Nuestro protocolo permite la captura de la relación genética entre lesiones primarias y metastásicas a través de la identificación de alteraciones moleculares implicadas en la progresión de la enfermedad. Nuestro método ofrece la oportunidad de explorar la relación genética en muestras clínicas con alta sensibilidad y especificidad. Esto se debe a la integración del análisis molecular e histopatológico.
La evaluación de la heterogeneidad intratumoral en el campo de la investigación del cáncer es de suma importancia en el diseño de estrategias antitumorales eficaces y nuestro método es ampliamente aplicable a muchos tipos de tumores sólidos. Después de preparar y cuantificar las bibliotecas de interés, diluir cada biblioteca a una concentración de 100 picomolares en agua libre de nucleasas y combinar 10 microlitros de cada biblioteca diluida para una sola tirada en un solo tubo. A continuación, mezcle las bibliotecas agrupadas por pipetting.
Para iniciar una ejecución de secuenciación, abra primero el navegador Torrent en un equipo conectado al sistema de secuenciación. Planifique una nueva ejecución utilizando la plantilla genérica para la aplicación seleccionada y en la pestaña kits seleccione el sistema Ion Proton o el sistema Ion Gene Studio S5. Seleccione el chip adecuado en el menú desplegable tipo de chip y seleccione Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit en la lista desplegable del kit de biblioteca.
Seleccione el botón Ion Chef para el kit de plantilla y seleccione el kit de Chef adecuado en la lista desplegable del kit de plantillas. Seleccione el kit de secuenciación adecuado en el menú desplegable del kit de secuenciación y seleccione Ion Express en la lista desplegable del conjunto de códigos de barras. En la pestaña del plugin, seleccione el plugin de análisis de cobertura.
En la pestaña Plan, seleccione el genoma GRCH37HG19 en la lista desplegable de la biblioteca de referencias. En la lista desplegable Regiones de destino, seleccione el panel adecuado que desea secuenciar. A continuación, establezca el número de códigos de barras que se van a secuenciar y establezca el nombre del código de barras y el nombre de la muestra para cada biblioteca.
Para una dilución de bibliotecas agrupadas, diluya la biblioteca de existencias con agua libre de nucleasas a una concentración picomolar de 25 para un chip de protones iónico y pipetee 50 microlitros de cada biblioteca diluida hasta el fondo del tubo de muestra de la biblioteca adecuado. Cargue tubos de muestra que contengan las bibliotecas diluidas agrupadas en el sistema de preparación de la biblioteca e inicie la amplificación clonal. Para la secuenciación de próxima generación, siga las instrucciones en pantalla para inicializar el instrumento.
Cuando termine la amplificación clonal, abra la puerta del instrumento Ion Chef, abra la tapa de la centrífuga de carga de viruta y retire los dos chips del sistema de preparación de la biblioteca. Coloque las virutas en contenedores de almacenamiento de virutas separados y cargue una de las virutas en el compartimiento de virutas del instrumento. A continuación, cierre la tapa del compartimiento de viruta e inicie la secuenciación.
Para el análisis de mutaciones, abra el plugin de análisis de cobertura y utilice la salida de análisis de cobertura para verificar la profundidad de cobertura y uniformidad. Utilice el plugin Torrent Variant Caller para realizar la variante de llamada seleccionando la línea germinal o el flujo de trabajo somático según corresponda. A continuación, descargue los archivos de formato de llamada de variantes de variantes filtradas y utilice el software predictor de efectos variantes en la base de datos REFSeq de NCBI para anotar las variantes.
Para estimar las variaciones del número de copia, utilice el plugin ion reporter uploader para cargar los datos de secuenciación en el software de reportero iónico y utilice el flujo de trabajo completo del par normal del tumor del panel de cáncer para analizar los datos. Filtre manualmente las mutaciones y las variaciones del número de copia en función de las puntuaciones asignadas por el software y verifique las variaciones visualmente con el Visor De Genómica Integrativa. A continuación, inspeccione visualmente la alineación en busca de lecturas inusuales que puedan generar llamadas artefactos e inspeccione la cobertura normalizada para todos los amplicons a través de un gen dado contra la cobertura normalizada de la línea de base para verificar las variaciones del número de copia.
Para cada caso, indexa las llamadas de mutación desde la secuenciación de tejido normal o sangre o tumor primario o metástasis. Marcar como línea germinal y descartar llamadas que también son evidentes de los datos de secuenciación del ADN de la línea germinal. Marcar como clonal o fundador las mutaciones que se comparten entre todas las lesiones de un paciente dado.
A continuación, marcar como subclonal o progresor las mutaciones que se detectan en algunas pero no todas las lesiones de un paciente dado. En este experimento representativo, la secuenciación de múltiples lesiones de cinco casos sólidos de neoplasia pseudopapilar dirigidos a las secuencias de codificación de 409 genes relacionados con el cáncer identificó un total de 27 mutaciones somáticas en ocho genes. Las mutaciones se definieron como fundadores o clonales cuando se compartieron entre todas las lesiones de un paciente determinado y progresor o subclonal cuando se detectan en algunas lesiones de un paciente determinado, pero no en todas.
Consistentemente, la tinción inmunohistoquímica para beta-catenina y KMD6A fue homogénea entre las diversas lesiones de los casos con mutaciones de los genes correspondientes. La tinción moderada de KMD6A en especímenes mutados sugiere que es probable que la alteración genética altere la función en lugar de la expresión de la proteína. La pérdida de la función de KMD6A en los tumores pancreáticos se asocia con una regulación del marcador de hipoxia GLUT-1.
Y en consecuencia, GLUT-1 se expresó en exceso en casos con mutaciones KMD6A. La inmunohistoquímica para BAP1 y TP53 confirmó que las mutaciones en esos genes eran subclonales. En este cariotipo virtual de un caso representativo que muestra la ubicación, proximidad y estado del número de copia de genes alterados, el análisis de variación de número de copia utilizando datos de secuenciación reveló alteraciones en todos los especímenes analizados.
Y a diferencia de las mutaciones puntuales, la mayoría de las alteraciones de variación del número de copia fueron subclonales. La validación e indexación de mutaciones y la variación del número de copia y el uso de la comparación normal del ADN tumoral son importantes para evitar la generación de llamadas artefactos que podrían invalidar los resultados. Este procedimiento también podría aplicarse a estudios de secuenciación del genoma completo destinados a interrogar todo el genoma para la identificación de mutaciones entre lesiones de diferentes tipos de tumores sólidos.
En el campo de la investigación oncológica, estas técnicas son herramientas críticas para entender la biología de enfermedades con importantes implicaciones clínicas destinadas a diseñar terapias dirigidas personalizadas y eficaces.
