Este trabajo está financiado por becas NSERC a BK y RG. Los autores también desean agradecer a Kehe Xie y Russell Hosain por su experiencia tinción de Golgi-Cox.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y aprobados por la Universidad de Lethbridge, Comité de Cuidado de Animales. 1. Cría y Estímulo Táctil <ol><li> Solicite ratas preñadas a proveedores comunes de los animales o de criar cachorros en la casa utilizando los métodos convencionales de mejoramiento de laboratorio. </li><li> Casa todos los animales en una habitación con temperatura controlada de cría (21 ° C), mantenido en una luz 12:12 hr: oscuridad ciclo y proporcionar acceso a alimento y agua ad libitum. </li><li> Cuando nacen las crías, la casa de ratas hembras por separado con sus crías. </li><li> Para evitar el estrés adicional en relación con el manejo de inmediatamente después del parto, comenzará la estimulación táctil de los cachorros en P3. </li><li> La estimulación táctil debe llevarse a cabo tres veces al día (9:00 am, 13:00 y 16:00) a partir de P3-P21 y cachorros debe ser destetados de sus madres en P21. </li><li> Cuando se utiliza un diseño de camada cruz, la mitad de las crías de frOM cada camada se someterá a la estimulación táctil con el otro medio que sirve como controles. Asignar aleatoriamente igual número de cachorros machos y hembras a cada grupo. Para diferenciar las crías sometidas a estimulación y los controles táctiles, marcar un grupo de cachorros con un marcador permanente sobre las patas traseras y la cola. Marcado tiene que volver a aplicar cada dos días. </li></ol> Estímulo Táctil <ol start="7"><li> Retire las presas de su jaula y colocarlos en una jaula temporal con comida y agua. Mantenga la presa y la jaula temporal en la sala de cría / vivienda. </li><li> Pesar crías de ratas como grupo antes de la sesión de estimulación táctil de la mañana (9:00 am). Para cada sesión, rata transporte cachorros sus jaulas a una sala de pruebas independiente para la estimulación táctil. Coloque la jaula de alojamiento en un cojín de la calefacción que se establece en 24 ° C. </li><li> Use una tabla rígida para dividir la jaula de alojamiento en dos mitades. Coloque las crías de rata en los estimulación grupo uno medio y control cachorros táctiles en la otra mitad.Establecer un temporizador a 15 min. </li><li> El uso de un plumero de pluma-como suave, cepille todos los cachorros en el grupo de estimulación táctil al mismo tiempo durante 15 minutos consecutivos. Los jóvenes cachorros de rata (~ P3-P12) ususally acurrucan juntos y parecen entrar en un ciclo de sueño profundo por lo que es muy fácil para estimular todos los cachorros a la vez. A medida que la edad de las crías, se vuelven más activas, con algunos cachorros caminar e investigar durante la sesión. El experimentador debe moverse continuamente cachorros errantes en el grupo para asegurar que cada cachorro recibe estímulo igual. </li><li> Una vez que la sesión de 15 minutos se ha completado, el transporte de las crías de nuevo a la sala de reproducción y volver a la madre a la jaula. </li><li> Repita este proceso tres veces al día durante los 19 días de la estimulación táctil. Después de la sesión de estimulación táctil final en P21, los cachorros deben ser destetados de sus madres. Los cachorros deben luego ser alojados en jaulas con 5 o 6 otros animales destetados del mismo sexo. </li><li> Si las ratas son sometidos a ninguna prueba adicional, se deben dejar sinperturbado, en la luz normal: oscuridad ciclo con acceso a alimentos y agua ad libitm (aparte de limpieza de la jaula regular y manipulación) hasta que alcanzan unos 100 días de edad. Si sufrir otras manipulaciones experimentales, los animales deben ser tratados o sometidos a pruebas de conformidad con esos protocolos de laboratorio. </li></ol> 2. Sacrificio y Golgi-Cox tinción <ol><li> Aproximadamente a P100, administrar una sobredosis de pentobarbital de sodio a través de la inyección IP a las ratas y perfunden intracardially con aproximadamente 100 ml de solución salina 0,9%. </li><li> Extraer el cerebro cuando la perfusión se ha completado. Retire el cerebro del cráneo, cortar el nervio óptico por debajo con esfuerzo para mantener intacto el cerebelo; investigadores pueden optar por mantener o eliminar los bulbos olfatorios. Coloque cerebros extraídos en una botella de Nalgene opaco con 20 ml de solución de Golgi-Cox 14. </li><li> Mantener el cerebro en la solución de Golgi-Cox durante 14 días. Después de 14 días, reemplace el Golgi-Csolución de buey con una solución de sacarosa al 30%. Mantener el cerebro en la solución de sacarosa durante 2-5 días antes de la sección. </li></ol> Nota: Si el cerebro no pueden ser seccionados dentro de los 14 días de la transferencia de la solución de sacarosa, el investigador tiene que sustituir la sacarosa con un nuevo balance de 30% de sacarosa. El investigador puede sustituir a la sacarosa cada dos semanas durante 4 meses, sin efectos adversos en la tinción. <ol start="4"><li> Con el fin de la sección del cerebro, el cerebro debe ser borrado en seco y se fija a la fase de seccionamiento con pegamento cyanocacrylic. Para evitar que se desgarre o seccionamiento desigual, el investigador debe tener cuidado y asegurarse de que todo el cerebro esté bien sujeta a los escenarios. </li><li> El depósito vibrátomo debe ser llenado con solución de sacarosa al 6% a un nivel que cubre la cuchilla de seccionamiento. Establezca los parámetros vibratome a una velocidad y amplitud a 5, (el punto medio en ambas escalas). Cortar el cerebro en 200 micras secciones y colocar las secciones en un micro gelatinizada 2%diapositiva alcance. Asegúrese de mantener las secciones húmeda durante el curso de la sección. </li><li> Cuando todas las secciones de interés han sido recogidos, pulse las secciones sobre los portaobjetos mediante la aplicación de presión a las diapositivas con papel secante humedecido. Almacenar los portaobjetos en una rejilla deslizante en la cámara de humedad hasta que estén listos para ser manchado. Deben permanecer en la cámara de humedad durante al menos 12 horas, pero no más de 4 días. Las diapositivas deben estar húmedo y no se debe permitir que se seque. </li><li> Preparar el regimiento se vea antes de comenzar el proceso de tinción. Etiqueta doce platos de tinción de vidrio (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) y de proceso de la siguiente manera: <ol><li> Agua destilada - 1 min </li><li> Hidróxido de amonio - 30 min (en la oscuridad) </li><li> Agua destilada - 1 min </li><li> Kodak Fix for Film - 30 min (en la oscuridad) </li><li> Agua destilada - 1 min </li><li> 50% de alcohol - 1 min </li><li> 70% de alcohol - 1 min </li><li> 95% de alcohol - 1 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> Solución (1/3 del cloroformo, tercera HemoDe, tercera 100% de alcohol) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xileno se puede utilizar en sustitución de HemoDe. Con el fin de garantizar la calidad de la tinción consistente, las soluciones deben utilizarse para cada parrilla corrediza procesado. <ol start="8"><li> A raíz de los últimos 15 min emersión en HemoDe, cubreobjetos las diapositivas con Permount. </li><li> Deje que los portaobjetos se sequen al aire antes de examinar con un microscopio. </li></ol>

<ol>
	<li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+matters:+Brain,+behaviour,+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats.">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li><li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex.">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li><li>Wiesel, T., Hubel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat's+lateral+geniculate+body.">Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).</li><li>Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+effects+of+nicotine+on+the+developing+brain.">The dynamic effects of nicotine on the developing brain.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 122, 125-139 (2009).</li><li>Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+alters+behaviour+and+neuroanatomical+organization+of+normal+rats.">Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats.</a> Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).</li><li>Schanberg, S., Field, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+deprivation+stress+and+supplemental+stimulation+in+the+rat+pup+and+preterm+neonate.">Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate.</a> Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).</li><li>Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care+during+infancy+regulates+the+development+of+neural+systems+mediating+the+expression+of+fearfulness+in+the+rat.">Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).</li><li>Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+tactile+stimulation+reverses+the+effect+of+neonatal+isolation+on+open-field+and+anxiety-like+behavior,+and+pain+sensitivity+in+male+and+female+adult+Sprague-Dawley+rats.">Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats.</a> Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).</li><li>Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+promotes+motor+recovery+following+cortical+injury+in+adult+rats.">Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats.</a> Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).</li><li>Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+and+maternal+separation+prevent+hippocampal+damage+in+rats+submitted+to+neonatal+hypoxia-ischemia.">Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia.</a> Brain Research. 1002, 94-99 (2004).</li><li>Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+after+frontal+or+parietal+cortical+injury+in+infant+rats+facilitates+functional+recovery+and+produces+synaptic+changes+in+adjacent+cortex.">Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex.</a> Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).</li><li>Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactile+stimulation+during+development+attenuates+amphetamine+sensitization+and+structurally+reorganizes+prefrontal+cortex+and+striatum+in+a+sex-dependent+manner.">Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner.</a> Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).</li><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulla+struttura+della+sostanza+grigia+dell+cervello.">Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello.</a> Gaz Med Lomb. 33, 244-246 .</li><li>Glaser, E. M., van der Loos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thick+brain+sections+by+obverse-reverse+computer+microscopy:+Application+of+a+new,+high+clarity+Golgi-Nissl+stain.">Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).</li><li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain.">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).</li><li>Meaney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+care,+gene+expression,+and+the+transmission+of+individual+differences+in+stress+reactivity+across+generations.">Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).</li><li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Debido a la plasticidad explícita del cerebro en desarrollo, es importante que los procedimientos experimentales con experiencias tempranas son revisados ​​a fondo y se hacen intentos de controlar todas las variables que intervienen. Por esta razón, un diseño de camada cruz se emplea durante el procedimiento de estimulación táctil para asegurar que los cachorros están recibiendo experiencias similares en todos los demás dominios de desarrollo. Además, también es importante que múltiples crías de varias camadas, se seleccionan para el análisis para evitar la posibilidad de que los efectos son el resultado de un sesgo en una sola cría o arena. Se cree que la estimulación táctil para imitar el comportamiento de la madre natural, lamiendo y aseo personal, que se cree que es beneficioso para el desarrollo de la descendencia. Aunque investigaciones anteriores han hecho hincapié en la primera semana de vida (P0-P7) es un período crítico para lamer y aseo 16, la magnitud del cambio se identificará según 18 días de tactile estimulación puede implicar que aunque existen momentos sensibles, la exposición ya es superior. También es importante tener en cuenta que los cachorros que recibieron estimulación táctil en este paradigma experimental también experimentan lamiendo y aseo por sus madres, por lo tanto, la estimulación táctil es en adición a la estimulación normal de administrado por la madre. Por último, también hay que ser conscientes de los cambios de región que dependen. Aunque la estimulación táctil durante el desarrollo de la mayor complejidad dendrítica en la corteza prefrontal, esto no garantiza que los cambios estructurales de esta naturaleza serán evidentes en todas las regiones del cerebro. Es posible que la morfología neuronal en otras regiones del cerebro tales como la corteza parietal, respondería de una manera notablemente diferente a la misma experiencia. Sin embargo, debido a que el procedimiento de estimulación táctil es fácil de administrar y no representa ningún riesgo para la descendencia o presas, tiene el potencial de servir como una herramienta valiosa para muchos estudios de investigación destinados a mejorar el desarrolloAl resultados. Con respecto a la tinción de Golgi-Cox de tejido cerebral, los pasos críticos para la visualización con éxito de células neuronales son los siguientes: 1) debe existir una adecuada perfusión del cerebro con solución salina. Perfusión inadecuada o insuficiente de los resultados de tejido cerebral en los artefactos de los vasos sanguíneos que hacen que sea difícil de visualizar en realidad células neuronales a través del laberinto de los vasos sanguíneos, al tiempo que complica la capacidad de fotografiar las neuronas teñidas. 2) cerebros perfundidos se deben almacenar en solución de Golgi-Cox y solución de sacarosa en la oscuridad. Almacenamiento del tejido cerebral en la oscuridad reduce la tinción de fondo del tejido, incrementando de nuevo la oportunidad de visualizar con éxito las células neuronales de calidad. 3) El tejido cerebral se almacena en solución de sacarosa tras el almacenamiento de 14 días en solución de Golgi-Cox. Cuando el tejido se sumerge en la solución de sacarosa al 30% durante 2-5 días, los cerebros son más flexibles que impide rompiendo y el desgarro de las secciones cuandode corte. Es importante evitar que el tejido cerebral de que queda en la solución de sacarosa para el aumento de períodos de tiempo (a menos que la solución de sacarosa se sustituye continuamente con solución fresca) porque el almacenamiento prolongado en sacarosa reduce la calidad de la tinción. 4) Por último, una vez que las diapositivas han sido manchada y cubierta deslizado, se les debe dar suficiente tiempo para secarse antes de la visualización con un microscopio. Si no están permitidas las diapositivas para ventilar adecuadamente seco, el tejido puede oscurecerse, reduciendo la visualización satisfactoria de las neuronas corticales. Se cree que los cambios estables en funcionamiento psicológico y las respuestas de comportamiento que se producen en respuesta a las experiencias para ser facilitado por la reorganización de la morfología neuronal y conectividad sináptica 17. Como estos cambios estructurales proporcionan un recurso medible para la plasticidad dependiente de la experiencia, el uso de un procedimiento de tinción fiable es importante. Procedimiento de tinción de Golgi-Cox basado Esta vibratome ofrece mancha fiableción de las ramas finas y las espinas dendríticas que pueden no ser evidentes con otros protocolos como celoidina-incrustación. El distintivo del procedimiento de Golgi-Cox se debe a su capacidad única para teñir una pequeña fracción de los elementos neuronales (1-10%), lo que permite el seguimiento de las neuronas individuales para las largas distancias. A pesar del hecho de que sólo una pequeña fracción de las neuronas están impregnadas con la tinción, las células que se representan visible, mantienen todas las características incluyendo cuerpo celular, dendritas, espinas dendríticas y axones. Por otra parte, cuando el procedimiento de tinción se lleva a cabo correctamente, las células teñidas se destacan con claridad y distinción sobre un fondo transparente, ya otras estructuras corticales permanecen sin teñir y transparente. Debido a la comprensión de que los cambios persistentes en funcionamiento hacia el exterior deben estar relacionados con la plasticidad del sistema nervioso, es decir, la capacidad de las neuronas para modificar su estructura y la conectividad, el procedimiento de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores unatécnica fiable para visualizar y cuantificar la plasticidad.

Aunque hay muchas técnicas notificados y utilizados para el examen de las primeras experiencias negativas en la maduración del cerebro, tales como el estrés perinatal 1,2, la privación sensorial 3, y la toxicidad de drogas 4, hay muy pocas metodologías empleadas para examinar los efectos de las experiencias positivas en este período de tiempo. Aparte de enriquecimiento ambiental, estimulación táctil es uno de los pocos cerebro mejora de los tratamientos con efectos demostrados 5. La estimulación táctil es un método de estimulación sensorial de la piel que imita el comportamiento de las ratas materna, lamiendo y aseo personal. Su aceptación general como una manipulación positiva surge de estudios que indican que la estimulación táctil mejora la maduración de los bebés prematuros y ratas recién nacidas 6. Además, la investigación en el laboratorio Meaney 7 ha demostrado que los niveles más altos de lamido de la madre y el aseo están vinculados a los resultados positivos en los hijos. Debido a Tinfluencias positivas stos, estimulación táctil evolucionaron rápidamente en una estrategia de recuperación destinado a reducir la ansiedad 8, la mejora de los resultados asociados con lesión cerebral 9-11, y atenuando la sensibilización de drogas 12. Como tal, la estimulación táctil es una técnica valiosa para la promoción de las primeras experiencias positivas, con una probada capacidad para reorganizar drásticamente la morfología neuronal y la conectividad sináptica del cerebro en desarrollo. Con el fin de examinar y cuantificar los cambios en la morfología neuronal, que es necesario para visualizar las neuronas intactas. El procedimiento de tinción de Golgi-Cox es una modificación de la técnica de Camillo Golgi publicado a finales de 1800 que proporciona tinción discreta de un pequeño número de neuronas completas 13. Aunque el procedimiento parece manchar las neuronas al azar y reproducibilidad se cita comúnmente como principal defecto, el permiso de pequeña tasa de impregnación visualización de todo el elemento neuronal, incluyendo cecuerpos ll, dendritas, espinas dendríticas y axones. Del mismo modo, el tiempo requerido para impregnar un cerebro dado con una solución de Golgi también ha sido citada como una caída. Sin embargo, dado que una vez que la tinción es tejido completa se puede conservar indefinidamente, y el tiempo entre la perfusión del cerebro y la visualización de las neuronas con un microscopio se puede completar en menos de 21 días, el período de tiempo no es irrazonable. Además, con modificaciones menores en el protocolo, la tinción de Golgi-Cox se puede utilizar eficazmente para impregnar cerebros de roedores de todos los rangos de edad. Como los cambios a nivel estructural se han relacionado con las modificaciones persistentes para el funcionamiento conductual y psicológica, la técnica de tinción de Golgi-Cox proporciona a los investigadores una herramienta valiosa para medir la neuroplasticidad.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dichromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercuric Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1561</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak Rapid Fix</td>
			<td>Vistek</td>
			<td>Kodak 146 4016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH-95 &amp; Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>No Cat Numbers</td>
			<td>All other Et-OH are dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td>
			<td>Safeway</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Can be found at most grocery stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemoDe</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>23410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Sp15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-365</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>062011-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

Para generar cambios a largo plazo en el comportamiento, las experiencias deben estar produciendo cambios estables en la morfología neuronal y la conectividad sináptica. La estimulación táctil es una primera experiencia positiva que imita materno lamiendo y aseo en la rata. La exposición de las crías de rata a esta experiencia positiva se puede completar con facilidad y de manera rentable mediante el uso de materiales altamente accesibles, como un plumero hogar. Utilizando un diseño cruzado camada, los cachorros están bien acariciaron o molestar, durante 15 minutos, tres veces al día durante todo el período perinatal. Para medir los cambios neuroplásticos relacionados con esta primera experiencia positiva, se utiliza la tinción de Golgi-Cox del tejido cerebral. Debido al hecho de que de Golgi-Cox impregnación tiñe un número discreto de neuronas en vez de todas las células, la tinción del cerebro de roedores con solución de Golgi-Cox permite la visualización de elementos neuronales enteras, incluyendo el cuerpo celular, las dendritas, axones, y espinas dendríticas. El procedimiento de tinción is lleva a cabo durante varios días y requiere que el investigador prestar mucha atención a los detalles. Sin embargo, una vez que se haya completado la tinción, todo el cerebro se ha impregnado y puede ser conservada indefinidamente para el análisis en curso. Por lo tanto, la tinción de Golgi-Cox es un recurso valioso para el estudio de la experiencia que dependen de la plasticidad.

Cuando este procedimiento de tinción se ha seguido correctamente, se genera tinción coherente y uniforme de las dendritas y espinas. Ver Figura 1 para una representación de Golgi-Cox tinción neuronal. Este procedimiento produce tinción que es comparable a la recién desarrollado métodos in vitro y puede permitir la visualización de campos dendríticas que son ininterrumpida incrustación de tejido siguiente. La técnica basada vibrátomo para la tinción de Golgi-Cox se ha encontrado que produce tinción más generalizada de ramas terminales y las neuronas piramidales, que la tinción con cualquiera celoidina-incrustado y el tejido criostato-seccionada, 15. Además, ya que este método de tinción impregna todo el cerebro, todas las secciones pueden ser analizados ya sea inmediatamente o en el futuro. Como la ubicación del cambio morfológico es que no siempre es obvio cuando se genera una hipótesis original, este proceso permite la exploración de regiones cerebrales adicionales und impide la eliminación de tejido que puede ser útil en el futuro. Este método de tinción se puede utilizar para la tinción fiable de cualquier cerebros de ratas de edad (edad P0 de edad). Sin embargo, cuando la tinción de los cerebros jóvenes (&lt;1 gramo), el cerebro sólo debe permanecer en la solución de Golgi-Cox durante 6 días, en lugar de los 14 días recomendados para el cerebro adulto, todos los demás procedimientos se mantienen constantes. La principal dificultad que se pueden encontrar durante este proceso de tinción de Golgi-Cox es la incapacidad de producir la tinción de alta calidad de regiones centrales del cerebro, incluyendo el tálamo. Como todo el cerebro se impregna al mismo tiempo, las regiones centrales no pueden recibir las concentraciones ideales de mancha. A pesar de este hallazgo, la técnica de Golgi-Cox produce tinción excepcional de regiones subcorticales, tales como el hipocampo y el cuerpo estriado. Una limitación final del procedimiento surge de la eliminación incompleta de la sangre desde el cerebro durante el proceso de perfusión. La sangre puede producir artefactos en el tejido cerebraleso hace que sea difícil de fotografiar y trazar las neuronas. Técnicas de tinción de Golgi-Cox proporcionan una medida fiable de la morfología dendrítica y neuroanatomía que es útil para una amplia gama de estudios diseñados para examinar los cambios a nivel neuronal. Al examinar la estructura neuronal en la corteza prefrontal después de la estimulación táctil en el periodo postnatal temprano, la tinción de Golgi-Cox reveló un aumento espectacular en la complejidad dendrítica. Los cambios anatómicos relacionados con la estimulación táctil temprana se pueden demostrar visualmente mediante la comparación de la densidad de la espina dorsal de las neuronas piramidales de una rata de control para neuronas piramidales de una rata que se sometió a la estimulación táctil (véase la Figura 1). Además, los parámetros tales como la arborización dendrítica, la longitud dendrítica, y la densidad de la columna vertebral pueden ser calculados y analizados estadísticamente para generar datos continuo que puede ser comparado a través de los animales. Para generar resultados fiables, el análisis debe llevarse a cabo en la mañanainimum de tres animales por grupo de tratamiento y aproximadamente cinco neuronas por hemisferio debe ser seleccionado al azar para cada región del cerebro que se analiza. Figura 2 demuestra la complejidad dendrítica (espinas / m x m de dendritas) de los animales que recibieron la estimulación y los animales que no lo hicieron táctil . En los dos campos apicales y basales de las neuronas analizadas desde el córtex prefrontal medial (CG3), estimulación táctil se tradujo en la proliferación de los parámetros neuronales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografía A. Representante de Golgi-Cox manchada neurona piramidal de la capa III de la zona CG3 en una rata que recibió estimulación táctil durante el desarrollo. B. Representante amplíe (1.000 X) fotografía de espinas dendríticas en las dendritas de terminales en el campo de la basilar CG3 ; la imagen más clara de la izquierda es para una rata en el grupo de control y la imagen más oscura en la RIght es de una rata que recibió estimulación táctil. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> Figura 2. Representación ilustrativa de la complejidad dendrítica apical y basilar media (espinas / m x m) para las neuronas en el área CG3 de ratas adultas que, o bien recibieron estimulación táctil durante el desarrollo o no lo hicieron (* p &lt;0,01).

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Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

En este trabajo se describen los procedimientos para la estimulación táctil de crías de rata y la posterior tinción de Golgi-Cox de la morfología neuronal. Estímulo táctil es una experiencia positiva que se administra en el periodo perinatal por acariciar cachorros con un plumero hogar. Tinción de Golgi-Cox es un procedimiento confiable que permite la visualización de las neuronas enteras.

Visualización de los Efectos de una experiencia inicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

visualizing-effects-positive-early-experience-tactile-stimulation-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K vistas.  University of Lethbridge.  En este trabajo se describen los procedimientos para la estimulación táctil de crías de rata y la posterior tinción de Golgi-Cox de la morfología neuronal. Estímulo táctil es una experiencia positiva que se administra en el periodo perinatal por acariciar cachorros con un plumero hogar. Tinción de Golgi-Cox es un procedimiento confiable que permite la visualización de las neuronas enteras. 

Video: Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

La dependencia estatal Efectos sobre la EMT: Una mirada a la conducta motriz fosfeno

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Investigación

Neurociencias

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Efectos de la corriente alterna la estimulación transcraneal en la corteza de Motor primaria por Online enfoque combinado con la estimulación magnética transcraneal

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Visualizar el colapso del cono de crecimiento Axonal y temprano efectos β amiloidea en las neuronas de ratón cultivadas

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...