Damos las gracias a la Dra. Agnes Viale y el Laboratorio de Genómica MSKCC para la asistencia técnica. Este protocolo ha sido desarrollado con el apoyo del Centro de Investigación del Cáncer Geoffrey Beene y la Fundación Agricultores familia.

1. ADN y Preparación de los reactivos Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis simultáneo de 24 muestras (por ejemplo, 12 pares normales / tumorales), pero puede ser adaptado para lotes más pequeños y más grandes. Las muestras de ADN pueden derivar de FFPE o tejido fresco congelado, especímenes citológicos, o sangre. Típicamente, tanto del tumor y el tejido normal del mismo paciente se perfilan juntos con el fin de distinguir las mutaciones somáticas de los polimorfismos heredados. El protocolo comienza inmediatamente después de la extracción de ADN. <ol><li> Alícuota de 50-250 ng (250 ng recomendado) de ADN extraído por muestra, diluida en 1X Tris-EDTA (pH 8,0) tampón a un volumen final de 50 l, en tubos de fondo redondo Covaris separadas. </li><li> Cortar el ADN en el instrumento Covaris E220 con los siguientes ajustes de corte: 360 segundos a 10 factor de trabajo, 175 de PIP y 200 ciclos por ráfaga. </li><li> Descongele Beads XP AMPure (Tabla 2) a temperatura ambiente. Descongele todos bufertas y enzimas en hielo antes de la etapa apropiada. </li></ol> 2. Módulo Reparación End - Preparación Biblioteca <ol><li> Prepare la mezcla maestra reparación fin en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 10 l de 10x NEBNext End Reaction Buffer Reparación (Tabla 2), 5 l NEBNext End Repair Enzyme Mix (Tabla 2), 35 l de nucleasa estéril libre de H 2 O. </li><li> Alícuota de los 50 l de cada ADN cortado en pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Añadir 50 l de la mezcla maestra de reparación final preparado para cada reacción. Incubar en un termociclador durante 30 min a 20 ° C. </li></ol> 3. Mensaje End Repair Limpieza <ol><li> Añadir un volumen de 2x (200 l) de los granos XP AMPure (Tabla 2) a cada muestra y pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces usando una pipeta multicanal. Incubar a TA durante 15 min. </li><li> Coloque en el soporte magnético (Tabla 2 </fuerte&gt;) a TA durante 15 min hasta que la muestra aparece clara. </li><li> Retire con cuidado y deseche toma sobrenadante claro cuidado de no molestar a los granos. Un poco de líquido puede permanecer en los pozos. </li><li> Con tubos en el soporte, agregar suavemente 200 l de etanol recién preparada 80% a cada muestra y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 30 seg. Con cuidado, separar el etanol mediante una pipeta. </li><li> Repita el paso 5, para un total de 2 lavados con etanol. Asegúrese de que todo el etanol se ha eliminado. Retirar del soporte magnético y dejar secar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Resuspender perlas secas con 44,5 l H 2 O. estéril Suavemente, toda pipeta de volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces mezclando bien. Asegurarse de perlas se ya no adheridas al lado del pozo. </li><li> Incubar perlas se resuspendieron a TA durante 2 min. Coloque el soporte magnético durante 5 minutos hasta que la muestra parece clara. </li><li> Transferir suavemente 42 l de sobrenadante claro que contiene la muestra a un nuevo pozo. El procedimiento puede hacerse sin riesgo en este ptep y muestras almacenadas a -20 ° C durante un máximo de 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de proceder. </li></ol> 4. Preparación Biblioteca - Módulo dA-tizón <ol><li> Preparar la mezcla maestra dA-tizón en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 5 l de 10x NEBNext Reacción dA-tizón Buffer (Tabla 2), 3 l (3&#39;-5 &#39;exo-) Klenow Fragment (Tabla 2 ). </li><li> Añadir 8 l de la mezcla maestra dA-tizón preparada a cada pocillo que contiene 42 l de ADN reparado en sus extremos. Incubar en un termociclador durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lleve a cabo un post-dA Tailing limpieza: Repita los pasos 3.1 a 3.8 usando volumen 2x (100 l) de cuentas, pero se vuelve a suspender en H2O estéril hasta un volumen final de 33.75 l. El procedimiento se puede detener de forma segura en este paso y las muestras almacenadas a -20 ° C durante hasta 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de continuar. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Preparación Biblioteca - Módulo adaptador de ligadura <ol><li> Preparar la mezcla maestra ligadura en un tubo de microcentrífuga estéril utilizando los siguientes volúmenes por muestra: 10 l de 5x NEBNext Ligadura Quick Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabla 2), 5 l Quick T4 ADN ligasa (Tabla 2). </li><li> Añadir 15 l de la mezcla maestra ligadura a cada pocillo que contiene el ADN Colas dA. </li><li> Añadir 1,25 l de la 25 adaptador de código de barras M NEXTflex apropiada (Tabla 2) a cada pocillo. Cada muestra debe recibir un adaptador con código de barras separado. Incubar en un termociclador durante 15 min a 20 ° C. </li><li> Realice una ligadura de adaptador de post limpieza: Repita los pasos 3.1 hasta 3.8 utilizando 1 x volumen (50 l) de cuentas, pero se vuelve a suspender en H2O estéril hasta un volumen final de 50 l. </li><li> Repita los pasos 3.1 a 3.8 para un segundo volumen 1x (50 l) de limpieza, pero se vuelve a suspender en H2O estéril a unavolumen final de 23 l. El procedimiento se puede detener de forma segura en este paso y las muestras almacenadas a -20 ° C durante hasta 7 días. Para reiniciar, descongelar las muestras congeladas en hielo antes de proceder. </li></ol> 6. Amplificación Biblioteca <ol><li> Preparar la mezcla maestra KAPA de alta fidelidad en un tubo de microcentrífuga estéril usando los siguientes volúmenes por muestra: 25 l 2x KAPA alta fidelidad SA RM (Tabla 2), 1 l cada uno de 100 M Cebador 1 y Cebador 2 (Tabla 3). </li><li> Añadir 27 l de la mezcla maestra a cada pocillo que contiene el producto de ligación. Establecer pipeta para 50 l y suavemente con la pipeta el volumen arriba y abajo 10 veces. </li><li> Colocar en el termociclador para los siguientes ciclos de PCR: desnaturalización inicial de 45 segundos a 98 ° C, 10 ciclos de 15 segundos a 98 ° C, 30 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, y extensión final de 1 min a 72 ° C. </li><li> Lleve a cabo una amplificación posterior limpieza: Repita los pasos 3.1 a 3.8 usando1 x volumen (50 l) de los granos AMPure XP, y resuspender en agua estéril a un volumen final de 30 l. </li><li> Cuantificar la concentración de cada biblioteca utilizando Qubit Ensayo de Rango amplio (Life Technologies, Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca hibridación, lavado, y amplificación <ol><li> Descongele los bloqueadores de oligonucleótidos universales e índice (Tabla 3), SeqCap EZ Biblioteca y componentes de captura NimbleGen (ADN COT, del tampón de hibridación 2x, y el componente de hibridación A, Tabla 2) en el hielo. Todos los bloqueadores de oligonucleótidos se almacenan en acciones de trabajo de 1 mM. Nuestro SeqCap EZ Library es una piscina de diseño personalizado de sondas de captura que abarcan todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes asociados con el cáncer, aunque otros diseños personalizados y catálogos pueden ser utilizados. </li><li> Prepare una piscina de 1 mM de los bloqueadores de oligonucleótidos índice correspondientes a la publicidad con código de barras específicosecuencias Aptor utilizados en la preparación de la biblioteca. Combine 1 l de cada bloqueador, y agitar. </li><li> En un nuevo tubo estéril de 1.5 ml, añadir 5 l de ADN COT 1mg/ml, 2 l de 1 mM bloqueador universal y 2 l de la piscina 1 mM de los bloqueadores de oligonucleótidos índice. </li><li> Piscina 24 bibliotecas con código de barras en una sola reacción. Añade un total de 1-3 g de agrupado, biblioteca de secuencias de código de barras (preparado anteriormente) a la mezcla de la captura. Para 24 muestras, se recomienda 100 ng por muestra. Cuando se combinaron los tumores y las muestras normales emparejados, se recomienda la adición de más biblioteca de tumor (por ejemplo 100 ng por tumor y 50 ng por normal) para que se secuencian a una mayor profundidad de la cobertura. </li><li> Cerrar la tapa del tubo y hacer 15-20 agujeros en la parte superior de la tapa con un 18-20 G o aguja más pequeña. Speed ​​Vac las muestras biblioteca / COT ADN / oligos amplificados en un concentrador de vacío de ADN a temperatura alta (60 ° C). </li><li> Una vez secado completamente abajo, rehidratar con 7,5 l de 2x hibridaciónamortiguar zación y 3 l de hibridación componente A. El tubo ahora debe contener lo siguiente: 5 g de ADN COT, g variable de biblioteca muestra amplificada, 1000 pmol de Universal y Índice Oligos, tampón 7,5 l 2x hibridación, 3 componente l hibridación A en un volumen total de 10,5 l. </li><li> Cubra los orificios de la tapa con un pequeño trozo de cinta de laboratorio. Vortex la muestra durante 10 segundos y se centrifuga a la velocidad máxima durante 10 s. </li><li> Incubar la muestra a 95 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN, seguido por centrifugación a velocidad máxima durante 10 segundos a TA. </li><li> En un nuevo tubo de tiras PCR 0,2 ml, prepare 2,25 l alícuota de SeqCap EZ sondas de captura Biblioteca y 2,25 l de estéril libre de nucleasa H 2 O y añadir los contenidos de la etapa 7.7. Pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 10 veces. </li><li> Incubar en un termociclador a 47 ° C durante 48-96 horas. Establecer y mantener la temperatura de la tapa del termociclador a 57 ° C. </li><li> Folbajos pasos del Capítulo 6 de la Guía v3.0 del SR del usuario NimbleGen SeqCap EX Library (Tabla 2) para el lavado y la recuperación del ADN capturado. </li><li> Sigue los pasos en el capítulo 7 del protocolo Roche NimbleGen para la amplificación del ADN capturado con las siguientes modificaciones: <ul type="disc"><li> Utilice 2x KAPA de alta fidelidad de la polimerasa (Tabla 2) en lugar de Phusion de alta fidelidad PCR Master Mix </li><li> Utilice 100 M Primer 1 y 2 Primer listado en la Tabla 3. </li><li> Ejecute las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 98 ° C durante 30 segundos, 11 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos, y de extensión final a 72 ° C durante 5 min . Mantener a 4 ° C. </li></ul></li><li> Cuantificar la concentración del ADN capturado amplificado utilizando alta sensibilidad de ensayo Qubit (Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Analizar la calidad del ADN capturado utilizando Agilent Biochip de analizador de ADN HS (Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ul type="disc"><li> El rendimiento de PCR debe ser de al menos 100 ng (rango de 100-1.000 ng). </li><li> La longitud media de fragmento debe ser de entre 150-400 pares de bases. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hola-Seq Secuenciación <ol><li> Diluir el ADN capturado amplificada a 14:00, y la carga de la muestra en un solo carril de una celda de flujo Illumina HiSeq 2000. Secuencia de extremo emparejado 75 pares de bases lee de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En nuestra experiencia, un carril es suficiente para producir 500-700x única cobertura de secuencia por muestra a través de 279 genes para una piscina de 24 muestras. </li><li> Software Illumina (análisis en tiempo real) convertirá las imágenes de alta resolución para las intensidades de racimo basar las llamadas y sus niveles de calidad. Utilice Casava para demultiplexar datos de acuerdo con la identidad del código de barras y generar archivos de FASTQ individuales para cada muestra. </li></ol> 9. Datos Anallisis <ol><li> Secuencias adaptadoras del ajuste del extremo 3 &#39;de la secuencia se lee en los archivos FASTQ utilizando Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La longitud de solape mínima (-O) es 3 con una tasa de error (-E) de 1%. La longitud mínima de la base para la retención de emparejado lee después del corte es de 25. </li><li> Alinear secuencia lee a los de referencia hg19 genoma humano utilizando la herramienta de Burrows-Wheeler alineador (BWA) 12. Realice los pasos de post-procesamiento, incluyendo el marcado duplicado, múltiples locales secuencia de realineamiento y recalibración puntuación de calidad de base utilizando el kit de herramientas de Análisis Genómico (GATK) de acuerdo con las mejores prácticas estándar ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = mejores prácticas</a> ) 13. Al perfilar varias muestras del mismo paciente (por ejemplo, tumor emparejado y normales), múltiples locales secuencia reajuste debe ser rendimientoMED conjuntamente. La salida de estos pasos de procesamiento posterior es un archivo de BAM diferente para cada muestra, que contiene toda la secuencia, la calidad, y la información de alineación y se puede cargar directamente en la Genómica Integrativa Viewer (IGV) para la visualización de lecturas y variantes de secuencia 14. </li><li> Calcular los parámetros de rendimiento de la secuencia utilizando herramientas Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Métricas informativas incluyen tasa de alineación, distribución de tamaño de fragmento, GC-contenido asociado sesgo de cobertura, la especificidad de captura en el blanco, PCR duplica la tasa, la complejidad de la biblioteca, y la media de cobertura objetivo. Los valores representativos se muestran en la Figura 1. Las frecuencias alélicas en sitios de polimorfismo comunes calculados utilizando DepthOfCoverage de GATK se utilizan para controlar la contaminación de ADN ajeno y para garantizar que los diferentes muestras provenían de los mismos pacientes. Los siguientes análisis computacional dependen de la presencia de emparejadomuestras tumorales y normales para la detección de alteraciones genéticas somáticas. Tumores sin igual también se pueden analizar usando una muestra separada de control normal, pero las mutaciones somáticas no pueden más fácilmente ser distinguidos de variantes de la secuencia heredados. </li><li> Llame a variantes de nucleótido único somáticas (SNVS) para cada par de tumor normal usando una persona que llama mutación somática, tal como muTect 15, SomaticSniper 16, o Strelka 17. Utilizamos muTect con criterios de filtrado modificados, lo que permite variantes con bajo (distinto de cero) los recuentos de los alelos en la muestra normal, siempre y cuando la frecuencia del alelo es por lo menos 5 veces mayor en el tumor. Variantes recurrentemente llamados en un panel de ADN normales se eliminan como artefactos sistemáticas probables de la secuenciación o la alineación. Cada SNV pasando filtros es luego revisado cuidadosamente con IGV. </li><li> Llame indeles somáticas para cada par de tumor normal usando algoritmos tales como SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, o 19 SOAPindel </sup&gt;. Utilizamos SomaticIndelDetector con los siguientes criterios: al menos 10% frecuencia del alelo con al menos 3 de soporte lee, o al menos 2% Frecuencia de alelo con al menos 10 lecturas de apoyo. Nos permitimos para indeles con bajo (distinto de cero) los recuentos de los alelos en la muestra normal, siempre y cuando la frecuencia del alelo es por lo menos 5 veces mayor en el tumor. Indeles llamados en un panel de ADNs normales se eliminan, como anteriormente. Cada indel pasando filtros es luego revisado cuidadosamente con IGV. </li><li> Extrapolar copia estado número en la secuencia de la cobertura en los exones objetivo. Para cada muestra individual, realizar una normalización loess de la cobertura media de secuencia para todos los exones objetivo, la regresión sobre porcentaje GC. Ajuste los valores de cobertura unnormalized restando el ajuste Loess y la adición de la cobertura promedio en toda la muestra. Calcular la relación de cobertura de secuencia normalizada en todos los exones objetivo para pares de tumor normal. En ausencia de una muestra normal correspondiente y / o para disminuir el ruido, otra diploide género coincide conlos controles normales que carecen de variantes de número de copias de la línea germinal se pueden utilizar. Determinar las ganancias y pérdidas de número de copias somáticas sobre la base de los aumentos o disminuciones en la tasa de cobertura. </li><li> Llame a reordenamientos somáticos relacionados con los genes del cáncer en la que al menos un punto de interrupción genómico cae dentro o cerca de un intervalo específico del genoma. Algoritmos sugeridos incluyen GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22 y Dranger 23. Inversiones intracromosomal, deleciones y duplicaciones en tándem se pueden distinguir sobre la base de la posición relativa y la orientación de apoyo lee en pares discordantes. Todos los reordenamientos candidatos deben ser revisados ​​manualmente con IGV. Recomendamos validación experimental por PCR y secuenciación de Sanger a través de los puntos de interrupción de reordenamiento putativos. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Dr. Berger ha recibido honorarios de consultoría y fondos de investigación de Medicina de la Fundación, una compañía de diagnóstico de cáncer.

Nuestro ensayo IMPACT produce una alta tasa de alineación, la alta tasa en el blanco, la meta de cobertura alta, y alta sensibilidad para detectar mutaciones, indeles y copiar alteraciones numéricas. Hemos demostrado la capacidad de nuestro ensayo IMPACT secuencia de ADN de ambos helado en fresco y archivado muestras de FFPE de entrada de baja ADN. Mediante la realización de secuenciación dirigida exón de los genes clave asociados con el cáncer, se puede lograr una cobertura de secuencia muy profundo para los exon...

La identificación de &quot;conductor&quot; eventos genéticos tumorales en oncogenes clave y genes supresores de tumores juega un papel esencial en el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer 1. Los esfuerzos de investigación a gran escala que utilizan la secuenciación masiva en paralelo &quot;de nueva generación&quot; han permitido la identificación de muchos de estos genes asociados con el cáncer en los últimos años 2. Sin embargo, estas plataformas de secuenciación típicamente requieren grandes cantidades de ADN aisladas a partir de tejidos congelados frescos, lo que plantea una limitación importante en la caracterización y análisis de mutaciones de ADN de tejidos conservados, tales como parafina fijado con formalina incrustado (FFPE) muestras de tumor. La mejora de los esfuerzos para caracterizar de manera eficiente y confiable de la información genómica &quot;recurribles&quot; de muestras de tumores FFPE permitirán el análisis retrospectivo de muestras previamente caballones y seguir fomentando enfoques individualizados para el manejo del cáncer. Tradicionalmente, d molecularlaboratorios iagnostic se han basado en metodologías de bajo rendimiento que requieren mucho tiempo, como la secuenciación de Sanger y PCR en tiempo real para el perfil de mutación del ADN. Más recientemente, los métodos de mayor rendimiento que utilizan PCR multiplexada o determinación del genotipo de espectrometría de masas se han desarrollado para investigar mutaciones somáticas recurrentes en los genes del cáncer clave 3-5. Estos enfoques, sin embargo, están limitados en que sólo las mutaciones predesignadas &quot;punto caliente&quot; se ensayan, que los hace inadecuados para la detección de mutaciones inactivadoras en los genes supresores de tumores. Secuenciación masiva en paralelo ofrece varias ventajas con respecto a estas estrategias que incluyen la posibilidad de interrogar a los exones enteros para las mutaciones tanto comunes como poco frecuentes, la capacidad de revelar las clases adicionales de alteraciones genómicas tales como las ganancias y pérdidas de número de copias, y una mayor sensibilidad de detección en muestras heterogéneas 6, 7 . La secuenciación del genoma entero representa el enfoque más completo para el descubrimiento de la mutación, aunque es relativamente costoso y incurre grandes demandas computacionales para el análisis y el almacenamiento de datos. Para aplicaciones clínicas, en los que sólo una pequeña fracción del genoma puede ser de interés clínico, dos innovaciones particulares en la tecnología de secuenciación han sido transformadora. En primer lugar, a través de la hibridación con sede en el exón captura, se puede aislar el ADN correspondiente a los genes clave asociados con el cáncer de apuntado perfiles mutación 8,. En segundo lugar, a través de la ligadura de los códigos de barras moleculares (es decir, secuencias de ADN de 6-8 nucleótidos de longitud), se puede agrupar cientos de muestras por corrida secuenciación y aprovechar al máximo la capacidad cada vez mayor de instrumentos de secuenciación masivamente paralelo 10. Cuando se combinan, estas innovaciones permiten que los tumores ser perfilado para un menor coste y con mayor rendimiento, con requisitos de cómputo más pequeños 11. Además, mediante la redistribución de la cobertura de secuencia de sólo los genes más importantes para la aplicación particular, uno puede ACHIEve más a fondo la secuenciación para una mayor sensibilidad de detección para eventos de baja frecuencia de los alelos. Aquí describimos nuestro ensayo IMPACT (Integrated Mutación de perfiles de objetivos de cáncer Actionable), que utiliza la captura de códigos de barras en el exón piscinas biblioteca secuencia mediante hibridación utilizando oligonucleótidos personalizados para capturar todos los exones codificadores de proteínas y seleccione intrones de 279 genes claves asociados con el cáncer (Tabla 1 ). Esta estrategia permite la identificación de mutaciones, indeles, alteraciones del número de copias y seleccione reajustes estructurales que implican estos 279 genes. Nuestro método es compatible con el ADN aislado de tanto tejido congelado y FFPE fresca, así como aspirados con aguja fina y otras muestras de citología.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Los esfuerzos para detectar e investigar las mutaciones oncogénicas clave han demostrado su utilidad para facilitar el tratamiento adecuado para los pacientes con cáncer. El establecimiento de alto rendimiento, la secuenciación masiva en paralelo &quot;de nueva generación&quot; ha ayudado al descubrimiento de muchas de estas mutaciones. Para aumentar la utilidad clínica y traslacional de esta tecnología, las plataformas deben ser de alto rendimiento, rentable y compatible con parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) muestras de tejido que pueden producir pequeñas cantidades de ADN degradado o dañado. Aquí se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y multiplexados seguido de captura basados ​​en la hibridación de los exones específicos para la detección de mutaciones asociadas con el cáncer en los tumores congelados y frescos por FFPE secuenciación masiva en paralelo. Este método permite la identificación de mutaciones en la secuencia, copia alteraciones numéricas y seleccionar reajustes estructurales que involucran todos los genes específicos. Targeted secuenciación del exón ofrece tse beneficia de un alto rendimiento, bajo costo, y la cobertura de secuencia de profundidad, lo que confiere una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Una piscina de 24 bibliotecas de secuencias de código de barras (12 pares-tumorales normales) fue capturado utilizando sondas correspondientes a todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes del cáncer y se secuenció como 2 x 75 pb lee en un solo carril de una celda de flujo HiSeq 2000. El tumor y bibliotecas normales se agruparon en una proporción de 2:1. Métricas de rendimiento de la muestra para un grupo de muestras de ADN de tumores congelados se muestran en la Figura 1, incluyendo l...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de &quot;próxima generación&quot;. Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K vistas.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad par...

Video: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH

Investigación

Biología

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Lineal Amplificación Mediada por PCR - Localización de elementos genéticos y caracterización de ADN que flanquean Desconocido

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensayos Reporteros Massively Parallel en células de mamífero cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.