우리는 기술 지원을 박사 아그네스 알레와 MSKCC 유전체학 코어 실험실 감사합니다. 이 프로토콜은 제프리 Beene 암 연구 센터와 농부 가족 재단의 지원으로 개발되었다.

1. DNA 및 시약 준비 참고 :이 프로토콜은 24 샘플 (예를 들면 12 종양 / 보통 쌍)의 동시 처리 및 분석을 설명하지만, 작고 큰 일괄 작업에 적용 할 수 있습니다. DNA 샘플은 FFPE 또는 냉동 조직, 세포 학적 표본, 또는 혈액에서 파생 수 있습니다. 일반적으로, 동일 환자에서 종양 및 정상 조직 둘 상속 다형성에서 체세포 돌연변이를 구별하기 위해 함께 파일링한다. 프로토콜은 즉시 DNA 추출을 따라 시작된다. <ol><li> 나누어지는 50 ~ 250 NG 1X 트리스-EDTA에 희석 샘플 당 추출 된 DNA (산도 8.0) 별도의 Covaris 둥근 바닥 튜브에 50 μL의 최종 볼륨에 버퍼 (250 권장 NG). </li><li> 10 듀티 계수, 175 PIP 및 버스트 당 200주기 360 초 : 다음 전단 설정에 Covaris E220 악기의 DNA 전단. </li><li> 실온으로 AMPure XP를 구슬로 장식한다 (표 2) 해동. 모든 BU 해동이전에 적절한 단계에 얼음 ffers과 효소. </li></ol> 2. 도서관 준비 - 최종 수리 모듈 <ol><li> 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에 최종 수리 마스터 믹스를 준비 : 배 NEBNext 최종 수리 반응 버퍼 (표 2)의 10 μl를, 5 μL NEBNext 끝 효소 믹스 (표 2) 수리, 35 ㎕의 멸균 클레아 무료 H 2 O. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 각 전단 DNA의 50 μl를 나누어지는. 각 반응으로 제조 된 최종 수리 마스터 믹스 50 μl를 추가합니다. 20 ℃에서 30 분 동안 열 순환기에 품다 </li></ol> 3. 포스트 최종 수리 정리 <ol><li> 각 샘플에 AMPure XP를 구슬로 장식한다 (표 2)의 2 배 볼륨 (200 μL)를 추가하고 온화하게 멀티 채널 피펫을 사용하여 아래로 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 자기 대 (표 2에 배치 </샘플 클리어 나타날 때까지 15 분 동안 RT에서)&gt; 강한. </li><li> 부드럽게 제거하고 구슬을 방해하지 상등액 복용 치료를 버린다. 어떤 액체가 우물에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 스탠드에 튜브로 부드럽게 각각의 샘플에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μl를 추가하고 30 초 동안 실온에서 접시를 품어. 조심스럽게 피펫으로 에탄올을 제거합니다. </li><li> 2 에탄올 세척 총 5 단계를 반복합니다. 확인 모든 에탄올이 제거되었습니다. 자기 스탠드에서 제거하고 5 분 동안 실온에서 건조시켜주십시오. </li><li> 44.5 ㎕의 멸균 H 2 O로 건조 구슬을 재현 탁 조심스럽게 피펫 전체 볼륨 위아래로 10 배 철저하게 혼합. 확인 비드 더이상 웰의 측면에 부착되지 않는다. </li><li> 2 분 동안 실온에서 재 부유 구슬을 품어. 샘플 분명히 나타날 때까지 5 분 동안 자기 스탠드에 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 웰에 샘플을 포함하는 상등액 42 μl를 전송합니다. 이 절차는 안전이 성에서 중지 될 수 있습니다EP 최대 7 일 -20 ° C에서 저장 샘플. 다시 시작하기 전에 얼음에 냉동 샘플을 해동합니다. </li></ol> 4. 도서관 준비 - 다 - 미행 모듈 <ol><li> 배 NEBNext DA-미행 반응 버퍼 (표 2), 3 μL (3&#39;-5 &#39;엑소) 클레 나우 조각 (표 2의 5 μL : 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에서 DA-미행 마스터 믹스를 준비합니다 ). </li><li> 각이 잘 최종 수리 DNA의 42 μl를 포함에 준비된 DA-미행 마스터 믹스 13 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 30 분 동안 열 순환기에 품다 </li><li> 된 DA-미행 게시물을 수행 청소 : 반복 33.75 μL의 최종 볼륨 멸균 H 2 O의 2 배 구슬의 양 (100 μL) 만에 resuspend를 사용하여 3.1-3.8 단계를 반복합니다. 이 절차는 안전이 단계 최대 7 일 -20 ° C에서 보관 샘플을 중지 할 수 있습니다. 다시 시작 진행하기 전에 얼음에 냉동 샘플을 해동합니다. &lt;/ 리&gt; </ol> 5. 도서관 준비 - 어댑터 내고 모듈 <ol><li> 배 NEBNext 빠른 내고 반응 버퍼 (뉴 잉글랜드 바이오 랩스, 표 2), 5 ㎕의 빠른 T4 DNA 리가 제 (표 2) 10 μL : 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에서 결찰 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 각이 잘 DA-꼬리가 달린 DNA를 포함하여 결찰 마스터 믹스의 15 μl를 추가합니다. </li><li> 물론 각각에 해당하는 25 μM NEXTflex 바코드 어댑터 (표 2)의 1.25 μl를 추가합니다. 각 샘플은 별도의 바코드 어댑터를 받아야한다. 20 ℃에서 15 분 동안 열 순환기에 품다 </li><li> 50 μL의 최종 볼륨에 멸균 H 2 O의 반복 구슬의 1X 볼륨 (50 μL)을 사용하여 3.1-3.8 단계 만에 resuspend : 포스트 어댑터 내고 청소를 수행합니다. </li><li> 반복 두 번째 1X 볼륨 (50 μL) 청소를위한 3.1-3.8 단계 만에 멸균 H에 재현 탁 2 O23 μL의 최종 볼륨. 이 절차는 안전이 단계 최대 7 일 -20 ° C에서 보관 샘플을 중지 할 수 있습니다. 다시 시작하기 전에 얼음에 냉동 샘플을 해동합니다. </li></ol> 6. 도서관 증폭 <ol><li> 25 ㎕의 2 배 KAPA 고음질 HS RM (표 2), 1 ㎕를 100 μM 프라이머 1 프라이머 2 (표 3) 각 : 샘플마다 다음과 같은 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에서 KAPA 고음질 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 각이 잘 내고 제품을 포함하여 마스터 믹스의 27 μl를 추가합니다. 50 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 배 전체 볼륨을 피펫. </li><li> 다음 PCR 사이클의 열 순환기에 배치 : 98 ° C에서 45 초 동안 변성, 98 ° C, 60 ° C에서 30 초에서 15 초 10주기, 30 72 ° C에서 초, 1 분 최종 연장 72 ° C에서 </li><li> 포스트 증폭 청소를 수행 반복 사용 3.1-3.8 단계1X의 AMPure XP 구슬의 볼륨 (50 μL), 30 μL의 최종 볼륨에 멸균 물에 resuspend. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 큐빗 광범위한 분석 (라이프 테크놀로지스, 표 2)를 사용하여 각 라이브러리의 농도를 정량화. </li></ol> 7. 로슈 NimbleGen의 SeqCAP EZ 도서관 하이브리드, 세척 및 증폭 <ol><li> 얼음 해동 보편적이고 인덱스 올리고 차단제 (표 3), SeqCap EZ 도서관 및 NimbleGen의 캡처 구성 요소 (COT의 DNA, 2X 하이브리드 화 버퍼 및 하이브리드 구성 요소 A, 표 2). 모든 올리고 차단제는 1 mm의 작업 주식에 저장됩니다. 우리 SeqCap EZ 도서관은 다른 사용자 정의 및 카탈로그 디자인이 사용될 수 있지만, 279 암 관련 유전자의 모든 단백질 코딩 엑손을 포괄 캡처 프로브의 맞춤 설계 풀입니다. </li><li> 특정 바코드 광고에 해당하는 인덱스 올리고 뉴클레오티드 차단제의 1 ㎜ 풀을 준비라이브러리의 제조에 사용 aptor 서열. 1 각 차단기의 μL​​, 그리고 소용돌이를 결합합니다. </li><li> 새로운 멸균 1.5 ML microcentrifuge 관에서 1mg/ml의 침대의 DNA의 5 μL, 1 mM의 보편적 인 차단기의 2 μL 및 인덱스 올리고 차단제의 1 ㎜ 풀의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 하나의 반응에 수영장 (24) 바코드 라이브러리. 캡처 혼합물 (상기에서 제조) 풀링, 바코드 일련의 라이브러리의 1-3 μg의 총을 추가합니다. 24 샘플은 샘플 당 100 ng를 추천합니다. 종양과 일치하는 일반 샘플을 풀링 할 때, 우리는 그들이 더 큰 범위의 깊이 순서가되도록 더 많은 종양 라이브러리 (종양 및 정상 50 NG 당 예를 들어, 100 NG)를 추가 좋습니다. </li><li> 튜브의 뚜껑을 닫고 18 ~ 20 G 나 작은 바늘 캡의 상단에 15 ~ 20 홀을 만든다. 속도 청소기 고온 (60 ℃)에서 DNA 진공 농축기에서 증폭 된 샘플 라이브러리 / COT DNA / 올리고. </li><li> 일단 완전히 건조 2 배 hybridi의 7.5 μL로 재수zation 버퍼링 및 하이브리드 구성 요소 A의 3 μL 튜브는 이제 다음을 포함한다 : 5 μg의 COT의 DNA, 변수 μg 증폭 샘플 라이브러리, 범용 및 색인 올리고 1000 pmol의 7.5 ㎕의 2 배 하이브리드 버퍼, 3 ㎕의 하이브리드 구성 요소 10.5 μL의 총 부피. </li><li> 실험실 테이프의 작은 조각으로 뚜껑에있는 구멍을 커버. 소용돌이 10 초 동안 최대 속도로 10 초 원심 분리기에 대한 샘플. </li><li> 실온에서 10 초 동안 최대 속도로 원심 분리 DNA를 변성 10 분, 95 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 새로운 0.2 ML PCR 지구 관에서 SeqCap EZ 도서관 캡처 프로브 및 멸균 클레아 무료 H 2 O 2.25 μL 2.25 μL 나누어지는 준비 단계 7.7의 내용을 추가합니다. 부드럽게 위아래로 배 전체 볼륨을 피펫. </li><li> 48 ~ 96 시간 동안 47 ° C에서 열 자전거 타는 사람에 품어. 설정하고 57 ° C.에 열 자전거 타는 사람의 뚜껑 온도를 유지 </li><li> FOL세척 및 캡처 된 DNA의 복구를위한 NimbleGen의 SeqCap EX 라이브러리 SR 사용 설명서 버전 3.0 (표 2)의 제 6 장 낮은 단계. </li><li> 다음 수정을 촬영 한 DNA의 증폭을위한 로슈 NimbleGen의 프로토콜의 제 7의 단계를 다음과 같습니다 : <ul type="disc"><li> 대신 Phusion 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스의 2 배 KAPA 고음질 중합 효소 (표 2)를 사용하여 </li><li> 표 3에 100 μM의 프라이머 1 프라이머 2를 사용합니다. </li><li> 30 초 동안 98 ° C에서 초기 변성, 10 초 동안 98 ° C의 11주기, 30 초, 60 ° C, 30 초, 72 ° C, 5 분 동안 72 ° C에서 최종 연장 : 다음 PCR 조건을 실행 . 4 ° C에서 개최 </li></ul></li><li> 제조업체의 지시에 따라 큐빗 고감도 분석 (표 2)를 사용하여 증폭 된 캡쳐 DNA의 농도를 정량화. </li><li> 애질런트 바이오를 사용하여 캡처 DNA의 품질을 분석분석기 DNA HS 칩 (표 2)는 제조업체의 지침에 따라. <ul type="disc"><li> PCR 수익률은 최소 100 NG (범위 100-1,000 NG)해야한다. </li><li> 평균 조각의 길이는 150-400 염기쌍 사이 여야합니다. </li></ul></li></ol> 8. Illumina의 안녕 시퀀서 시퀀싱 <ol><li> 오후 2 증폭 캡처 DNA를 희석하고, Illumina의 HiSeq 2000 흐름 세포의 단일 차선에 샘플을로드합니다. 시퀀스 쌍 엔드 75 염기쌍은 제조업체의 지침에 따라 읽습니다. 우리의 경험에 의하면, 하나의 레인 24 샘플의 풀에 279 유전자에 걸쳐 샘플 당 500-700X 고유의 시퀀스 범위를 생산하기에 충분하다. </li><li> Illumina의 소프트웨어 (실시간 분석) 통화 및 품질 평가 점수를 기반으로하는 클러스터 강도 높은 해상도의 이미지를 변환합니다. 바코드의 정체성에 따라 데이터를 역 다중화하고, 각 샘플에 대한 개별 FASTQ 파일을 생성하는 CASAVA를 사용합니다. </li></ol> 9. 데이터 아날ysis <ol><li> 서열의 3 &#39;말단으로부터 트림 어댑터 서열 Cutadapt을 (사용 FASTQ 파일 판독 <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). 오버랩의 최소 길이 (-O)은 1 %의 에러율 (-E) 3이다. 페어의 유지를위한 최소한의 기본 길이는 25입니다 트리밍 후 읽습니다. </li><li> 에 맞 춥니 다 순서는 버로우 - 휠러 동기기 도구 (BWA) 12를 사용하여 참조 인간 게놈 hg19로 읽습니다. 자신의 표준 모범 사례 (에 따라 게놈 분석 툴킷 (GATK)를 사용하여 표시 중복, 지역의 여러 순서 재배치,베이스 품질 평가 점수의 재조정 등의 후 처리 단계 수행 <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic을? = 모범 사례의 이름</a> ) 13. 같은 환자에서 여러 시료 (예를 들어 일치하는 종양과 정상)를 프로파일 링 할 때, 지역의 여러 순서 재정렬 perfor해야공동 MED. 이러한 후 처리 단계의 출력은 모든 시퀀스, 품질 및 배향 정보를 포함하고 판독 시퀀스 (14)를 변형 시각화 통합 유전체학 뷰어 (IGV)에 직접로드 될 수있는 각 샘플에 대한 별도의 BAM 파일이다. </li><li> 피카드 도구를 사용하여 시퀀스 성능 메트릭을 계산 ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). 유익한 통계는 정렬 속도, 조각의 크기 분포, GC-콘텐츠 관련 보도 바이어스에 대상 캡처 특이 PCR 복제 속도, 라이브러리의 복잡성 및 대상 범위를 의미 있습니다. 대표 값은 그림 1에 표시됩니다. GATK에서 DepthOfCoverage을 사용하여 계산 공통 다형 사이트의 대립 유전자 빈도는 무관 DNA로부터의 오염을 모니터링 및 그 유사한 샘플이 동일한 환자에서 온 보장하기 위해 사용된다. 다음 전산 분석은 일치의 존재에 따라 달라집니다체세포 유전 변경의 탐지를위한 종양과 정상 샘플. 후기, 실시간 종양은 또한 별도의 정상 대조 샘플을 사용하여 분석 할 수 있지만, 대부분의 체세포 돌연변이는 쉽게 상속 서열 변이체와 ​​구별 될 수 없다. </li><li> 이러한 muTect 15 SomaticSniper 16 또는 Strelka 17로 체세포 돌연변이 발신자를 사용하여 각 종양 정상 쌍의 체세포 단일 염기 변이 (SNVs)로 전화하십시오. 우리는 낮은 0이 아닌 대립 유전자의 정상 샘플 카운트 한 대립 유전자 빈도는 종양의 최소 5 배 큰대로와 변형을 허용, 수정 필터링 기준으로 muTect를 사용합니다. 순환 적 정상 DNA를 패널에서 호출 변형은 순서 또는 정렬의 가능성 체계적인 유물로 제거됩니다. 필터를 통과하는 각 SNV는 조심스럽게 IGV를 사용하여 검토합니다. </li><li> 이러한 SomaticIndelDetector 13 Dindel 18으로 알고리즘을 사용하여 각 종양 정상 쌍의 체세포 삽입이나 삭제를 전화, 또는 SOAPindel 19 </sup&gt;. 우리는 다음과 같은 기준으로 SomaticIndelDetector를 사용하여, 적어도 10 %의 대립 유전자 빈도를, 적어도 3, 적어도 10지지 읽기와 대립 유전자 빈도를 판독지지, 또는 적어도 2 %로. 우리는 낮은 0이 아닌 대립 유전자의 정상 샘플 카운트 한 대립 유전자 빈도는 종양의 최소 5 배 큰대로로 삽입이나 삭제를 허용. 정상 DNA를 패널에서 호출 삽입이나 삭제는 위와 같이, 제거됩니다. 필터를 통과하는 각 INDEL은 조심스럽게 IGV를 사용하여 검토합니다. </li><li> 대상 엑손의 순서 범위에서 카피 수의 상태를 추정. 각각의 샘플은 모든 대상 엑손, GC 비율에 회귀에 대한 평균 순서 범위의 황토 정규화를 수행합니다. 황토의 적합을 뺀 샘플 전체 평균의 범위를 추가하여 표준화 범위의 값을 조정합니다. 종양 일반적인 쌍에 대한 모든 대상 엑손에 걸쳐 표준화 된 일련의 범위에서 비율을 계산합니다. 일치하는 일반 샘플 및 / 또는 소음을 줄이기 위해, 다른 성별 일치 배체의 부재생식선 카피 수 변이를 결여 정상인이 사용될 수있다. 커버리지 비율의 증가 또는 감소에 따라 체세포 복제 수의 이득과 손실을 결정합니다. </li><li> 적어도 하나의 게놈 중단 점은 게놈의 대상 구간 내 또는 근처에 폭포 암 유전자를 포함하는 체세포의 재 배열을 호출합니다. 제안 된 알고리즘은 GASV 20 breakdancer을 21 CREST (22) 및 dRanger 23 (가) 있습니다. Intrachromosomal 반전, 삭제 및 탠덤 중복은 지원의 상대적 위치와 방향이 부조화 한 쌍으로 읽고에 따라 구별 할 수있다. 모든 후보의 재 배열을 수동으로 IGV를 사용하여 검토되어야한다. 우리는 추정 재 배열 중단 점에서 PCR과 생어 시퀀싱에 의해 검증 실험을하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+geometric+approach+for+classification+and+comparison+of+structural+variants.">A geometric approach for classification and comparison of structural variants.</a> Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).</li><li>Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BreakDancer:+an+algorithm+for+high-resolution+mapping+of+genomic+structural+variation.">BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation.</a> Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).</li><li>Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREST+maps+somatic+structural+variation+in+cancer+genomes+with+base-pair+resolution.">CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution.</a> Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).</li><li>Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+rearrangements+across+cancer+reveal+classes+of+samples+with+distinct+patterns+of+DNA+breakage+and+rearrangement-induced+hypermutability.">Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability.</a> Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

박사 버거는 기초 의학, 암 진단 회사에서 컨설팅 비용과 연구 기금을 받았다.

우리의 영향 분석은 높은 정렬 속도, 높은 곳에서 목표 속도, 높은 대상 범위 및 검출 돌연변이, 삽입이나 삭제, 및 번호 변경을 복사에 대한 높은 감도를 생산하고 있습니다. 우리는 냉동 모두의 시퀀스 DNA에 미치는 영향 분석의 능력을 증명하고 낮은 DNA 입력 FFPE 샘플을 보관했다. 키 암 관련 유전자의 엑손 타겟 시퀀싱을 수행함으로써, 하나함으로써 저주파 변이를 감지하는 능력을 최대화 이러?...

키 종양 유전자와 종양 억제 유전자의 &quot;드라이버&quot;종양 유전자 이벤트의 식별은 많은 암 (1)의 진단과 치료에 필수적인 역할을한다. 대규모 병렬 &quot;차세대&quot;염기 서열을 이용하여 대규모 연구 노력은 최근 몇 년에있는 많은 암 관련 유전자의 식별을 가능하게했다. 그러나 이러한 시퀀싱 플랫폼은 일반적으로 이와 같은 (FFPE) 종양 샘플 포함 된 포르말린 고정 파라핀 등의 보존 조직에서 DNA 돌연변이의 특성 및 분석의 주요 제한 포즈, 냉동 조직에서 분리 된 DNA의 많은 양을 필요로한다. 효율적이고 안정적​​으로 FFPE 종양 샘플에서 &quot;실행 가능한&quot;게놈 정보의 특성을 향상 노력은 이전에 둑 표본의 후 향적 분석을 가능하게하고 또한 암 관리에 대한 개별적인 접근 방식을 권장합니다. 전통적으로, 분자 Diagnostic 연구소는 DNA 돌연변이 프로파일에 대한 생어 시퀀싱 및 실시간 PCR 등의 시간이 소요되는, 낮은 처리량 방법에 의존하고있다. 더 최근에, 멀티 플렉스 PCR 또는 질량 분석 유전자형을 이용한 높은 처리량 방법은 키 암 유전자 3-5 재발 체세포 돌연변이를 조사하기 위해 개발되었다. 이러한 접근법은, 그러나, 단지 미리 지정된 &quot;핫스팟&quot;돌연변이는 종양 억제 유전자에서 불활 화 돌연변이를 검출하기에 부적합하게, 정량되는 것을 제한된다. 대규모 병렬 염기 서열 일반 및 희귀 모두 돌연변이 전체 엑손을 심문 할 수있는 능력, 이러한 카피 수의 이득과 손실 등 게놈 변경의 추가 클래스를 공개 할 수있는 기능, 이기종 샘플 6, 더 큰 검출 감도를 포함하여 이러한 전략을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다 7 . 그것은 상대이지만 전체 게놈 시퀀싱은 돌연변이 발견을위한 가장 포괄적 인 접근 방식을 나타냅니다LY 비싸고는 데이터 분석 및 저장을위한 대용량 연산 요구를 초래한다. 게놈의 작은 부분이 임상 관심을 가질 수있는 임상 응용 프로그램의 경우, 시퀀싱 기술의 두 가지 특정 혁신은 변형되고있다. 첫째, 하이브리드 기반의 엑손 캡처를 통해, 하나는, 표적 돌연변이 프로파일 8 키 암 관련 유전자에 해당하는 DNA를 분리 할 수 있습니다. 둘째, 분자 바코드 (즉, DNA 서열의 길이는 6 ~ 8 개의 뉴클레오티드)의 결찰을 통해, 하나는 시퀀싱 실행 당 수백 개의 샘플을 풀 수 있고, 완전히 대규모 병렬 시퀀싱 장비 (10)의 계속 증가하는 용량을 활용할 수 있습니다. 결합하면, 이러한 혁신은 작은 전산 요구 사항 (11), 낮은 비용을 프로파일 링하는 종양을 활성화하고 높은 처리량. 또한, 특정 애플리케이션에 가장 중요한 만 유전자 시퀀스 범위를 재분배하여, 하나는 achie 수 있습니다낮은 대립 유전자 빈도 이벤트에 대한 높은 검출 감도에 큰 순서 깊이를했습니다. 여기에서 우리는 (모든 단백질 코딩 엑손를 캡처하고 279 키 암 관련 유전자의 인트론을 선택하는 사용자 지정 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 하이브리드 화하여 바코드 일련의 라이브러리 풀에 엑손 캡처를 활용 미치는 영향 분석 (실행 가능한 암 대상의 통합 돌연변이 프로파일)를 설명하는 표 1 ). 이 전략은 돌연변이, 삽입이나 삭제, 복사 번호 변경의 식별을 가능하게하고,이 279 유전자를 포함하는 구조 재 배열을 선택합니다. 우리의 방법은 냉동과 FFPE 조직뿐만 아니라 미세 바늘 흡인 및 기타 세포 검사 표본 모두에서 고립 된 DNA와 호환됩니다.

<table><tbody><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6050L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext dA-Tailing Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6053L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Quick Ligation Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEXTflex PCR-Free Barcodes &amp;ndash; 24</td><td>Bioo Scientific</td><td>514103</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiFi Library Amplification Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2612</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>COT Human DNA, Fluorometric Grade</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 480 647 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td><td>Roche NimbleGen</td><td>05 634 261 001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SeqCap EZ Library Baits</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent DNA HS Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626, 4627</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Ambion</td><td>AM10027</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Illumina Hi-Seq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

키 종양 변이를 감지하고 조사하는 노력이 암 환자에 대한 적절한 치료를 촉진하는 중요한 입증했다. 높은 처리량의 설립, 대규모 병렬 &quot;차세대&quot;순서는 많은 이러한 돌연변이의 발견을 원조하고있다. 이 기술의 임상과 번역 유틸리티를 강화하기 위해, 플랫폼은 높은 처리량, 비용 효율적이며 성능이 저하되거나 손상된 DNA의 소량을 얻을 수있다 (FFPE) 조직 샘플 포함 된 포르말린 고정 파라핀과 호환되어야합니다. 여기, 우리는 대규모 병렬 염기 서열 냉동 및 FFPE 종양에서 암 관련 변이의 검출 대상 엑손 기반의 하이브리드 캡처 다음에 바코드 및 다중 DNA 라이브러리의 준비에 대해 설명합니다. 이 방법은 서열 변이의 식별을 가능하게 번호 변경을 복사하고, 모든 대상 유전자를 포함하는 구조 재 배열을 선택합니다. 대상 엑손 염기 서열은 t을 제공합니다그는 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 부여, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

24 바코드 일련의 라이브러리 (12 종양 정상 쌍)의 한 수영장은 279 암 유전자의 모든 단백질 코딩 엑손에 해당하는 프로브를 사용하여 캡처 및 2 × 75 BP는 HiSeq 2000 흐름 세포의 단일 차선에 읽는 순서가되었다. 종양과 정상 라이브러리는 2:1의 비율로 풀링했다. 동결 된 종양 DNA 시료 풀의 샘플 성능 메트릭은 배향 율, 단편 크기 분포에 대한 대상 캡처 특이성, 및 표적 범위를 의미 포함한,도 1에...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 &quot;다음 세대&quot;염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K 조회수.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다. 

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Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

연구

암 연구학

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic target analyses and drug response monitoring using patient derived xenografts (PDX). This strategy was validated using ovarian tumors as an example. The mate-pair next generation sequencing (MPseq) protocol was used to identify structural alterations and followed by analysis of potentially targetable alterations. Human tumors grown in immunocompromised mice were treated with drugs selected based on the genomic analyses. Results demonstrated a good correlation between the predicted and the observed responses in the PDX model. The presented approach can be used to test the efficacy of combination treatments and aid personalized treatment for patients with recurrent cancer, specifically in cases when standard therapy fails and there is a need to use drugs off label.

Here we present a protocol to test the efficacy of targeted therapies selected based on the genomic makeup of a tumor. The protocol describes identification and validation of structural DNA rearrangements, engraftment of patients&#8217; tumors into mice and testing responses to corresponding drugs.

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

행동분석학

암 조직 샘플의 종양 유발 요인에 대한 FISH 분석 개선

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

저자 스포트라이트: 암 표본에서 정확한 유전자 증폭 평가를 위한 도구로서의 FISH

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출