המחברים מודים לעמיתיו ואנשי צוות של מעבדות בהווה ובעבר שתמכו בפיתוח טכניקה זו שלהם. המעבדה של SP נתמך על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות ההפעלה גרנט MOP-84,473 ופתרונות אלברטה מתפתחת-בריאות (ממומנים על ידי הקרן למורשת אלברטה למחקר רפואית קרן קרן). DP של נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקה MD001091-01 וGM068855-02.

1. הכנת תרבויות חיידקים, כלים, וריאגנטים (יום 1, אחה&quot;צ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעתי אחר הצהריים המאוחרים, לחסן 1-5 מיליליטר מרק autoclaved LB בסטרילית (לדוגמא, 100 x 13 מ&quot;מ) מבחנות זכוכית בורוסיליקט עם aliquot קטן של חיידקים (חיידק או V. cholerae). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המבחנות מחוסנת בתוף גלגלת שוכנו ב37 ° C טמפרטורה (חדר חם או חממה), הפעל את תוף ההרים במהירות גבוהה, ודגירת O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מפזר תא בצורה של &quot;מקל הוקי&quot; ממוט זכוכית על ידי חימום אמצע המוט בלהבה של מבער בונזן עד הזכוכית מתרככת ואז לכוון את העיקול בעדינות עם פינצטה או פלייר לזווית 135 ° . מחממים את המוט פעם נוספת בנקודת האמצע שבין תום והעיקול הראשון ולכופף אותו בזווית של ° 45 פנימה (בכיוון ההפוך של העיקול הראשון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LB-אגר ללא אנטיביוטיקה ולשפוך לתוך צלחות פטרי בהכנהצלחות פרוטוקול electrocompetence, וLB-אגר המכילות האנטיביוטיקה המתאימה (לפי סמן ההתנגדות על הווקטור להיות electroporated), ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המסנן מעוקר 2 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון לV. cholerae, או DDH החיטוי 2 O לE. coli, ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 2. צמיחה של חיידקי Electrocompetent (DAY 2, בוקר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק של תרבות חיידקי O / N 100 μl על כל צלחת אגר LB, מניות גליצרול קפוא יכולות גם להיות מנוצלים ובאופן ישיר נמסרו לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את מפזר תא בצורת מקל הוקי ב100% EtOH, לנקז בקצרה ולשרוף EtOH שנותר כדי לעקר אותו לפני השימוש ולהתפשט. להפיץ את תרבות חיידקי 100 O μl / N באופן שווה עם מפזר תא זכוכית סטרילית כדי לוודא שלא לשבש את המשטח אגר (הפסקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות, או עד שדשא דק של התפתחות חיידקים להיותמגיע להבחנה. תאים הם מוכשרים ביותר כאשר גדל באופן פעיל. </li></ol> 3. הכנת תאי Electrocompetent בקטריאלי (DAY 2, אחה&quot;צ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את החיידקים עם לולאת inoculating סטרילי כדי לוודא שלא לנקב או לשבור את פני השטח של אגר. מסת חיידקי 2 מ&quot;מ קוטר אחת מספיקה לשינוי אחד. בדרך כלל, זה דורש מגרד את פני השטח של הדשא הדק עם inoculating לולאת שתיים או שלוש פעמים. כמה דוגמאות (בדרך כלל בין 4-6) ניתן לגבות מאותה הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המוני החיידקים ב1 מיליליטר קר כקרח 2 מ&quot;מ CaCl 2 (לV. cholerae) או סטרילי DDH 2 O (לE. coli) ומערבבים היטב עד שאין גושים גלויים, לשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל השעיה חיידקים במשך 5 דקות ב XG 5,000 בmicrocentrifuge קירור מוגדר 4 ° C, או בmicrocentrifuge מאוחסנים בחדר קר מוגדר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspבסופו של גלולה החיידקים באותו הנפח של קר כקרח 2 מ&quot;מ CaCl 2 או סטרילי DDH 2 O, וחזור על צעד צנטריפוגה כפי שנעשה לפני עוד פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, resuspend, ולאחר מכן לשחרר את הכדור בקטריאלי ביסודיות ב40 קרח קר μl 2 מ&quot;מ CaCl 2 או סטרילי DDH 2 O ולשמור על קרח. </li></ol> 4. טרנספורמציה של חיידקי Electrocompetent (DAY 2, אחה&quot;צ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עד 1 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (במי μl עד 1 או חיץ טריס-EDTA) להשעית חיידקי 40 μl ולהעביר את התערובת לתוך קובט טרום צונן, סטרילית פער 0.2 סנטימטר. ריכוז המלח בדגימת DNA חייב להיות נמוך, כפי שהוא יתרום לקשתי של הדופק בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קובט לתוך תא electroporation של מודול בקרת דופק, וelectroporate ב1.8 KV, 25 μF. קבוע הזמן צריך להיות ~ 5.0 אלפיות שני, ולא קשתיים צריכים להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשחזר את ההשעיה התא על ידי resuspending לתוך 1 מיליליטר מרק LB ולהעביר לתוך מבחנת זכוכית ורוסיליקט autoclaved בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להתאושש על ידי דוגרים בתנאי צמיחת סודה (בתוף גלגלת) על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ללא בחירה אנטיביוטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט החיידקים על גבי הצלחות אגר LB הכינו בעבר בנוכחות הסוכן המתאים סלקטיבית (אנטיביוטיקה), ולדגור על 37 מעלות CO / נ אם חיידקים הופכים עם ריכוז גבוה של וקטור מטוהר (0.1-1 מיקרוגרם פלסמיד supercoiled), לספק 10 μl של תרבות חיידקים על קצה הצלחת אגר LB ועם פס inoculating לולאת סטרילי למושבות מבודדות בשיטת הפס ברבע. אם תערובת קשירה הפכה, לספק של תרבות חיידקים 100 μl על כל צלחת אגר ולהתפשט באופן שווה את זה עם מפזר תא זכוכית המעוקרת. </li></ol> אם קבוע הזמן קצר (להיות3.5 msec נמוכים), או פועם מוביל קשתי, ואז שוב לזרז את דגימת DNA, לשטוף עם EtOH 70% פעמיים כדי להסיר מלחים לפני הייבוש וresuspending במאגר TE.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).</li><li>O'Callaghan, D., Charbit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Salmonella+typhimurium+and+Salmonella+typhi+by+electroporation.">High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation.</a> Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).</li><li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus,+Vibrio+alginolyticus,+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li><li>Grones, J., Turna, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+microorganisms+with+the+plasmid+vector+with+the+replicon+from+pAC1+from+Acetobacter+pasteurianus.">Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).</li><li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens.">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li><li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation.">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li><li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation.">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li><li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).</li><li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages.">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).</li></ol>

אין גילויים חלים.

יעילות שינוי כפופה למגוון גורמים ללא קשר לשיטה המועסק על מנת להכין את התאים המוסמכים. משתנים מקבילים חל על שיטה זו; זהירות רבה יש לנקוט שברגע שהתאים נקצרים מהצלחת אגר כזה שהם נשמרים בטמפרטורה קבועה קרה (שלא יעלה על 4 מעלות צלזיוס). דשא החיידקים חייב להיות פעיל גדל בזמן האיסוף; תאים חייבים להיות בשלב אמצע לוגריתמים של צמיחה. איכות של ה-DNA (כלומר זיהום של מלחים) משפיעה על יעילות שינוי. באופן ספציפי, כאשר בשיטה זו, אגר לא צריך להיות שבור שברים אגר בקובט יגרמו קשתי של הדופק. רוב הבעיות נתקלו עם טכניקה זו קשורות עם שני נושאים; איסוף החיידקים במהלך החלון הנכון של זמן מהצלחת אגר כאשר הם גדלים באופן פעיל. לאסוף אותם מוקדם מדי יניבו מספרים סלולריים מספיקים ויעבדמגרד את הצלחת אגר LB מתסכל כי &quot;pellicule&quot; הם יוצרים קשה להרים את פני השטח של הצלחת. חיידקי איסוף מאוחר מדי יקטינו את היכולת שלהם באופן דרמטי. החלון של הזמן באופן טבעי משתנה בהתאם לצפיפות של הבידוד מצופה על הצלחות אגר LB. השלב הקריטי השני הוא לשמור על החיידקים קרים (4 מעלות צלזיוס) מהרגע שהם הרימו את הצלחת אגר וresuspended בCaCl 2 או DDH 2 O עד שהם מצופים על אגר LB הבא טרנספורמציה. צינורות microfuge המכילים חיידקים, cuvettes וחיץ צריכים להיות טרום צוננים ושמרו על קרח בכל העת עד לחיידקים הם מצופים. עם זאת, בעיות נוספות יכולות להתעורר כאשר סטרילי DDH 2 O או CaCl 2 יכיל משקע או מזוהם. מסיבה זו אנו ממליצים להכין טריים מגיב זה. שינוי פתרון בעיות הוא הקל על ידי לרבות בקרות כאשר הפיכת bacteria שניתנו מוסמך בכל דרך. ביקורת שלילית בהיקף של קבוצה של חיידקים שאינם המוסמכים הפכו מצופים על צלחת אגר LB המכילה את הסמן סלקטיבית תהיה במהירות לעזור לקבוע אם האנטיביוטיקה על הצלחת היא יעילה. שינוי שליטה חיובי עם הכנת פלסמיד ידועה באיכות טובה ובכמות חסה באותו סמן סלקטיבית כמדגם הניסיוני יהיה מועיל בקביעה האם החיידקים הם מוכשרים, אלא גם אם ה-DNA ניסיוני הפכה די הייתה בכמות או באיכות. היתרונות של שיטה זו הם מרובים; השיטה יכולה להתבצע באותו היום שבו שינוי מתוכנן. מצאנו כי מניית גליצרול חיידקים קפואה עשויה להיות מצופה ישירות על אגר LB בלי לפגוע בelectrocompetence, יש לנו עשיתי את זה במצבים &quot;חירום&quot; (לאחר שוכח להתחיל תרבות הלילה ביום שלפני). למרות שאנחנו לא יכולים לבדוק את הדוארמאוד מתח ידוע, כל E. coli או V. זן cholerae שניתן להפוך על ידי electroporation היה מקובל בפרוטוקול זה בידיים שלנו. הטכניקה היא מהירה, יעילה, ויעילות הפיכת תשואות דומה לאלה המתקבלים מהכנת חיידקי electrocompetent בשיטות מסורתיות. השיטה מבטלת את הדרישה לצנטריפוגה במהירות גבוהה והרוטורים קשורים, שייקר אינקובטור מסלולית ודליי סטרילי צנטריפוגות (מכולות), וכמויות גדולות של חיץ autoclaved. למרות שהטבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים היא מקיפה למדי, רוב מעבדות המבצעות electroporation תהיה רוב, אם לא כולם, של חומרים אלה כבר זמינים. ואולי הכי חשוב, הטכניקה יכולה להיות מיושמת בקלות כדי ליצור זני מעבדה ספציפית electrocompetent עם רקע מוטציה במהירות. אנו מודעים לכל מגבלות של טכניקה זו כפי שהוא החליף את השיטה המסורתית של הכנת electrocompetent חיידקים במעבדות שלנו. התוצאות של הניסויים שלנו הראו כאן בוצעו בתאי electrocompetent טריים המיוצרים בשיטה המסורתית שאוחסנה ב-80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 1 שבוע. עם זאת, מניות תא electrocompetent קפוא מאבדות יכולת ואו יכולת קיום לאורך תקופות ממושכות של שטח האחסון. הפרוטוקול המקוצר שלנו מאפשר ההכנה של תאי electrocompetent טריים באותו היום את השינוי מתוכנן חששות לגבי גיל של המניה אשר עלול לגרום לתשואת transformant ירדה בלי. אנחנו לא ניסינו אחסון תאי electrocompetent הופקו באמצעות השיטה המהירה לשימוש ביום אחר כמו זה לא היה נחוץ. אמנם לא מוצג כאן, את היעילות של תאי electrocompetent הוכנה באמצעות השיטה המהירה שלנו היא מספיק לתערובות קשירה. התמורות שדווחו לאינו O1 V. cholerae במאמר שפורסם לאחרונה על ידי Unterweger et al.17 בוצעו באמצעות חיידקי electrocompetent שהוכנו על ידי השיטה המתוארת כאן (פרט לאלה שבוצעו על ידי נטיה). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להפוך את הזנים בעלי רקע מוטציה במהירות וביעילות ללא צורך להכין קבוצות גדולות של תאים. הכנה מהירה זה של שיטת חיידקי electrocompetent יכולה להיות מותאמת לפרוקריוטים אחרים שהוכחו להיות מקובל electroporation כעיקרון של הכנה והגדרות electroporation הולכים להיות זהה לאלה של פרוטוקולים מסורתיים.

מאז הקמתה &quot;בתחילת 1980s 1, electroporation הפך טכניקת ביולוגיה מולקולרית נפרד, סביר להניח שהשיטה הנפוצה ביותר המועסק כדי להפוך / תאי חי transfect עם חומצות גרעין עגולות או ליניארית. פותח במקור עבור transfection של תאי אוקריוטים 1, electroporation הותאם לאחר מכן להפיכתה של א &#39; coli 2, 3. בבקטריולוגיה, electroporation הפך לסטנדרט במעבדה ושונתה כדי להפוך מגוון רחב של חיידקים, כולל 4 Pseudomonas גראם השלילי, Salmonellae 5, Vibrios 6, Serratiae, ו7 Shigellae; Clostridia גראם החיובי 8, 9 חיידקים, לקטובצילוס 10 ו11 Enterococci. אפילו כמה Archaebacteria הוכיחו ניתן לשינוי על ידי electroporation, כולל Methanococci </em&gt; 12 וSulfolobus מינים 13. לסקירה מקיפה עיין און ו14 Aachmann. יעילות של שינוי על ידי electroporation היא מדווח 10-20 גבוהה פי יותר מיכולות כימיות או חום הלם 2. עם זאת, בדומה להכנת חיידקים ליכולת כימית כמותאמים על ידי דאגלס Hanahan ב1980s 15, תאים חייבים גם להיות מוכנים להיות electrocompetent. Electroporation הוא אמצעי מהיר ויעיל של שינוי בקטריאלי, הדורש חיידקי electrocompetent, ה-DNA מטוהר, מודול בקרת דופק, המספק את הדחף החשמלי, וחדר שיכול להכיל cuvettes חד פעמי הקטן המתפקדים כהאלקטרודה. בקצרה, חיידקים קרים, מוכשרים מעורבבים עם פלסמיד דנ&quot;א, נתון לדופק מתח גבוה בקובט, resuspended בתקשורת צמיחה, טופח על C ° 30-37 ל30-45 דקות, ולאחר מכן מצופה במדיום מוצק למחצה (אגר מזין צלחות) עם appropriate אנטיביוטיקה סלקטיבית. בניגוד לשלב הפועם, הכנת א electrocompetent coli נותר הליך מרובה המתבצע באופן מסורתי בכמויות גדולות. בקצרה, תרבות לילה של חיידקים היא מחוסנת לתוך בקבוק Erlenmeyer עם עד 1 ליטר מרק לוריא (LB) 100 מיליליטר, גדל שלב אמצע לוגריתמים של צמיחה (OD של 600 &lt;1.0), והוא נתון לשטיפות סדרו עם שאינו סטריליים יוני חיץ או מים מזוקקי פעמיים (DDH 2 O) בהפחתת כרכים ב 4 ° C. יש לנקוט בזהירות רבה כדי לשמור על התאים קרים לאורך ההליך כולו ולמנוע זיהום. זה דורש שימוש בדליי autoclaved צנטריפוגה ומאגרים לא יוניים או 2 DDH O, חממה ייקר מסלולית, צנטריפוגה במהירות גבוהה נפח גדול בקירור ומערכת של הרוטורים. חיידקי סופו של דבר הם resuspended בנפח קטן של חיץ בתוספת גליצרול 10% וaliquoted לתוך ~ כרכי μl 40, WHich מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אחסון בטמפרטורה נמוכה לעתים קרובות תוצאות ביעילות טרנספורמציה ירד בשל אובדן יכולת הקיום לאורך זמן. תאי חיידקיים Electrocompetent גם זמינים ממגוון רחב של מקורות מסחריים אבל רק למספר מוגבל של (לעתים קרובות רקומבינציה הלקויה) E. זני coli מועסקים בכינויו מארחים להפיץ מגוון רחב של פלסמידים. כתוצאה מכך חוקרים להסתמך על שיטות בבית כדי להכין הזנים / מוטציות שלהם לשינוי. חלופי פרוטוקול, מהיר ויעיל להכנת ה electrocompetent coli כבר בשימוש על ידי כמה מעבדות בקטריולוגיה מולקולריות כבר כמה זמן והורחב לחיידקים גראם שלילית נוספים, במקרה שלנו V. cholerae. היוזם של הפרוטוקול אינו יכול להיות מזוהה כפי שהוא כבר מותאם על ידי חוקרים אחרים לאורך זמן. השיטה המוצגת כאן נעשתה שימוש בLaboratories במשך כמעט שני עשורים, וזה המטרה שלנו הוא לשתף את הפרוטוקול הזה שימושי עם בני גילנו.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

Electroporation הפך שיטה בשימוש נרחבת עבור מהירות וביעילות החדרת דנ&quot;א זר לתוך מגוון רחב של תאים. Electrotransformation הפך את שיטת הבחירה להחדרת DNA לפרוקריוטים שאינם באופן טבעי מוכשרים. Electroporation הוא שיטת שינוי מהירה, יעילה, ויעיל שבנוסף ל-DNA מטוהר וחיידקים המוסמכים, דורשת בקר זמין מסחרי גן הדופק וcuvettes. בניגוד לשלב הפועם, הכנת תאי electrocompetent היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית כרוכים בסבבים חוזרים ונשנים של צנטריפוגה ושוטף בהפחתת כמויות של מים סטריליים, קרים, או מאגרים לא יוניים של כמויות גדולות של תרבויות גדלו שלב אמצע לוגריתמים של צמיחה. זמן ומאמץ ניתן לשמור על ידי רכישת תאי electrocompetent ממקורות מסחריים, אבל את הבחירה מוגבלת למועסקים בדרך כלל E. זני מעבדה coli. אנחנו הפצה מהירה בזאת ושיטה יעילה להכנת ה electrocompetent coli, אשר כבר בשימוש על ידי מעבדות בקטריולוגיה במשך זמן מה, יכול להיות מותאם לV. cholerae ופרוקריוטים אחרים. למרות שאנו לא יכולים לקבוע למי קרדיט על פיתוח הטכניקה המקורית, אנחנו עושים את זה לרשות הקהילה המדעית בזאת.

בצענו סדרה של תמורות עם א &#39; coli ו V. cholerae כדי להשוות את יעילות הפיכתה של מתודולוגיה המהירה שלנו עם עיבוד של השיטה (המסורתית) שתוארה במקור על ידי דוואר et al. 2 להכנת חיידקי electrocompetent. כדי לבצע את ההכנה המסורתית של תאים המוסמכים, 500 מיליליטר LB בבקבוק L-Erlenmeyer 2 היו מחוסן עם תרבות לילה 500 μl של E. coli DH5α או V. cholerae O395, מודגרות בייקר מסלולית (215 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס) ונקטף בOD 600 של בין 0.5-1.0. הבקבוק קורר על קרח והתרבויות centrifuged ברוטור טרום צונן ב4,000 XG 10 דקות ב 4 ° C. כדורי התא היו מושעים באופן יסודי ב500 מיליליטר קר כקרח 2 מ&quot;מ CaCl 2 לV. 2 O cholerae וDDH לE. coli, וcentrifuged שוב באותם תנאים. הסבבים הבאים של resuspensionצנטריפוגה ד בוצעה בהפחתת כרכים של 200 ו100 מיליליטר כרכים לוודא התרבות נשארה צוננת ב 4 ° C. לבסוף, resuspension וצנטריפוגה ב10 מיליליטר נפח בוצעו עם גליצרול 10%. גלולה הסופית resuspended ב 2 מיליליטר גליצרול 10% ו40 aliquots μl הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס ומאוחסנים לא יותר משבוע לפני electroporation אחד. תנאי electroporation כוללים הגדרות דופק וגודל קובט היו זהים לשני מיני החיידקים בכל electroporations ללא קשר לשיטת הכנה של תאים המוסמכים. ההבדל היחיד היה שבצענו את שטיפות ב DDH 2 O הקר לE. coli וקר 2 מ&quot;מ CaCl 2 לV. cholerae. טבלת 1 מראה תוצאות של חיידקים הפכו על ידי electroporation זהה אך שניתנו מוסמך או עם הפרוטוקול המהיר או בשיטה המסורתית. אנחנו עובדים O395 המתח וDH5α כנפוץמשמשים ly זנים, נציג של V. cholerae וא coli בהתאמה; ניתן להשיג תוצאות דומות עם זנים אחרים מאותו המין (אם כי לא כל זן נבדק) וסביר להניח שמותאמת לחיידקים גראם שלילית אחרים וכנראה מעבר לה. כדי להבטיח שמספרים סלולריים שווים נכחו בכל אצווה פעמה, חיידקי electrocompetent שנוצרו תוך ניצול השיטה המהירה היו נקווים על בסיס הגבייה, מעורב, המשיכו מושעה homogenously, וaliquoted בכרכי μl 40 זמן קצר לפני electroporation. חיידקי Electrocompetent שנוצרו תוך ניצול השיטה המסורתית טופלו באופן דומה לפני ההקפאה ב40 aliquots μl. בעקבות מסירה של הדופק, כל אצווה של 40 μl חיידקי electroporated הושעה ל400 μl LB ומדולל 1:10 סדרתי. מאה מיקרוליטר של דילול כל היו מצופה על אגר LB בנוכחות 100 אמפיצילין מיקרוגרם / מיליליטר ולהפיץ באמצעות מפזר תא זכוכית סטריליתוטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לכמת את המספר הכולל של חיידקים המועסקים בכל שינוי, 40 כרכי μl של חיידקי electrocompetent של כל מנה מוכנה היו בדילול סדרתי, ומצופים על אגר LB ללא אנטיביוטיקה באופן זהה במקביל. aliquot אחד מחיידקים שטופלו באופן שווה מכל אצווה היה electroporated עם 1 μl טריס-EDTA (TE) חיץ אך ללא DNA (שינוי מדומה), באופן סדרתי בדילול מלא ומצופה על אגר LB ללא אנטיביוטיקה כדי לאמוד את מספר התאים שאבדו במשלוח של דופק חשמלי. לבסוף, וריאציה נוספת אחד לניסוי בוצעה כדי לקבוע אם 30 incubations דקות על 37 מעלות צלזיוס ב 1 מיליליטר LB לאחר electroporation אבל לפני ציפוי על LB-אגר ישפיע על ההתאוששות של תאים מותמרים. יחידות מושבה להרכיב (CFUs) נפקדו ביום הבא. לצורך ניסוי זה אנו מועסקים pUC18, פלסמיד מעבדה משותף, וקבוצות של חיידקים המוסמכים בהיקף שלpproximately 10 8 CFUs לתאים שהוכן תוך ניצול השיטה המסורתית ו10 7 CFUs לתאים שהוכנו על ניצול הפרוטוקול המהיר. Electroporation לבד (בלי ה-DNA) מופחת CFUs קיימא על ידי 10-100 לקפל ללא קשר לשיטה המשמשת להכנת תאי electrocompetent. כפי שניתן לראות בטבלה 1, תשואת transformant הייתה בתוך 10 6 -10 7 CFUs / מיקרוגרם של טווח ה-DNA בשלושה ניסויים לשכפל (סטיות תקן בסוגריים) לE. coli (DH5α) וV. כולרה (O395) בהתאמה תוך שימוש בשיטה המסורתית, ארוכה יותר להכנת תא electrocompetent. תשואת Transformant הופיעה ירד 10 קיפול ל10 5 -10 6 CFUs / מיקרוגרם של ה-DNA בשלושה ניסויים לשכפל (סטיית תקן בסוגריים) לE. coli ו V. cholerae בהתאמה תוך שימוש בשיטה המהירה. מסיבה זו אנו קובעים את אחוז החיידקים הפכו על ידי חלוקת CFUs הפךבמספר CFUs התאושש מ&quot; תמורות מדומה &quot;(ללא פלסמיד) מקבוצות אחרות זהות של תאים המוסמכים. אחוז של חיידקים שינו היה בתוך יומן אחד (2.5-9.4%) ללא קשר לשיטה של הכנה ומינים הפכו (טבלת 1 מספרים בסוגריים). תוצאות אלו מצביעות על כך שהיעילות של השיטה המהירה היא דומה לזו של ההליך הממושך המסורתי של הכנת תאים המוסמכים וכי זני הנציג של Vibrio cholerae וEscherichia coli הם לא פחות קביל על ההליך המהיר. מצאנו כי יעילות שינוי, לפלסמידים כמו pUC18 מחסה קלטות β-lactamase, אינו מושפע מזמן התאוששות 30 דקות במרק LB. אותו מספר transformants היה התאושש אם התאים היו מצופים לאגרו LB בנוכחות אמפיצילין ישירות, לאחר electroporation, ובין אם הם הורשו זמן התאוששות 30-45 דקותבמרק LB על 37 מעלות צלזיוס לפני ציפוי. הממצאים שלנו שאמפיצילין התנגדות אינה דורשת תוצאה בתנאים לא סלקטיבי עולה כי ביטוי β-lactamase מתרחש מספיק מהר על שינוי. עם זאת, יש לציין שבצענו דילולים סדרתי של חיידקי פעם במרק LB, שאולי תרם להתאוששות מההלם החשמלי וליזום ביטוי גנים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> איור 1. תיאור גרפי של המתודולוגיה להכנה המהירה של חיידקי electrocompetent. אחרי 4-6 שעות (תלוי בצפיפות של inocula) בכמות מספקת של חיידקים ניתן לאסוף לבצע 05:56 תמורות מצלחת אגר LB אחד. כדי להבטיח מספר שווה של תאים המוסמכים עבור כל נפח סופי שelectroporated, חיידקים שנאספו מהצלחת אגר LB היו בתחילה אספו ושטפו ביחד אז אלiquoted ב40 כרכי μl בהתאם לגודל של גלולה (כדורים גדולים יותר היו מדוללים בנפחים גדולים יותר מתחלק ב 40 μl). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> המספר של ה-DNA transformants / מיקרוגרם אמפיצילין עמיד (transformants אמפיצילין עמיד התאושש [%]) </td></tr><tr><td> זן </td><td> שיטה מסורתית </td><td> שיטה מהירה </td></tr><tr><td> החיידק (DH5α) </td><td> 2.3 x 10 6 (± 7.3 x 10 5) [9.4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7.1 x 10 5) [2.5%] </td></tr><tr><td> V. כולרה (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1.7 x 10 7) [5%] </td><td> 6.7 x 10 5 (± 2.1 x 10 5) [.3.3%] </td></tr></tbody></table> טבלת 1. יעילות טרנספורמציה למיקרוגרם של ה-DNA (pUC18) של electrocompetent בacteria שהוכן על ידי השיטה המסורתית לעומת השיטה המהירה. כל השינויים בוצעו ב500 pUC18 DNA ng (~ 80% DNA supercoiled כדמיינו ידי 1% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose) ותאי electroporated סדרתי היו מדוללים פי 10 במרק LB לפני ציפוי לCFU על LB-אגר עם אנטיביוטיקה. פקדים של חיידקים שאינם electroporated ושל חיידקי electroporated בלי פלסמיד, בדילול סדרתי ומצופים על אגר LB ללא אנטיביוטיקה בוצע עבור כל קבוצה של טרנספורמציות כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקי קיימא לפני ואחרי פועמים. פקדי electroporated ייצגו את קו הבסיס לאחוזים של חיידקי קיימא הפכו בהצלחה.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae at JoVE.com

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.6K Views.  University of Texas Brownsville.  Electroporation הוא שיטה הנפוצה מועסק להחדרת DNA לחיידקים בתהליך המכונה טרנספורמציה. פרוטוקולים מסורתיים להכנת תאי electrocompetent הם זמן רב ועבודה אינטנסיבית. מאמר זה מתאר חלופי, מהיר, ושיטה יעילה להכנת תאי electrocompetent מועסקים כיום על ידי כמה מעבדות. 

Video: Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

פרוטוקולים ליישום<em&gt; חיידקי Escherichia</emמערכת&gt; בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...