המחברים מודים לעמיתיו ואנשי צוות של מעבדות בהווה ובעבר שתמכו בפיתוח טכניקה זו שלהם. המעבדה של SP נתמך על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות ההפעלה גרנט MOP-84,473 ופתרונות אלברטה מתפתחת-בריאות (ממומנים על ידי הקרן למורשת אלברטה למחקר רפואית קרן קרן). DP של נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה MD001091-01 וGM068855-02.

1. הכנת תרבויות חיידקים, כלים, וריאגנטים (יום 1, אחה&quot;צ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתי אחר הצהריים המאוחרים, לחסן 1-5 מיליליטר מרק autoclaved LB בסטרילית (לדוגמא, 100 x 13 מ&quot;מ) מבחנות זכוכית בורוסיליקט עם aliquot קטן של חיידקים (חיידק או V. cholerae). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המבחנות מחוסנת בתוף גלגלת שוכנו ב37 ° C טמפרטורה (חדר חם או חממה), הפעל את תוף ההרים במהירות גבוהה, ודגירת O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מפזר תא בצורה של &quot;מקל הוקי&quot; ממוט זכוכית על ידי חימום אמצע המוט בלהבה של מבער בונזן עד הזכוכית מתרככת ואז לכוון את העיקול בעדינות עם פינצטה או פלייר לזווית 135 ° . מחממים את המוט פעם נוספת בנקודת האמצע שבין תום והעיקול הראשון ולכופף אותו בזווית של ° 45 פנימה (בכיוון ההפוך של העיקול הראשון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LB-אגר ללא אנטיביוטיקה ולשפוך לתוך צלחות פטרי בהכנהצלחות פרוטוקול electrocompetence, וLB-אגר המכילות האנטיביוטיקה המתאימה (לפי סמן ההתנגדות על הווקטור להיות electroporated), ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המסנן מעוקר 2 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון לV. cholerae, או DDH החיטוי 2 O לE. coli, ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 2. צמיחה של חיידקי Electrocompetent (DAY 2, בוקר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק של תרבות חיידקי O / N 100 μl על כל צלחת אגר LB, מניות גליצרול קפוא יכולות גם להיות מנוצלים ובאופן ישיר נמסרו לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את מפזר תא בצורת מקל הוקי ב100% EtOH, לנקז בקצרה ולשרוף EtOH שנותר כדי לעקר אותו לפני השימוש ולהתפשט. להפיץ את תרבות חיידקי 100 O μl / N באופן שווה עם מפזר תא זכוכית סטרילית כדי לוודא שלא לשבש את המשטח אגר (הפסקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות, או עד שדשא דק של התפתחות חיידקים להיותמגיע להבחנה. תאים הם מוכשרים ביותר כאשר גדל באופן פעיל. </li></ol> 3. הכנת תאי Electrocompetent בקטריאלי (DAY 2, אחה&quot;צ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את החיידקים עם לולאת inoculating סטרילי כדי לוודא שלא לנקב או לשבור את פני השטח של אגר. מסת חיידקי 2 מ&quot;מ קוטר אחת מספיקה לשינוי אחד. בדרך כלל, זה דורש מגרד את פני השטח של הדשא הדק עם inoculating לולאת שתיים או שלוש פעמים. כמה דוגמאות (בדרך כלל בין 4-6) ניתן לגבות מאותה הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המוני החיידקים ב1 מיליליטר קר כקרח 2 מ&quot;מ CaCl 2 (לV. cholerae) או סטרילי DDH 2 O (לE. coli) ומערבבים היטב עד שאין גושים גלויים, לשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל השעיה חיידקים במשך 5 דקות ב XG 5,000 בmicrocentrifuge קירור מוגדר 4 ° C, או בmicrocentrifuge מאוחסנים בחדר קר מוגדר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspבסופו של גלולה החיידקים באותו הנפח של קר כקרח 2 מ&quot;מ CaCl 2 או סטרילי DDH 2 O, וחזור על צעד צנטריפוגה כפי שנעשה לפני עוד פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, resuspend, ולאחר מכן לשחרר את הכדור בקטריאלי ביסודיות ב40 קרח קר μl 2 מ&quot;מ CaCl 2 או סטרילי DDH 2 O ולשמור על קרח. </li></ol> 4. טרנספורמציה של חיידקי Electrocompetent (DAY 2, אחה&quot;צ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עד 1 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (במי μl עד 1 או חיץ טריס-EDTA) להשעית חיידקי 40 μl ולהעביר את התערובת לתוך קובט טרום צונן, סטרילית פער 0.2 סנטימטר. ריכוז המלח בדגימת DNA חייב להיות נמוך, כפי שהוא יתרום לקשתי של הדופק בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט לתוך תא electroporation של מודול בקרת דופק, וelectroporate ב1.8 KV, 25 μF. קבוע הזמן צריך להיות ~ 5.0 אלפיות שני, ולא קשתיים צריכים להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשחזר את ההשעיה התא על ידי resuspending לתוך 1 מיליליטר מרק LB ולהעביר לתוך מבחנת זכוכית ורוסיליקט autoclaved בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להתאושש על ידי דוגרים בתנאי צמיחת סודה (בתוף גלגלת) על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ללא בחירה אנטיביוטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט החיידקים על גבי הצלחות אגר LB הכינו בעבר בנוכחות הסוכן המתאים סלקטיבית (אנטיביוטיקה), ולדגור על 37 מעלות CO / נ אם חיידקים הופכים עם ריכוז גבוה של וקטור מטוהר (0.1-1 מיקרוגרם פלסמיד supercoiled), לספק 10 μl של תרבות חיידקים על קצה הצלחת אגר LB ועם פס inoculating לולאת סטרילי למושבות מבודדות בשיטת הפס ברבע. אם תערובת קשירה הפכה, לספק של תרבות חיידקים 100 μl על כל צלחת אגר ולהתפשט באופן שווה את זה עם מפזר תא זכוכית המעוקרת. </li></ol> אם קבוע הזמן קצר (להיות3.5 msec נמוכים), או פועם מוביל קשתי, ואז שוב לזרז את דגימת DNA, לשטוף עם EtOH 70% פעמיים כדי להסיר מלחים לפני הייבוש וresuspending במאגר TE.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

אין גילויים חלים.

יעילות שינוי כפופה למגוון גורמים ללא קשר לשיטה המועסק על מנת להכין את התאים המוסמכים. משתנים מקבילים חל על שיטה זו; זהירות רבה יש לנקוט שברגע שהתאים נקצרים מהצלחת אגר כזה שהם נשמרים בטמפרטורה קבועה קרה (שלא יעלה על 4 מעלות צלזיוס). דשא החיידקים חייב להיות פעיל גדל בזמן האיסוף; תאים חייבים להיות בשלב אמצע לוגריתמים של צמיחה. איכות של ה-DNA (כלומר זיהום של מלחים) משפיעה על יעילות שינוי. באופן ספציפי, כאשר בשיטה זו, אגר לא צריך להיות שבור שברים אגר בקובט יגרמו קשתי של הדופק. רוב הבעיות נתקלו עם טכניקה זו קשורות עם שני נושאים; איסוף החיידקים במהלך החלון הנכון של זמן מהצלחת אגר כאשר הם גדלים באופן פעיל. לאסוף אותם מוקדם מדי יניבו מספרים סלולריים מספיקים ויעבדמגרד את הצלחת אגר LB מתסכל כי &quot;pellicule&quot; הם יוצרים קשה להרים את פני השטח של הצלחת. חיידקי איסוף מאוחר מדי יקטינו את היכולת שלהם באופן דרמטי. החלון של הזמן באופן טבעי משתנה בהתאם לצפיפות של הבידוד מצופה על הצלחות אגר LB. השלב הקריטי השני הוא לשמור על החיידקים קרים (4 מעלות צלזיוס) מהרגע שהם הרימו את הצלחת אגר וresuspended בCaCl 2 או DDH 2 O עד שהם מצופים על אגר LB הבא טרנספורמציה. צינורות microfuge המכילים חיידקים, cuvettes וחיץ צריכים להיות טרום צוננים ושמרו על קרח בכל העת עד לחיידקים הם מצופים. עם זאת, בעיות נוספות יכולות להתעורר כאשר סטרילי DDH 2 O או CaCl 2 יכיל משקע או מזוהם. מסיבה זו אנו ממליצים להכין טריים מגיב זה. שינוי פתרון בעיות הוא הקל על ידי לרבות בקרות כאשר הפיכת bacteria שניתנו מוסמך בכל דרך. ביקורת שלילית בהיקף של קבוצה של חיידקים שאינם המוסמכים הפכו מצופים על צלחת אגר LB המכילה את הסמן סלקטיבית תהיה במהירות לעזור לקבוע אם האנטיביוטיקה על הצלחת היא יעילה. שינוי שליטה חיובי עם הכנת פלסמיד ידועה באיכות טובה ובכמות חסה באותו סמן סלקטיבית כמדגם הניסיוני יהיה מועיל בקביעה האם החיידקים הם מוכשרים, אלא גם אם ה-DNA ניסיוני הפכה די הייתה בכמות או באיכות. היתרונות של שיטה זו הם מרובים; השיטה יכולה להתבצע באותו היום שבו שינוי מתוכנן. מצאנו כי מניית גליצרול חיידקים קפואה עשויה להיות מצופה ישירות על אגר LB בלי לפגוע בelectrocompetence, יש לנו עשיתי את זה במצבים &quot;חירום&quot; (לאחר שוכח להתחיל תרבות הלילה ביום שלפני). למרות שאנחנו לא יכולים לבדוק את הדוארמאוד מתח ידוע, כל E. coli או V. זן cholerae שניתן להפוך על ידי electroporation היה מקובל בפרוטוקול זה בידיים שלנו. הטכניקה היא מהירה, יעילה, ויעילות הפיכת תשואות דומה לאלה המתקבלים מהכנת חיידקי electrocompetent בשיטות מסורתיות. השיטה מבטלת את הדרישה לצנטריפוגה במהירות גבוהה והרוטורים קשורים, שייקר אינקובטור מסלולית ודליי סטרילי צנטריפוגות (מכולות), וכמויות גדולות של חיץ autoclaved. למרות שהטבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים היא מקיפה למדי, רוב מעבדות המבצעות electroporation תהיה רוב, אם לא כולם, של חומרים אלה כבר זמינים. ואולי הכי חשוב, הטכניקה יכולה להיות מיושמת בקלות כדי ליצור זני מעבדה ספציפית electrocompetent עם רקע מוטציה במהירות. אנו מודעים לכל מגבלות של טכניקה זו כפי שהוא החליף את השיטה המסורתית של הכנת electrocompetent חיידקים במעבדות שלנו. התוצאות של הניסויים שלנו הראו כאן בוצעו בתאי electrocompetent טריים המיוצרים בשיטה המסורתית שאוחסנה ב-80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 שבוע. עם זאת, מניות תא electrocompetent קפוא מאבדות יכולת ואו יכולת קיום לאורך תקופות ממושכות של שטח האחסון. הפרוטוקול המקוצר שלנו מאפשר ההכנה של תאי electrocompetent טריים באותו היום את השינוי מתוכנן חששות לגבי גיל של המניה אשר עלול לגרום לתשואת transformant ירדה בלי. אנחנו לא ניסינו אחסון תאי electrocompetent הופקו באמצעות השיטה המהירה לשימוש ביום אחר כמו זה לא היה נחוץ. אמנם לא מוצג כאן, את היעילות של תאי electrocompetent הוכנה באמצעות השיטה המהירה שלנו היא מספיק לתערובות קשירה. התמורות שדווחו לאינו O1 V. cholerae במאמר שפורסם לאחרונה על ידי Unterweger et al.17 בוצעו באמצעות חיידקי electrocompetent שהוכנו על ידי השיטה המתוארת כאן (פרט לאלה שבוצעו על ידי נטיה). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להפוך את הזנים בעלי רקע מוטציה במהירות וביעילות ללא צורך להכין קבוצות גדולות של תאים. הכנה מהירה זה של שיטת חיידקי electrocompetent יכולה להיות מותאמת לפרוקריוטים אחרים שהוכחו להיות מקובל electroporation כעיקרון של הכנה והגדרות electroporation הולכים להיות זהה לאלה של פרוטוקולים מסורתיים.

מאז הקמתה &quot;בתחילת 1980s 1, electroporation הפך טכניקת ביולוגיה מולקולרית נפרד, סביר להניח שהשיטה הנפוצה ביותר המועסק כדי להפוך / תאי חי transfect עם חומצות גרעין עגולות או ליניארית. פותח במקור עבור transfection של תאי אוקריוטים 1, electroporation הותאם לאחר מכן להפיכתה של א &#39; coli 2, 3. בבקטריולוגיה, electroporation הפך לסטנדרט במעבדה ושונתה כדי להפוך מגוון רחב של חיידקים, כולל 4 Pseudomonas גראם השלילי, Salmonellae 5, Vibrios 6, Serratiae, ו7 Shigellae; Clostridia גראם החיובי 8, 9 חיידקים, לקטובצילוס 10 ו11 Enterococci. אפילו כמה Archaebacteria הוכיחו ניתן לשינוי על ידי electroporation, כולל Methanococci </em&gt; 12 וSulfolobus מינים 13. לסקירה מקיפה עיין און ו14 Aachmann. יעילות של שינוי על ידי electroporation היא מדווח 10-20 גבוהה פי יותר מיכולות כימיות או חום הלם 2. עם זאת, בדומה להכנת חיידקים ליכולת כימית כמותאמים על ידי דאגלס Hanahan ב1980s 15, תאים חייבים גם להיות מוכנים להיות electrocompetent. Electroporation הוא אמצעי מהיר ויעיל של שינוי בקטריאלי, הדורש חיידקי electrocompetent, ה-DNA מטוהר, מודול בקרת דופק, המספק את הדחף החשמלי, וחדר שיכול להכיל cuvettes חד פעמי הקטן המתפקדים כהאלקטרודה. בקצרה, חיידקים קרים, מוכשרים מעורבבים עם פלסמיד דנ&quot;א, נתון לדופק מתח גבוה בקובט, resuspended בתקשורת צמיחה, טופח על C ° 30-37 ל30-45 דקות, ולאחר מכן מצופה במדיום מוצק למחצה (אגר מזין צלחות) עם appropriate אנטיביוטיקה סלקטיבית. בניגוד לשלב הפועם, הכנת א electrocompetent coli נותר הליך מרובה המתבצע באופן מסורתי בכמויות גדולות. בקצרה, תרבות לילה של חיידקים היא מחוסנת לתוך בקבוק Erlenmeyer עם עד 1 ליטר מרק לוריא (LB) 100 מיליליטר, גדל שלב אמצע לוגריתמים של צמיחה (OD של 600 &lt;1.0), והוא נתון לשטיפות סדרו עם שאינו סטריליים יוני חיץ או מים מזוקקי פעמיים (DDH 2 O) בהפחתת כרכים ב 4 ° C. יש לנקוט בזהירות רבה כדי לשמור על התאים קרים לאורך ההליך כולו ולמנוע זיהום. זה דורש שימוש בדליי autoclaved צנטריפוגה ומאגרים לא יוניים או 2 DDH O, חממה ייקר מסלולית, צנטריפוגה במהירות גבוהה נפח גדול בקירור ומערכת של הרוטורים. חיידקי סופו של דבר הם resuspended בנפח קטן של חיץ בתוספת גליצרול 10% וaliquoted לתוך ~ כרכי μl 40, WHich מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אחסון בטמפרטורה נמוכה לעתים קרובות תוצאות ביעילות טרנספורמציה ירד בשל אובדן יכולת הקיום לאורך זמן. תאי חיידקיים Electrocompetent גם זמינים ממגוון רחב של מקורות מסחריים אבל רק למספר מוגבל של (לעתים קרובות רקומבינציה הלקויה) E. זני coli מועסקים בכינויו מארחים להפיץ מגוון רחב של פלסמידים. כתוצאה מכך חוקרים להסתמך על שיטות בבית כדי להכין הזנים / מוטציות שלהם לשינוי. חלופי פרוטוקול, מהיר ויעיל להכנת ה electrocompetent coli כבר בשימוש על ידי כמה מעבדות בקטריולוגיה מולקולריות כבר כמה זמן והורחב לחיידקים גראם שלילית נוספים, במקרה שלנו V. cholerae. היוזם של הפרוטוקול אינו יכול להיות מזוהה כפי שהוא כבר מותאם על ידי חוקרים אחרים לאורך זמן. השיטה המוצגת כאן נעשתה שימוש בLaboratories במשך כמעט שני עשורים, וזה המטרה שלנו הוא לשתף את הפרוטוקול הזה שימושי עם בני גילנו.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Module</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes </td><td>Corning</td><td>70820-13</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Culture Tube Closures </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x 250 mm Glass Rod</td><td>Lab Source</td><td>11381D</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Roller Drum Motor Assembly</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Chemicals</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous/denatured</td><td>Sigma Chemicals</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating Loop</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Electroporation הפך שיטה בשימוש נרחבת עבור מהירות וביעילות החדרת דנ&quot;א זר לתוך מגוון רחב של תאים. Electrotransformation הפך את שיטת הבחירה להחדרת DNA לפרוקריוטים שאינם באופן טבעי מוכשרים. Electroporation הוא שיטת שינוי מהירה, יעילה, ויעיל שבנוסף ל-DNA מטוהר וחיידקים המוסמכים, דורשת בקר זמין מסחרי גן הדופק וcuvettes. בניגוד לשלב הפועם, הכנת תאי electrocompetent היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית כרוכים בסבבים חוזרים ונשנים של צנטריפוגה ושוטף בהפחתת כמויות של מים סטריליים, קרים, או מאגרים לא יוניים של כמויות גדולות של תרבויות גדלו שלב אמצע לוגריתמים של צמיחה. זמן ומאמץ ניתן לשמור על ידי רכישת תאי electrocompetent ממקורות מסחריים, אבל את הבחירה מוגבלת למועסקים בדרך כלל E. זני מעבדה coli. אנחנו הפצה מהירה בזאת ושיטה יעילה להכנת ה electrocompetent coli, אשר כבר בשימוש על ידי מעבדות בקטריולוגיה במשך זמן מה, יכול להיות מותאם לV. cholerae ופרוקריוטים אחרים. למרות שאנו לא יכולים לקבוע למי קרדיט על פיתוח הטכניקה המקורית, אנחנו עושים את זה לרשות הקהילה המדעית בזאת.

בצענו סדרה של תמורות עם א &#39; coli ו V. cholerae כדי להשוות את יעילות הפיכתה של מתודולוגיה המהירה שלנו עם עיבוד של השיטה (המסורתית) שתוארה במקור על ידי דוואר et al. 2 להכנת חיידקי electrocompetent. כדי לבצע את ההכנה המסורתית של תאים המוסמכים, 500 מיליליטר LB בבקבוק L-Erlenmeyer 2 היו מחוסן עם תרבות לילה 500 μl של E. coli DH5α או V. cholerae O395, מודגרות בייקר מסלולית (215 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס) ונקטף בOD 600 של בין 0.5-1.0. הבקבוק קורר על קרח והתרבויות centrifuged ברוטור טרום צונן ב4,000 XG 10 דקות ב 4 ° C. כדורי התא היו מושעים באופן יסודי ב500 מיליליטר קר כקרח 2 מ&quot;מ CaCl 2 לV. 2 O cholerae וDDH לE. coli, וcentrifuged שוב באותם תנאים. הסבבים הבאים של resuspensionצנטריפוגה ד בוצעה בהפחתת כרכים של 200 ו100 מיליליטר כרכים לוודא התרבות נשארה צוננת ב 4 ° C. לבסוף, resuspension וצנטריפוגה ב10 מיליליטר נפח בוצעו עם גליצרול 10%. גלולה הסופית resuspended ב 2 מיליליטר גליצרול 10% ו40 aliquots μl הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס ומאוחסנים לא יותר משבוע לפני electroporation אחד. תנאי electroporation כוללים הגדרות דופק וגודל קובט היו זהים לשני מיני החיידקים בכל electroporations ללא קשר לשיטת הכנה של תאים המוסמכים. ההבדל היחיד היה שבצענו את שטיפות ב DDH 2 O הקר לE. coli וקר 2 מ&quot;מ CaCl 2 לV. cholerae. טבלת 1 מראה תוצאות של חיידקים הפכו על ידי electroporation זהה אך שניתנו מוסמך או עם הפרוטוקול המהיר או בשיטה המסורתית. אנחנו עובדים O395 המתח וDH5α כנפוץמשמשים ly זנים, נציג של V. cholerae וא coli בהתאמה; ניתן להשיג תוצאות דומות עם זנים אחרים מאותו המין (אם כי לא כל זן נבדק) וסביר להניח שמותאמת לחיידקים גראם שלילית אחרים וכנראה מעבר לה. כדי להבטיח שמספרים סלולריים שווים נכחו בכל אצווה פעמה, חיידקי electrocompetent שנוצרו תוך ניצול השיטה המהירה היו נקווים על בסיס הגבייה, מעורב, המשיכו מושעה homogenously, וaliquoted בכרכי μl 40 זמן קצר לפני electroporation. חיידקי Electrocompetent שנוצרו תוך ניצול השיטה המסורתית טופלו באופן דומה לפני ההקפאה ב40 aliquots μl. בעקבות מסירה של הדופק, כל אצווה של 40 μl חיידקי electroporated הושעה ל400 μl LB ומדולל 1:10 סדרתי. מאה מיקרוליטר של דילול כל היו מצופה על אגר LB בנוכחות 100 אמפיצילין מיקרוגרם / מיליליטר ולהפיץ באמצעות מפזר תא זכוכית סטריליתוטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לכמת את המספר הכולל של חיידקים המועסקים בכל שינוי, 40 כרכי μl של חיידקי electrocompetent של כל מנה מוכנה היו בדילול סדרתי, ומצופים על אגר LB ללא אנטיביוטיקה באופן זהה במקביל. aliquot אחד מחיידקים שטופלו באופן שווה מכל אצווה היה electroporated עם 1 μl טריס-EDTA (TE) חיץ אך ללא DNA (שינוי מדומה), באופן סדרתי בדילול מלא ומצופה על אגר LB ללא אנטיביוטיקה כדי לאמוד את מספר התאים שאבדו במשלוח של דופק חשמלי. לבסוף, וריאציה נוספת אחד לניסוי בוצעה כדי לקבוע אם 30 incubations דקות על 37 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר LB לאחר electroporation אבל לפני ציפוי על LB-אגר ישפיע על ההתאוששות של תאים מותמרים. יחידות מושבה להרכיב (CFUs) נפקדו ביום הבא. לצורך ניסוי זה אנו מועסקים pUC18, פלסמיד מעבדה משותף, וקבוצות של חיידקים המוסמכים בהיקף שלpproximately 10 8 CFUs לתאים שהוכן תוך ניצול השיטה המסורתית ו10 7 CFUs לתאים שהוכנו על ניצול הפרוטוקול המהיר. Electroporation לבד (בלי ה-DNA) מופחת CFUs קיימא על ידי 10-100 לקפל ללא קשר לשיטה המשמשת להכנת תאי electrocompetent. כפי שניתן לראות בטבלה 1, תשואת transformant הייתה בתוך 10 6 -10 7 CFUs / מיקרוגרם של טווח ה-DNA בשלושה ניסויים לשכפל (סטיות תקן בסוגריים) לE. coli (DH5α) וV. כולרה (O395) בהתאמה תוך שימוש בשיטה המסורתית, ארוכה יותר להכנת תא electrocompetent. תשואת Transformant הופיעה ירד 10 קיפול ל10 5 -10 6 CFUs / מיקרוגרם של ה-DNA בשלושה ניסויים לשכפל (סטיית תקן בסוגריים) לE. coli ו V. cholerae בהתאמה תוך שימוש בשיטה המהירה. מסיבה זו אנו קובעים את אחוז החיידקים הפכו על ידי חלוקת CFUs הפךבמספר CFUs התאושש מ&quot; תמורות מדומה &quot;(ללא פלסמיד) מקבוצות אחרות זהות של תאים המוסמכים. אחוז של חיידקים שינו היה בתוך יומן אחד (2.5-9.4%) ללא קשר לשיטה של הכנה ומינים הפכו (טבלת 1 מספרים בסוגריים). תוצאות אלו מצביעות על כך שהיעילות של השיטה המהירה היא דומה לזו של ההליך הממושך המסורתי של הכנת תאים המוסמכים וכי זני הנציג של Vibrio cholerae וEscherichia coli הם לא פחות קביל על ההליך המהיר. מצאנו כי יעילות שינוי, לפלסמידים כמו pUC18 מחסה קלטות β-lactamase, אינו מושפע מזמן התאוששות 30 דקות במרק LB. אותו מספר transformants היה התאושש אם התאים היו מצופים לאגרו LB בנוכחות אמפיצילין ישירות, לאחר electroporation, ובין אם הם הורשו זמן התאוששות 30-45 דקותבמרק LB על 37 מעלות צלזיוס לפני ציפוי. הממצאים שלנו שאמפיצילין התנגדות אינה דורשת תוצאה בתנאים לא סלקטיבי עולה כי ביטוי β-lactamase מתרחש מספיק מהר על שינוי. עם זאת, יש לציין שבצענו דילולים סדרתי של חיידקי פעם במרק LB, שאולי תרם להתאוששות מההלם החשמלי וליזום ביטוי גנים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> איור 1. תיאור גרפי של המתודולוגיה להכנה המהירה של חיידקי electrocompetent. אחרי 4-6 שעות (תלוי בצפיפות של inocula) בכמות מספקת של חיידקים ניתן לאסוף לבצע 05:56 תמורות מצלחת אגר LB אחד. כדי להבטיח מספר שווה של תאים המוסמכים עבור כל נפח סופי שelectroporated, חיידקים שנאספו מהצלחת אגר LB היו בתחילה אספו ושטפו ביחד אז אלiquoted ב40 כרכי μl בהתאם לגודל של גלולה (כדורים גדולים יותר היו מדוללים בנפחים גדולים יותר מתחלק ב 40 μl). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> המספר של ה-DNA transformants / מיקרוגרם אמפיצילין עמיד (transformants אמפיצילין עמיד התאושש [%]) </td></tr><tr><td> זן </td><td> שיטה מסורתית </td><td> שיטה מהירה </td></tr><tr><td> החיידק (DH5α) </td><td> 2.3 x 10 6 (± 7.3 x 10 5) [9.4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7.1 x 10 5) [2.5%] </td></tr><tr><td> V. כולרה (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1.7 x 10 7) [5%] </td><td> 6.7 x 10 5 (± 2.1 x 10 5) [.3.3%] </td></tr></tbody></table> טבלת 1. יעילות טרנספורמציה למיקרוגרם של ה-DNA (pUC18) של electrocompetent בacteria שהוכן על ידי השיטה המסורתית לעומת השיטה המהירה. כל השינויים בוצעו ב500 pUC18 DNA ng (~ 80% DNA supercoiled כדמיינו ידי 1% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose) ותאי electroporated סדרתי היו מדוללים פי 10 במרק LB לפני ציפוי לCFU על LB-אגר עם אנטיביוטיקה. פקדים של חיידקים שאינם electroporated ושל חיידקי electroporated בלי פלסמיד, בדילול סדרתי ומצופים על אגר LB ללא אנטיביוטיקה בוצע עבור כל קבוצה של טרנספורמציות כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקי קיימא לפני ואחרי פועמים. פקדי electroporated ייצגו את קו הבסיס לאחוזים של חיידקי קיימא הפכו בהצלחה.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

77.0K Views.  University of Texas Brownsville.  Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות. 

Video: Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - שיטה גנטית לשינוי<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Immunology and Infection

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; ו אחר<em&gt; Vibrio</em&gt; מינים

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Bioengineering

הערכת פעילות מלווה Hsp70 באמצעות תאי Escherichia coli dnaK756

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

מחבר זרקור: חקר חלבוני הלם חום בזיהומים במלריה ושחפת

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Biochemistry

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.

טכניקות מעבדה המשמשות לשמירה על ביו-טיפוסים של<em&gt; ויבריו כולרה</em&gt; בידוד קליני ואיכותי

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

מדידת חלבוני כתב ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for use as a chassis for synthetic biological endeavors within the gastrointestinal tract. The wide phenotypic and genotypic variation observed within the genus led to a recent reclassification and the introduction of 23 novel genera.
Due to the breadth of variations within the old genera, protocols demonstrated in one member may not work as advertised with other members. A lack of centralized information on how exactly to manipulate specific strains has led to a range of ad hoc approaches, often adapted from other bacterial families. This can complicate matters for researchers starting in the field, who may not know which information does or does not apply to their chosen strain.
In this paper, we aim to centralize a set of protocols with demonstrated success, specifically in&#160;the Limosilactobacillus reuteri strain designation F275 (other collection numbers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), along with troubleshooting advice and common issues one may encounter. These protocols should enable a researcher with little to no experience working with L. reuteri DSM20016 to transform a plasmid, confirm transformation, and measure system feedback in a plate reader via a reporter protein.

מחבר זרקור: שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב Limosilactobacillus reuteri DSM20016  

Here, we present protocols for working with Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detailing growth, plasmid transformation, colony PCR, fluorescent reporter protein measurement, and limited plasmid mini-prep, as well as common issues and troubleshooting. These protocols allow the measurement of reporter proteins in DSM20016, or confirmation via colony PCR if no reporter is involved.

שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent

Summary

Explore More Videos

TransFLP - שיטה גנטית לשינוי

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

טכניקות מעבדה המשמשות לשמירה על ביו-טיפוסים של

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של

שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016