Damos las gracias a M. Channey, E. Chau, y K. Tomas por su colaboración en el proyecto. El Proyecto de abastecimiento fueron financiados parcialmente por California Polytechnic State University.

1. Medios y cultivo de cepas microbianas NOTA: Use técnicas asépticas en todos los experimentos. Utilizar materiales estériles. Esterilizar todos los recipientes, herramientas y reactivos antes de su uso. Autoclave todos los materiales de desecho antes de su eliminación, ya que se consideran de riesgo biológico. temperatura del autoclave y el tiempo de combinación es ≥121 ° C x ≥15 min para todos los procedimientos siguientes. <ol><li> Para hacer ~ 1 l de agar tríptico de soja (TSA), primero agregar 1 L de agua desionizada en un matraz de 2 litros Erlenmeyer que contiene una barra de agitación magnética. Utilice un matraz que es al menos dos veces mayor que el volumen final. Añadir 30 g de polvo de caldo de soja tríptico y 20 g de agar gránulos en el matraz. NOTA: El uso agar al 2% en lugar del 1,5% para limitar el enjambre de algunas especies de Vibrio. <ol><li> Mezclar bien activando el agitador. Mientras se agita, encender la calefacción a hervir la mezcla. Retirar el matraz de la estufa tan pronto como la mezcla comience a hervir. Cubra THe matraz con un papel de aluminio. Tape el papel de aluminio para fijarlo al matraz antes de autoclave. </li><li> Para hacer caldo de soja tríptico (TSB), omita el agar de la receta en el paso 1.1. NOTA: Puede utilizar botellas en lugar de un matraz Erlenmeyer. </li><li> Para hacer agar de soja tríptico suplementado con cloruro de sodio 2% o NaCl (TSAS), añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. Para hacer caldo de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl (OSP), omitir el agar, añadir 20 g de NaCl en la mezcla antes de la agitación y el calentamiento. </li></ol></li><li> Para hacer agar de infusión de cerebro y corazón (BHI), suspender 37 g de polvo BHI y 15 g de gránulos de agar en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación para disolver el polvo. Autoclave. Omitir el agar para hacer caldo BHI. </li><li> Para hacer agar TCBS, suspender 89 g del polvo TCBS en 1 L de agua purificada. Calentar con agitación y se deja hervir durante 1 minuto para disolver completamente el polvo. No esterilizar en autoclave. </li><li> Para todos los medios de agar, enfriar el agar caliente a 45-50 ° C en un baño de agua. Organizar placas de Petri vacías en pilas de cinco a seis placas. A partir de la parte inferior de la pila, se vierte el agar fundido en cada placa de Petri para llegar hasta la mitad. Cierre la tapa de la placa de Petri después de verter. Dejar que el agar se solidifique al permitir que las placas reposar a temperatura ambiente. <ol><li> Utilice las placas de agar al día siguiente o después de 12 horas. Almacenar las placas utilizadas en un refrigerador hasta por dos semanas. Antes de usar, eliminar los platos de la nevera y se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 15 min. NOTA: agar de un litro hace ~ 45 placas de agar. Permitir a las placas de agar se seque lo suficiente en el día de la preparación, y se equilibran a temperatura ambiente después de almacenamiento en frío para reducir eficazmente la propagación de las colonias. </li></ol></li><li> Obtener placas de agar chocolate y cromogénico y equilibrar a temperatura ambiente antes de cada experimento. </li><li> Subcultura de los 54 cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 da cada pocosys. <ol><li> Use un asa de siembra estéril para transferir las culturas a partir de una solución madre congelada o un lote anterior a los medios no selectivos como el BHI, TSB / TSA o agar chocolate. Crecer halófilas Vibrio spp. en los OSP / TSAS. </li><li> Para comprobar la pureza de la cultura, racha todas las cepas en un patrón que permita la observación de colonias aisladas. Por ejemplo, utilizar un patrón de rayas de tres fases para diluir una gran cantidad de bacterias a menor cantidad, con el tiempo produciendo colonias aisladas. </li></ol></li><li> Incubar las placas al revés a 35-37 ° C durante un máximo de 48 horas. Para Campylobacter spp., Incubar los tubos o placas en un frasco de tapa cerrado que contiene una bolsa de gas para producir un ambiente microaerofílico. Observe morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar. NOTA: Incubar todas las placas al revés para evitar que las gotas de agua condensadas formadas en la parte inferior de la tapa caiga sobre la colOnies. </li></ol> 2. Las especies Determinación por PCR <ol><li> Llevar a cabo TLH-PCR para confirmar la identidad de V. cepas parahaemolyticus. Use cebadores TLH -F (5 &#39;AAA GCG GAT TAT GCA GCA GAA CTG 3&#39;) y -R tlh (5 &#39;TCG ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3&#39;) para amplificar un fragmento de 450 pb del gen de la hemolisina termolábil 20 . <ol><li> Use un asa de siembra estéril para transferir algunas colonias aisladas de cada V. parahaemolyticus cepa de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> culturas centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Hervir la suspensión durante 3 min para dar lisado celular. NOTA: V. parahaemolyticus es fácil de ser lisadas. Por lo tanto no se requiere reactivo de lisis. También es posible utilizar un poco de colonia directamente como la plantilla. </li><li> Realizar PCR en una reacción de 25 l-volumen. Preparar una mezcla de reacción que contiene una concentración final de 1 x tampón de PCR, 1.5 mM MgCl2, 100 mM de cada dNTP, 1 mM de cada cebador, 1 U de Taq polimerasa y 1 l de lisado celular. Después de la preincubación a 94 ° C durante 5 min, ejecute 35 ciclos de amplificación de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, y 72 ° C durante 60 seg 21. </li><li> alícuotas de carga de amplicón 5-l en 1,5% geles de agarosa. Encienda la fuente de alimentación para iniciar la electroforesis. Visualizar la presencia o ausencia de amplicones bajo iluminación UV después de la tinción con bromuro de etidio. </li></ol></li></ol> 3. Crecimiento en medios selectivos y diferenciales <ol><li> Dos a cuatro días antes del experimento, racha todas las cepas microbianas que se muestran en la Tabla 1 en medio no selectivo (TSAS, BHI o agar chocolate) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante 48 horas. Comprobar la pureza de los cultivos mediante la observación de morfología de las colonias después de la incubación. Los cultivos puros deben producir colonias que exhiben morfología de la colonia similar. </li><li> Transferir algunas colonias aisladas a partir del paso 3.1 en 5 ml de caldo. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas. Nota: El uso colonias jóvenes, que son menos de cuatro días de edad, para preparar cultivos de una noche en todos los experimentos. </li><li> Racha de un asa de siembra de cultivos de una noche en medios selectivos y diferenciales (TCBS y agar cromogénico) para el aislamiento de colonias. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. </li><li> Registrar el crecimiento global de todas las cepas mediante el examen tanto de la densidad de cultivo en el plato y el tamaño de las colonias aisladas. Registre el color de las colonias bajo la luz ambiental y / o UV. Tenga en cuenta otras características de la colonia aislada, como la elevación, el margen y la forma. </li></ol> 4. Ensayo de recuperación <ol><li> Seleccionar un subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abarcan diferentes serotipos y orígenes de aislamiento <shasta&gt; 22. Inocular cultivos jóvenes de las placas en 5 ml de TSB. Incubar los tubos a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Llevar a cabo un método de recuento en placa estándar de los cultivos de una noche como se describe a continuación. <ol><li> Vórtice para mezclar bien los cultivos de la noche. Hacer una 10 veces o dilución 10 -1 mediante la transferencia de 100 l de cultivo de una noche en un tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. </li><li> Utilizar una punta de pipeta para transferir 100 l del tubo de dilución 10 -1 a otro tubo que contiene 900 l de PBS. Vórtice para mezclar bien. Esto constituye dilución 10 -2. Repita el proceso de forma secuencial para obtener una dilución 10 -7. </li><li> El uso de los 10 -4 a 10 -7 tubos de dilución, la placa de 100 l cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,. NOTA: El factor de dilución (df) de la placa se convierte en 10 -5-10 -8, respectivamente. </li><li> Difundir las alícuotas de manera uniforme en tél agar superficie. NOTA: Es muy bien utilizar el mismo esparcidor por cepa en el mismo medio, siempre que la alícuota más diluida se extiende primero (es decir, de 10 -8-10 -5). No utilice el mismo esparcidor para diferentes medios. </li><li> Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. Recuento de las colonias en las placas. Ignorar placas de apoyo colonias que son demasiado numerosos para contar (TNTC) o menor que 25. Calcular CFU / ml de acuerdo con lo siguiente: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Dónde N = el número de células en el tubo sin diluir, expresado como UFC / ml o CFU / g C = el número total de colonias contadas en las placas que dan 25-300 colonias 1 = el número de placa (s) donde las colonias contadas son de la más baja df n2 = número de placa (s) donde son colonias contadas a partir de la dilución de 10 veces subsecuente ref = factor de dilución más baja (es decir, la dilución más concentrada) </li></ol></li><li> Comparar CFU / ml entre los diferentes medios de comunicación. Utilice UFC / ml en TSAS como el 100%, se calcula el% de recuperación de V. parahaemolyticus cultiva en el agar cromogénico y TCBS. </li></ol> Ensayo 5. Competencia <ol><li> Elegir un subconjunto de cepas que muestran diferentes morfologías de colonias en el agar cromogénico y TCBS. NOTA: De esta manera, será posible contar las colonias se originaron de V. Sólo parahaemolyticus, a pesar de la presencia de otras especies en el inóculo. <ol><li> Elija una V. parahaemolyticus cepa que produce las colonias de color turquesa y cian esperados en TCBS y el agar cromogénico, respectivamente. </li><li> Elija un no V. parahaemolyticus y Vibrio una especie no que no crecen en cualquiera de estos medios, o tienen diferentes color de la colonia. NOTA: Por ejemplo, V. metschnikovii crece muy débilmente on TCBS y no creció en el agar cromogénico. Shigella sonnei no crece en TCBS pero produce colonias de color magenta en el agar cromogénico. </li></ol></li><li> Después de la selección de las cepas anteriores, preparar caldos de cultivo durante la noche utilizando colonias aisladas cultivadas en medios no selectivos. <ol><li> Hacer cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. metschnikovii mediante la transferencia de algunas colonias aisladas de TSAS a 5 ml de TSB. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li><li> Hacer cultivos de una noche de Shigella sonnei mediante la transferencia de unas pocas colonias aisladas de agar BHI a 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 horas. </li></ol></li><li> Para cada cepa, lleve a cabo una serie de dilución similar a los pasos 4.2.1 y 4.2.2. Placa de diluciones apropiadas sobre TSAS o BHI para determinar CFU / ml de cultivo de una noche, utilizando la ecuación de muestra en el paso 4.2.5. NOTA: Por lo general, 100 l de la dilución 10 -5 a la 10 -7tubos de obras para la mayoría de las culturas. Utilice los valores de UFC / ml para respaldar calcular la cantidad exacta de las células utilizadas en el siguiente paso. Los valores de UFC / ml calculados se obtienen después de la incubación, aunque los pasos siguientes se llevan a cabo en la misma fecha que la Etapa 5.3. </li><li> El uso de los cultivos de la noche y los tubos de dilución en los pasos 5.2 y 5.3, mezclar diferentes cantidades de una V. cepa parahaemolyticus y un no V. especies parahaemolyticus. Por ejemplo, la mezcla de 500 l de la tubo de dilución 10 -5 de V. parahaemolyticus con 500 l de los cultivos de una noche de V. metschnikovii. NOTA: Esta mezcla simula alto fondo microflora. Para simular un fondo bajo microflora, mezclar 500 l cada uno del tubo de dilución 10 -5 de ambas especies. </li><li> Spread 100 l de la mezcla de cada uno de los TCBS y TSAS placas de agar cromogénicos,. </li><li> Después de la incubación a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas, contar las colonias de V. parahaemolyticus y la no V. especies parahaemolyticus con base en su diferencia en el crecimiento y la morfología de las colonias en el agar cromogénico y TCBS. NOTA: Por ejemplo, si la no V. parahaemolyticus especies no crecen en el agar cromogénico y TCBS, todas las colonias serán de V. parahaemolyticus. Si la no V. parahaemolyticus especie crece en ambos medios, sólo las colonias de color turquesa en colonias TCBS y cian en agar cromogénico serán de V. parahaemolyticus. La no V. especies parahaemolyticus pueden o no pueden exhibir la morfología de colonia similar a V. parahaemolyticus en TSAS. <ol><li> Si la no V. especies parahaemolyticus crece de manera similar a V. parahaemolyticus en este medio no selectivo, divida el recuento de colonias por dos para obtener el número de V. parahaemolyticus solamente. Comparar el recuento de colonias real con la frecuencia esperada derivada del Paso 5.3. </li></ol></li></ol> 6. EFFECTS de Oyster Los homogeneizados <ol><li> Pesar ≥50 g de carne de molusco ≥12 moluscos incluida la carne y el licor. <ol><li> Añadir la misma cantidad de PBS a la carne de la ostra y el licor. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 90 seg. Esto constituye el 2 -1 diluida homogeneizado de ostras. </li><li> Añadir 100 g de 2 -1 homogeneizado ostra diluido a 400 g de PBS. Utilice una escala para medir el peso, no por volumen. Mezclar la mezcla a alta velocidad durante 1 min. Autoclave el homogeneizado de ostras. NOTA: Este será el homogeneizado de ostras utilizado para clavar. </li></ol></li><li> Repetir el ensayo de recuperación (Paso 4) en presencia de homogeneizado de ostras. <ol><li> Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l de V. parahaemolyticus cultivos de una noche cultivados en TSB a ella. Determinar la cantidad real de V. parahaemolyticus células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2. </li></ol></li><li> Repscomer el ensayo de la competencia (Paso 5) en presencia de homogeneizado de ostras. <ol><li> Después de los 500 g de ostras homogeneizado se enfría, se añaden 100 l cada uno de los cultivos de una noche de V. parahaemolyticus y V. no parahaemolyticus a ella. Determinar la cantidad real de bacterias Las células en el inóculo mediante la realización de los procedimientos de recuento en placa estándar descrito en el paso 4.2 </li></ol></li><li> Mezclar las células bacterianas con homogeneizado de ostras bien mediante el uso de un homogeneizador. NOTA: Después de mezclar, el homogeneizado de ostra que contiene las células añadidas intencionadamente se llama claveteado homogeneizado de ostras. </li><li> Hacer diluciones del homogeneizado de ostras de púas para obtener 10 -1 a 10 -3 tubos de dilución de acuerdo con los procedimientos descritos en la etapa 4.2.2. Spread 100 l de cada dilución en el cromogénico TCBS y TSAS agar,. Incubar las placas a 35-37 ° C durante un máximo de 96 horas. </li><li> Comparar el recuento de colonias en agar cromogénico real y TCBS con el exse sospecha vienen del recuento de colonias deduce de Pasos 6.2.1 y 6.3.1. NOTA: Por ejemplo, si un tubo de V. parahaemolyticus cultivo durante la noche contiene 10 8 CFU / ml, un inóculo de 100 l significa que 10 7 células se añaden a la 500-g de homogeneizado de ostras, produciendo 5 x 10 4 células / g. Después de la dilución y de las planchas, teniendo la placa df = 10 -2 debería producir 500 colonias; mientras que el tener df = 10 -3 debería producir 50 colonias. Estos son los recuentos de colonias esperados. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Vibrio+spp.+in+raw+shrimps+(Parapenaeus+longirostris)+and+performance+of+a+chromogenic+medium+for+the+isolation+of+Vibrio+strains.">Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains.</a> Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).</li><li>Food Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+guidance+on+reporting+results+from+studies+evaluating+diagnostic+tests.">Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests.</a> http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).</li><li>Burd, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+laboratory-developed+molecular+assays+for+infectious+diseases.">Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases.</a> Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).</li></ol>

Some media were generously provided by Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conducted this study while a student at California Polytechnic State University. He is currently an employee of Hardy Diagnostics.

Este estudio se centra en el desarrollo de medios de cultivo y evaluación. Convencionalmente, el TCBS es selectivo y diferencial medio utilizado para el aislamiento y la detección de V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. 12 vulnificus. Sin embargo, se ha informado de limitaciones para este medio, tales como la incapacidad para diferenciar V. cholerae de otras especies de Vibrio. La sacarosa y el indicador de pH son los agentes de diferenciación de TCBS. Por lo t...

Como miembro del género Vibrio, V. parahaemolyticus es una bacteria Gram-negativas, no formadoras de esporas, curvada, en forma de barra. Se presenta una alta movilidad en ambos ambientes líquidos y semisólidos. La mayoría V. parahaemolyticus cepas no son patógenos para los seres humanos, sin embargo, los subtipos patógenos han causado epidemias y pandemias, por lo tanto, esta especie se considera que es un importante patógeno de transmisión alimentaria en muchos países 1,2. La incidencia de la infección por Vibrio en los EE.UU. ha mostrado una tendencia al alza desde el año 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus es la especie más frecuentemente reportado que causan enfermedades en los EE.UU. 4,5. Otras especies clínicamente relevantes incluyen V. Alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Un pequeño porcentaje de las enfermedades es causada por múltiples especies simultáneamente. V. parahaemolyticus es una i naturalesnhabitant de agua marina y, por tanto, ampliamente distribuido en aguas marinas en todo el mundo, incluyendo los estuarios. La especie fue descubierta en 1950 después de un brote de intoxicación alimentaria en Japón. En los EE.UU., la especie fue aislada por primera vez en el agua de mar, sedimentos y moluscos en la región de Puget Sound 6,7. Filtradores en los hábitats marinos, como los moluscos bivalvos, pueden albergar V. parahaemolyticus como parte de su flora natural 8. Como tal, V. infecciones parahaemolyticus en humanos a menudo están relacionados con el consumo de mariscos contaminados, especialmente los mariscos crudos o poco cocidos. Una ruta menos común de entrada se produce cuando herida abierta se expone al agua del mar, lo que lleva a una infección cutánea. La mayoría V. cepas parahaemolyticus no causan enfermedad en humanos, sin embargo, ciertos subtipos que albergan los factores de virulencia como hemolisina directa termoestable (TDH) son patógenas. Los síntomas más frecuentes de transmisión alimentaria V. infección son parahaemolyticusdiarrea y dolor abdominal, seguido de náuseas, vómitos y fiebre. También se informa de dolor de cabeza y escalofríos. El período de incubación promedio es de 15 horas, pero puede ser de hasta 96 horas después del consumo de una cantidad suficiente de cepas patógenas 9. La enfermedad dura de dos a tres días. Los síntomas de la gastroenteritis causada por V. parahaemolyticus son en gran medida auto-limitante y, por tanto, un tratamiento especial no es necesario. Los casos leves de gastroenteritis pueden ser tratados eficazmente mediante rehidratación oral. Más enfermedades graves se pueden tratar con antibióticos tales como la tetraciclina o la ciprofloxacina 10. La tasa de mortalidad es de alrededor del 2% de los casos de gastroenteritis, pero puede ser tan alta como 29% para aquellos que desarrollan infección del torrente sanguíneo o septicemia. Cualquier persona que consume mariscos o tiene una herida abierta expuesta al agua de mar está en riesgo de V. infección parahaemolyticus. La forma más grave de enfermedades, septicemia que amenaza la vida, es más común en una subpoblación con co médico subyacentenditions 11, que incluyen el alcoholismo, enfermedad hepática, diabetes, enfermedad renal, enfermedad maligna, y otras condiciones que conducen a una respuesta inmune debilitado. Cabe destacar que este grupo de personas es también un riesgo mayor de contraer enfermedades graves causadas por V. vulnificus, que se puede encontrar en los hábitats naturales similares a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus se aísla de forma rutinaria usando agar sales de sacarosa tiosulfato-citrato-biliares (TCBS) como un medio selectivo y diferencial. El enriquecimiento en agua de peptona alcalina puede preceder el aislamiento en agar TCBS. presuntas colonias en TCBS se prueban aún más en una serie de pruebas bioquímicas y / o ensayos moleculares dirigidas a la presencia de genes específicos de cada especie. Métodos basados en PCR se utilizan a menudo para confirmar la identidad de V. parahaemolyticus mediante la amplificación del gen de la hemolisina termolábil, tlh 12. Independientemente de la choice de los métodos de confirmación, es importante tener un medio eficaz para aislar y diferenciar V. parahaemolyticus de otros vibrios marinos en el primer lugar. TCBS rutinariamente se ha utilizado para diferenciar las especies dentro del género Vibrio, según su capacidad para fermentar la sacarosa 12. Reacción de fermentación positiva se acompaña de un cambio de color del indicador de pH de bromotimol azul. V. colonias parahaemolyticus son bastante distintiva en TCBS, exhibiendo color de azul a verde. Sin embargo, este medio no puede diferenciar fácilmente V. alginolyticus y V. cholerae. especies de Proteus sacarosa-fermentación pueden producir colonias de color amarillo que se asemejan V. V. cholerae o Alginolyticus 13. El aislamiento inicial en TCBS, V. parahaemolyticus también se han identificado erróneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, y Pseudomonas spp 14. Las cepas con ferm sacarosa retardadaentación puede ser confundida con otra sacarosa no fermentadores Vibrio 13, que incluye V. parahaemolyticus. TCBS se encontró que no es sensible frente a Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, entre otros. Varias otras especies producen colonias verdes a grises que son potencialmente confundirse con V. V. parahaemolyticus o 15 vulnificus. Como resultado de ello, es deseable desarrollar medios de cultivo alternativa con mejor sensibilidad y especificidad hacia la detección y el aislamiento de V. parahaemolyticus y otras especies estrechamente relacionadas. Varias alternativas de medios de comunicación se han desarrollado recientemente. Además de la inclusión de agentes selectivos, la mayoría incorporan sustratos cromogénicos para diferenciar especies en base a sus actividades enzimáticas diferenciales. Por ejemplo, indoxilo-β-glucósido y de indoxilo-β-galactósido se han utilizado como los sustratos cromogénicos para diferenciar V. paracahaemolyticus colonias (que aparecen de color verde azulado) de las de V. cholerae (púrpura) debido a sus capacidades diferenciales para producir β-glucosidasa y β-galactosidasa 16. Diferentes formulaciones de agar cromogénico desarrolladas por varios grupos han sido evaluados y se informó para llevar a cabo de forma comparable a o mejor que TCBS 17,18,19. Una ventaja de usar un medio cromogénico es que la coloración del medio circundante es mínimo lo que facilita el aislamiento de colonias particulares. En este estudio, se evaluó la capacidad de un medio cromogénico de nueva formulación para detectar y aislar V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus; con un enfoque especial en su capacidad para diferenciar V. parahaemolyticus de otras especies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Reagent/Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BHI powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0418-17-7</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blender</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>to blend oyster meat</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CampyGen gas generator</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>CN035A</td>
			<td>to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chocolate agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>E14</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Culture tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50712</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S348903</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gel doc</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HardyChrom Vibrio agar plates</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td>G319</td>
			<td>This study evaluates this medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculating loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-606</td>
			<td>10 microliter-size was used in this study</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oysters</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R23701</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipette and tips</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Sterilized tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers for tlh</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spreader</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-11</td>
			<td>Beads may be used instead</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stomacher blender</td>
			<td>Stomacher</td>
			<td >400</td>
			<td>Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec.&#160; Other homogenizer can be used.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile filter bags for blenders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TCBS powder</td>
			<td>Hardy Diagnostics</td>
			<td >265020</td>
			<td>This study evaluates this medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocycler</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TSB powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0370-07-5</td>
			<td>may use other brands</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV viewing cabinet</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Emit long-wave UV light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Name</td>
			<td>Sources</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bacterial species and strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aeromonas hydrophila</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Candida albicans</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Campylobacter jejuni</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteus mirabilis</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Staphylococcus aureus</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Salmonella Choleraesuis</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella boydii</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella flexneri</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shigella sonnei</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vibrio alginolyticus</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars)</td>
			<td >FDA, ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. damsela</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. fisherii</td>
			<td >Environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. fluvialis</td>
			<td >CDC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. furnissii</td>
			<td >CDC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. hollisae</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. metschnikovii</td>
			<td >ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. mimicus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc)</td>
			<td >ATCC, FDA, CDC, Environment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. proteolyticus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >V. vulnificus</td>
			<td >FDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a more sensitive and specific chromogenic agar medium for the detection of vibrio parahaemolyticus and other vibrio species

Infecciones transmitidas por los alimentos en los EE.UU. causada por especies de Vibrio han mostrado una tendencia al alza. En el género Vibrio, V. parahaemolyticus es responsable de la mayoría de las infecciones -asociado Vibrio. Por lo tanto, la diferenciación precisa entre Vibrio spp. y la detección de V. parahaemolyticus es de vital importancia para garantizar la seguridad de nuestro suministro de alimentos. Aunque las técnicas moleculares son cada vez más comunes, métodos de cultivo a dependiendo todavía de forma rutinaria hecho y que se consideran métodos estándar en determinadas circunstancias. Por lo tanto, un nuevo medio de agar cromogénico fue probado con el objetivo de proporcionar un mejor método para el aislamiento y la diferenciación de Vibrio spp clínicamente relevante. El protocolo compara el límite de sensibilidad, especificidad y de detección para la detección de V. parahaemolyticus entre el nuevo medio cromogénico y un medio convencional. Varios V. parahaemolyticus cepas (n = 22) de reSe han usado presentar diversos serotipos y de la fuente de origen. Ellos fueron identificados previamente por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), y verificado aún más en nuestro laboratorio por TLH-PCR. En por lo menos cuatro ensayos separados, estas cepas se inocularon en el agar y tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa cromogénicos (TCBS) de agar, que es el medio recomendado para el cultivo de esta especie, seguido de incubación a 35-37 ° C durante 24 h -96. Tres V. parahaemolyticus cepas (13,6%) no crecieron de manera óptima en TCBS, no obstante, exhibieron colonias de color verde si había crecimiento. Dos cepas (9,1%) no dieron los esperados cian colonias en el agar cromogénico. V. no cepas parahaemolyticus (n = 32) también se probaron para determinar la especificidad de la agar cromogénico. Entre estas cepas, 31 no crecieron o exhibieron otras morfologías de colonias. La recuperación media de V. parahaemolyticus en el chromogenic agar fue de ~ 96,4% en relación con agar de soja tríptico suplementado con 2% de NaCl. En conclusión, el nuevo agar cromogénico es un medio eficaz para detectar V. parahaemolyticus y para diferenciarlo de otros vibrios.

En este estudio, 54 cepas microbianas fueron ensamblados, que incluyó 22 cepas dentro de la V. especies parahaemolyticus, Vibrio otras 19 especies, y 13 especies de Vibrio no (Tabla 1). La mayoría V. cepas parahaemolyticus se recibieron ya sea de la FDA, CDC u otros departamentos de salud estatales. Representan diversos serotipos y fuentes de aislamiento. Estas cepas fueron identificadas previamente por los organism...

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

14.4K vistas.  California Polytechnic State University. Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium. 

Video: Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

La colonización de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Investigación

Inmunología e Infección

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Un método para modificar genéticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectan pollos

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.