El método elimina la necesidad de centrífuga de alta velocidad y rotores asociados, un agitador incubador orbital y cubos centrífuga estériles (contenedores), y grandes volúmenes de tampón en autoclave. Aunque la tabla de reactivos y equipos específicos es bastante completo, la mayoría de los laboratorios que llevan a cabo la electroporación tendrán la mayoría, si no todos, de estos materiales ya disponibles. Tal vez lo más importante, la técnica se puede aplicar fácilmente para generar cepas electrocompetent específicos para su laboratorio con antecedentes mutantes rápidamente. No tenemos conocimiento de cualquier limitación de esta técnica, ya que ha sustituido el método tradicional de preparación de eleccionestrocompetent bacterias en nuestros laboratorios. Los resultados de nuestros experimentos que se muestran aquí se llevaron a cabo con células electrocompetentes frescos producidos con el método tradicional que se había almacenado a -80 ° C durante no más de 1 semana. Sin embargo, las existencias congeladas de células electrocompetentes pierden competencia y la viabilidad o durante períodos prolongados de almacenamiento. Nuestro protocolo abreviado válido para la preparación de las células electrocompetentes frescas el mismo día de la transformación está previsto y sin preocupaciones acerca de la edad de la población que puede resultar en un rendimiento transformante disminuido. No hemos intentado almacenar células electrocompetentes producidos mediante el método rápido para su uso en otro día, ya que no ha sido necesario. Aunque no se muestra aquí, la eficiencia de las células electrocompetentes preparó usando nuestro método rápido es suficiente para mezclas de ligación. Las transformaciones se aplicaba la no-O1 V. cholerae en un reciente artículo de Unterweger et al.17 se llevaron a cabo usando bacterias electrocompetentes preparadas por el método descrito aquí (excepto las llevadas a cabo por conjugación). Esta técnica permite a los investigadores a transformar las cepas mutantes antecedentes con rapidez y eficacia sin tener que preparar grandes cantidades de células. Este rápido método de preparación de bacterias electrocompetentes podría adaptarse a otros procariotas que han demostrado ser susceptibles de electroporación como el principio de la preparación y la configuración de electroporación van a ser las mismas que las de los protocolos tradicionales.

Desde su &#39;creación en la década de 1980 1, la electroporación se ha convertido en una técnica de biología molecular integral, probablemente el método más común única empleada para transformar células vivas / transfectar con ácidos nucleicos circulares o lineales. Originalmente desarrollado para la transfección de células eucariotas 1, electroporación se adaptó posteriormente para la transformación de E. coli 2, 3. En la bacteriología, la electroporación se ha convertido en el estándar de laboratorio y se ha modificado para transformar una amplia gama de bacterias Gram-negativas, incluyendo Pseudomonas 4, Salmonella 5, vibriones 6, Serratiae, y Shigella 7; clostridios Gram-positivas 8, 9 Bacilos, Lactobacilos 10 y Enterococos 11. Incluso algunas arqueobacterias han demostrado ser susceptibles a la transformación por electroporación, incluyendo Methanococci </em&gt; 12 y especies Sulfolobus 13. Para una revisión completa consulte Aune y Aachmann 14. Eficiencia de la transformación por electroporación se informa, 10-20 veces superior a la competencia de productos químicos o de choque térmico 2. Sin embargo, al igual que la preparación de las bacterias de la competencia química optimizada por Douglas Hanahan en el 1980 15, las células deben también estar preparado para ser electrocompetent. La electroporación es un medio rápido y eficaz de la transformación bacteriana, lo que requiere bacterias electrocompetentes, ADN purificado, un módulo de control de impulsos que proporciona el impulso eléctrico, y una cámara que se adapta a las pequeñas cubetas desechables que funcionan como un electrodo. Brevemente, las bacterias competentes frías, se mezclan con el ADN plásmido, se somete a un pulso de alto voltaje en una cubeta, se resuspendieron en medio de crecimiento, se incubaron a 30-37 ° C durante 30-45 minutos, y luego sembraron en placas de medio semisólido (agar nutritivo placas) con el aproxopriate antibiótico selectivo. En contraste con la etapa de pulsación, la preparación de electrocompetentes E. coli sigue siendo un procedimiento de varias partes que se lleva a cabo tradicionalmente en grandes volúmenes. Brevemente, un cultivo de una noche de bacterias se inoculó en un matraz Erlenmeyer con 100 ml a 1 L de caldo de Luria (LB), que se cultiva a mediados de la fase logarítmica de crecimiento (DO 600 de &lt;1,0), y se sometieron a lavados en serie con un no estéril iónico tampón o agua doblemente destilada (ddH2O) en la disminución de los volúmenes a 4 ° C. Gran se debe tener cuidado para mantener las células en frío durante todo el procedimiento y evitar la contaminación. Esto requiere el uso de cubos de centrifugación en autoclave y tampones no iónicos o ddH2O, una incubadora agitador orbital, una de alta velocidad centrífuga refrigerada de gran capacidad y un conjunto de rotores. Las bacterias se resuspendieron finalmente en un pequeño volumen de tampón suplementado con 10% de glicerol y alícuotas en ~ 40 volúmenes mu l, WHICH se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Almacenamiento a baja temperatura da lugar a menudo en las eficacias de transformación disminuido debido a la pérdida de viabilidad en el tiempo. Células bacterianas electrocompetentes también están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, pero sólo para un número limitado de (a menudo recombinación deficiente) E. cepas de E. coli emplean comúnmente como anfitriones para propagar una amplia gama de plásmidos. Como resultado de ello los investigadores se basan en métodos internos para preparar sus propias cepas / mutantes para la transformación. Una alternativa, protocolo rápido y eficiente para la preparación de electrocompetentes E. coli ha estado en uso por algunos laboratorios de bacteriología molecular desde hace algún tiempo y se ha extendido a las bacterias Gram-negativas adicionales, en nuestro caso V. cholerae. El originador del protocolo no puede ser identificado como se ha optimizado por otros investigadores en el tiempo. El método que aquí se presenta ha sido utilizado en nuestro laboratorio ins de casi dos décadas, y nuestra meta es compartir este protocolo útil con nuestros pares.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

La electroporación se ha convertido en un método ampliamente utilizado para la rápida y eficiente la introducción de ADN extraño en una amplia gama de células. Electrotransformación ha convertido en el método de elección para la introducción de ADN en procariotas que no son naturalmente competente. La electroporación es un método de transformación rápida, eficiente, y optimizada que, además de ADN purificado y bacterias competentes, requiere disponibles comercialmente controlador de pulso gen y cubetas. En contraste con la etapa de pulsación, la preparación de células electrocompetentes es mucho tiempo y mano de obra intensiva que implica repetidas rondas de centrifugación y lavados en la disminución de los volúmenes de agua fría y estéril, o tampones no iónicos de grandes volúmenes de cultivos desarrollados a mediados de la fase logarítmica de crecimiento. Tiempo y esfuerzo se pueden ahorrar mediante la compra de las células electrocompetentes de fuentes comerciales, pero la selección se limita a empleados comúnmente E. cepas de laboratorio coli. Presentamos por medio de difusión de un rápido ymétodo eficiente para la preparación de electrocompetentes E. coli, que ha estado en uso por los laboratorios de bacteriología desde hace algún tiempo, se puede adaptar a V. cholerae y otros procariotas. Si bien no podemos determinar quien al crédito para el desarrollo de la técnica original, se nos presente, poniéndolo a disposición de la comunidad científica.

Hemos llevado a cabo una serie de transformaciones con E. coli y V. cholerae para comparar la eficiencia de transformación de nuestra metodología rápida con una adaptación del método (tradicional) originalmente descrito por Dower et al. 2 para la preparación de bacterias electrocompetentes. Para llevar a cabo la preparación tradicional de las células competentes, 500 ml de LB en un matraz Erlenmeyer de 2 L-se inocularon con 500 l cultivo de una noche de E. coli DH5a o V. cholerae O395, se incubaron en un agitador orbital (215 rpm a 37 ° C) y se recogieron a una DO de 600 de entre 0,5-1,0. El matraz se enfrió en hielo y los cultivos se centrifugó en un rotor enfriado previamente a 4.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Los sedimentos celulares se resuspendieron cuidadosamente en 500 ml de hielo frío-2 mM CaCl 2 para V. cholerae y ddH2O para E. coli, y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones. Rondas posteriores de una resuspensiónd centrifugación se llevaron a cabo en la disminución de los volúmenes de 200 y 100 ml volúmenes asegurándose de que la cultura se mantuvo refrigerada a 4 ° C. Por último, una resuspensión y centrifugación en un volumen de 10 ml se llevó a cabo con 10% de glicerol. El sedimento final se resuspendió en 2 ml de 10% de glicerol y 40 ml de alícuotas se congelaron a -80 ° C y ya no se almacena de una semana antes de la electroporación. Las condiciones de electroporación incluida la configuración de impulsos y el tamaño de la cubeta fueron idénticas para ambas especies bacterianas en todas las electroporaciones independientemente del método de preparación de células competentes. La única diferencia fue que se llevó a cabo los lavados en frío ddH 2 O de E. coli y frío mM CaCl 2 para V. 2 . cholerae Tabla 1 muestra los resultados de bacterias transformadas por electroporación idénticamente pero se hacen competentes ya sea con el protocolo rápido o con el método tradicional. Empleamos O395 cepa DH5a y tan comúnutilizados Ly, cepas representativas de V. cholerae y E. coli, respectivamente; resultados similares se pueden obtener con otras cepas de la misma especie (aunque no todos de una sola cepa ha sido probado) y es probable que adaptarse a otras bacterias Gram-negativas y probablemente más allá. Para asegurar que el número de células iguales estaban presentes en cada lote pulsada, bacterias electrocompetentes generados utilizando el método rápido se agruparon en el ordeño, mezclan, mantienen suspendidas homogéneamente, y tomaron alícuotas en 40 volúmenes mu l, poco antes de la electroporación. Bacterias Electrocompetent generadas utilizan el método tradicional fueron tratados de manera similar antes de la congelación en 40 ml de alícuotas. Después de la entrega del pulso, cada lote de 40 l de bacterias por electroporación se suspendió en 400 l de LB y se diluyeron en serie 1:10. Cien microlitros de cada dilución se colocaron en placas en agar LB en presencia de 100 mg / ml de ampicilina y se extendió usando un esparcidor de vidrio estéril de célulasy se incubaron a 37 ° C durante la noche. Para cuantificar el número total de bacterias empleadas en cada transformación, 40 volúmenes mu l de bacterias electrocompetentes de cada lote preparado se diluyeron en serie, y se sembraron en agar LB sin antibióticos de forma idéntica en paralelo. Una alícuota de bacterias tratadas igualmente de cada lote se sometió a electroporación con 1 l de Tris-EDTA (TE) tampón pero sin ADN (transformación simulacro), diluido en serie y se sembraron en agar LB sin antibióticos para estimar el número de células perdidas por la entrega de la pulso eléctrico. Por último, una variación adicional para el experimento se llevó a cabo para determinar si los 30 min incubaciones a 37 ° C en 1 ml de LB después de la electroporación, pero antes de placas en LB-agar afectarían a la recuperación de las células transformadas. unidades formadoras de colonias (UFC) se enumeraron al día siguiente. Para este experimento se emplearon pUC18, un plásmido de laboratorio común, y lotes de bacterias competentes que consiste de unproximadamente 10 8 UFC de células preparan utilizando el método tradicional y 10 7 UFC de células preparadas utilizando el protocolo rápido. La electroporación solo (sin ADN) redujo las UFC viables por 10-100 veces independientemente del método utilizado para preparar las células electrocompetentes. Como se muestra en la Tabla 1, el rendimiento transformante era dentro de la 10 6 -10 7 UFC / g de gama ADN en tres experimentos duplicados (desviaciones estándar entre paréntesis) para E. coli (DH5a) y V. cholerae (O395), respectivamente, utilizando el método tradicional, más largo para la preparación de células electrocompetentes. Rendimiento transformante apareció disminuido 10 veces a 10 5 -10 6 UFC / g de ADN en tres experimentos duplicados (desviación estándar entre paréntesis) para E. coli y V. cholerae, respectivamente, utilizando el método rápido. Por esta razón se determinó el porcentaje de bacterias transformadas dividiendo UFC transformadaspor el número de CFUs se recuperó de &quot;transformaciones simulacros&quot; (sin plásmido) de lotes de otro modo idénticas de células competentes. El porcentaje de bacterias transformadas se encontraba dentro de un registro (02.05 a 09.04%), independientemente del método de preparación y las especies transformadas (Tabla 1 Los números entre corchetes). Estos resultados sugieren que la eficacia del método rápido es comparable a la del procedimiento tradicional más largo de la preparación de células competentes y que las cepas representativas de Vibrio cholerae y Escherichia coli son igualmente susceptibles al procedimiento rápido. Se encontró que la eficiencia de transformación, para los plásmidos pUC18 como portadores de casetes β-lactamasa, no se ve afectado por el tiempo de recuperación de 30 minutos en caldo LB. El mismo número de transformantes fue recuperado si las células se colocaron en placas de agar LB que en presencia de ampicilina directamente, después de la electroporación, o si se les permitió un tiempo de recuperación de 30-45 minen caldo LB a 37 ° C antes de chapado. Nuestros resultados que resistencia a la ampicilina no requiere derivación en condiciones no selectivas sugiere que la expresión de β-lactamasa se ​​produce con suficiente rapidez después de la transformación. Sin embargo, cabe señalar que hemos llevado a cabo diluciones en serie de bacterias de impulsos en caldo LB, que puede haber contribuido a la recuperación de la descarga eléctrica e iniciar la expresión génica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figura 1. Representación gráfica de la metodología para la preparación rápida de bacterias electrocompetentes. Después de 4-6 horas (dependiendo de la densidad de los inóculos) un número suficiente de bacterias se pueden recoger para llevar a cabo cinco y cincuenta y seis transformaciones de una sola placa de agar LB. Para asegurar igual número de células competentes para cada volumen final que se electroporación, las bacterias recogidas de la placa de agar LB se agruparon inicialmente juntos y se lavaron a continuación coliquoted en 40 volúmenes mu l, dependiendo del tamaño de la pastilla (gránulos más grandes se diluyeron en volúmenes más grandes divisibles por 40 l). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Número de ADN transformantes / mg resistentes a la ampicilina (transformantes resistentes a la ampicilina se recuperaron [%]) </td></tr><tr><td> Tensión </td><td> Método tradicional </td><td> Método rápido </td></tr><tr><td> De E. coli (DH5a) </td><td> 2.3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9.4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2.5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6.7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3.3%] </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Eficacia de la transformación por microgramo de ADN (pUC18) de electrocompetentes Bacteria preparado por el método tradicional en comparación con el método rápido. Todas las transformaciones se llevaron a cabo con 500 ng de DNA de pUC18 (~ ADN superenrollado 80% como se visualiza por electroforesis en gel de 1% de agarosa) y las células sometidas a electroporación se diluyeron en serie de 10 veces en caldo LB antes de chapado de UFC en LB-agar con antibióticos. Controles de bacterias no electroporación y de bacterias por electroporación sin plásmido, se diluyeron en serie y se sembraron en agar LB sin antibióticos se llevaron a cabo para cada conjunto de transformaciones para determinar el número total de bacterias viables antes y después del pulso. Los controles electroporadas representadas la línea de base para el porcentaje de bacterias viables transformados con éxito.

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

La electroporación es un método comúnmente empleado para introducir el ADN en las bacterias en un proceso conocido como transformación. Los protocolos tradicionales para la preparación de células electrocompetentes son mucho tiempo y mano de obra intensiva. Este artículo describe un suplente, rápida, y eficiente método para la preparación de células electrocompetentes actualmente empleados por algunos laboratorios.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.2K vistas.  University of Texas Brownsville.  La electroporación es un método comúnmente empleado para introducir el ADN en las bacterias en un proceso conocido como transformación. Los protocolos tradicionales para la preparación de células electrocompetentes son mucho tiempo y mano de obra intensiva. Este artículo describe un suplente, rápida, y eficiente método para la preparación de células electrocompetentes actualmente empleados por algunos laboratorios. 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organismo modelo para estudiar la patogénesis bacteriana - Entrevista

Investigación

Biología

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Los protocolos para la implementación de un<em&gt; Escherichia coli</emSistema&gt; Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

La detección de vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...