Damos las gracias a Angelika Berg para la asistencia de laboratorio. Este trabajo fue apoyado y financiado por la Sociedad Max Planck y la Escuela de Jena para Microbiana Comunicación (JSMC).

1. Insectos Crianza <ol><li> Comprar u obtener huevos garras de Spodoptera littoralis de su propia crianza. Mantener en placas de Petri estériles a temperatura ambiente (RT) hasta la eclosión. </li><li> Preparar la dieta artificial para la cría de los insectos de la siguiente manera: <ol><li> Remojar los frijoles blancos 500 g de tierra durante la noche en 100 ml de agua. </li><li> Añadir 9,0 g de ácido ascórbico y 75 g de agar a 1000 ml de agua destilada H 2 O y luego hervirla. </li><li> Deje que la mezcla se enfríe y cuando se solidifica (a una mezcla de sólido ceroso blanco) almacenarlo a 4 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Transfiera las larvas recién eclosionadas de una caja de plástico limpia y criarlos en la dieta artificial a 23-25 ​​° C bajo un régimen largo día con 16 horas de iluminación y 8 horas de oscuridad. Cambie la comida todos los días hasta que las larvas pasan por los seis estadios larvales. </li></ol> 2. 13 C-etiquetado de ADN en las bacterias intestinales metabólicamente activo <ol><li> Disolver 186,1 mg de 13 totalmente la glucosa marcada con C con agua destilada y agua desionizada (ddH2O) y se mezcla bien con 100 g de dieta artificial para el experimento de SIP. Asegurar una concentración de 13 C-glucosa final de 10 mM en la dieta artificial. Esto imita la de la concentración de glucosa in situ en el intestino de S. littoralis larvas se alimentan de las plantas de algodón de acuerdo con Shao et al. (Enviar). </li><li> Transferencia 9-15 segundo estadio las larvas sanas desde el cuadro de cría para placas de Petri de plástico estéril (una larva por placa Petri) que contienen frescos 13 C-glucosa pinchos dieta artificial. Utilice dieta artificial que contiene la misma cantidad de glucosa nativa (12 C-glucosa), tal como se describe, para la alimentación del grupo de control. </li><li> Renovar la dieta artificial con frecuencia durante el período de incubación (1 día). Utilizar condiciones de cría como en el paso 1.3. </li><li> Recoger nueve larvas de cada tratamiento para su posterior procesamiento (extracción de ADN). Cadareplicar está constituido por tres individuos; hacer por lo menos tres repeticiones por tratamiento. </li></ol> 3. Insectos Disección <ol><li> Limpiar y desinfectar las herramientas de disección en el inicio de la obra con etanol al 70% (Herramientas = tijeras Vannas, fórceps y el bisturí con cuchillas desechables finas). </li><li> Tome los insectos con una pinza suave y lavar la piel superficialmente con agua destilada. Colóquelos en hielo durante al menos 30 min para anestesiar ellos. </li><li> Aunque todavía anestesiado lugar ellos a 0 ° C durante 1 hora para matarlos. Desinfectar los insectos muertos superficialmente por inmersión en etanol (70%) durante un par de minutos. </li><li> Realizar la disección de insectos en un volumen de aproximadamente 15 ml de PBS 1x depositado sobre una placa de Petri estéril (NaCl 1XPBS = 137 mM, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4, ajustar el pH a 7,4 , en autoclave). Asegúrese de tener todo el cuerpo del insecto completamente inmerso en el solutde iones durante todo el período de disección. </li><li> Comience la disección haciendo una incisión en la piel a lo largo de los lados derecho e izquierdo del insecto, comenzará en la cabeza y terminar en el ano. Retire toda la piel, tubos de Malpighi, y la grasa corporal. Cambie al tampón fresco antes de cortar y abrir el intestino. Sección del intestino en primer plano, medio, y el intestino posterior cuando sea necesario. Almacenar el tejido en el congelador (-80 a -20 º C) hasta la extracción de ADN </li></ol> 4. Extracción de ADN y amplificación <ol><li> Coloque el tejido de insectos en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y secar todas las muestras a 45 ° C en un dispositivo concentrador de vacío. Triturar el tejido se seca con una mano de mortero de plástico estéril. </li><li> Extraer el ADN genómico utilizando un kit adecuado para la extracción de ADN del suelo. Transferir el tejido seco para el tubo de reacción del kit y siga las instrucciones como se indica por el fabricante. </li><li> Determinar la concentración del ADN eluido final utilizando un espectrofotómetro. </li><li> Verifya con éxito la extracción del ADN metagenómica microbiana del intestino del insecto mediante la preparación de un ensayo de PCR de diagnóstico utilizando los cebadores generales eubacterial 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) y 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Establecer la reacción de PCR como sigue: <ol><li> Establecer una mezcla de reacción que contiene 50 l 1x tampón, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM cuatro desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs), 2,5 U de Taq ADN polimerasa, 0,5 mM de cada cebador y 60 ng del ADN extraído como plantilla. </li><li> Ejecutar las reacciones de PCR utilizando un termociclador de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de: 94 º C durante 45 seg, hibridación a 55 ° C durante 30 seg, y extensión a 72 ° C durante 1 min . Utilice un paso de extensión final a 72 ° C durante 10 min. </li><li> Verificar la amplificación por PCR con éxito en un gel de agarosa 1% electroforesis en bromuro de etidio (EB) gel teñido (disolver 1 g de agarosa en 100 ml de tampón TAE 1x y mancha con 1μl EB). Depósito 5 l de thproducto e PCR + 1μl de 6x colorante de carga a los bolsillos de gel. (TAE 1x = 40 mM de Tris-base, 20 mM de ácido acético glacial, EDTA 1 mM, ajustado a pH 8). </li><li> Ejecute el gel usando tampón 1xTAE a 300 V, 115 mA de ca. 20 min en una cámara de electroforesis. Mediante el uso de una cámara de documentación de geles (transiluminador UV conectado a una cámara digital y la computadora) observar el gel y comparar el tamaño de su producto final con el marcador genético también cargado, el tamaño correcto de los amplicones debe ser de aproximadamente 1,5 kb. </li></ol></li><li> Almacene los productos de PCR en condiciones de congelación profunda, preferentemente -80 º C, hasta su uso. </li></ol> 5. Separación-CsCl ADN degradado Ultracentrifugación <ol><li> Preparar los reactivos para los gradientes para la ultracentrifugación de la siguiente manera: <ol><li> Preparar un M de cloruro de cesio (CsCl) solución de 7,163 disolviendo gradualmente 603,0 g de CsCl en ddH2O y rellenar hasta un volumen final de 500 ml. </li><li> Exactamente desdeterminar la densidad de la solución de CsCl preparada pesando una parte alícuota de 1,0 ml en un equilibrio de tres dígitos por triplicado. Esto por lo general oscila entre 1,88 y 1,89 g / ml a temperatura ambiente. </li><li> Preparar el tampón de gradiente (Tris 100 mM, KCl 100 mM y EDTA 1 mM) mediante la combinación de 50 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml de EDTA 0,5 M (pH 8) y 3,75 g de KCl en una final volumen de 500 ml utilizando ddH 2 O. Filtrar (0,22 m) esterilizar en autoclave y esta solución. </li></ol></li><li> Separación de ADN <ol><li> Una vez determinada la concentración de ADN individual de los insectos tratados, medida como en el punto 4.3, en común esos insectos correspondientes a una repetición juntos y normalizar la concentración de ADN para asegurar que cada uno de ellos, igualmente contribuye a la muestra conjunta. Una concentración final de 500-5000 ng de ADN (medir de nuevo la concentración final) es adecuado para el proceso de ultracentrifugación 21. </li><li> Para configurar el desnivel medio, combine el ADN cuantificado, un buffer de gradienteD 4,8 ml de solución 7,163 M de CsCl junto a un volumen de la mezcla de 6,0 ml en un tubo de 15 ml con tapón de rosca estéril (generación de una mezcla de ADN-medio de gradiente). </li><li> Coloque cuidadosamente el gradiente de mezcla de ADN medio preparado en un tubo de ultracentrífuga 5,1 ml (llene hasta la base del cuello del tubo) con una jeringa y aguja. Evitar el bombeo o la formación de burbujas de aire. Incluya por lo menos un gradiente de blanco (con ddH2O en lugar de ADN) en cada serie centrífuga como un gradiente de referencia. </li><li> Pares de tubos de balance a menos de 10 mg de peso después de cada medio de gradiente requerido se introducen en el tubo de ultracentrífuga respectiva. Selle el tubo con una &quot;Topper Tube&quot; y asegúrese de que la junta esté libre de fugas invirtiendo el tubo y aplicar una presión moderada con la mano. </li><li> Utilice un rotor vertical cerca con ocho pozos para la celebración de los tubos 5,1 ml de ultracentrifugación para la ultracentrifugación. Selle cuidadosamente los pozos de rotor y cargar el rotor en la ultracentrífuga según la malas instrucciones del ciones del fabricante. Establecer las condiciones de ultracentrifugación: giran a 50.000 rpm (aproximadamente 177.000 xg), la temperatura a 20 ° C, y ultracentrifugación tiempo de funcionamiento de 40 horas con vacío. Seleccione la máxima aceleración y la desaceleración sin freno. </li><li> Una vez que haya terminado, retire con cuidado los tubos de rotor centrífugo con unas pinzas. Colocarlos en un estante sin molestar a los gradientes formados dentro de los tubos. Procesar las muestras de fraccionamiento de gradiente tan pronto como sea posible para minimizar cualquier difusión. </li></ol></li><li> La recuperación de ADN de gradientes isopícnica separados por fraccionamiento <ol><li> Utilice un sistema de bomba de HPLC precisa para llevar a cabo el fraccionamiento de gradiente, que separa igualmente los gradientes formados a partir del método de desplazamiento de la tapa del tubo de ultracentrífuga. Conecte la bomba de HPLC (100% del gradiente de flujo) a la botella llena con 1 litro de desplazamiento ddH2O y herméticamente adjuntar a la tubería de la bomba abierto con un 23 G 1 en aguja de la jeringa. Agregar suficiente bromophenol colorante azul al ddH2O para darle un color azul oscuro. Esto facilita la visualización de la interfaz entre el medio de gradiente y el desplazamiento de ddH 2 O. </li><li> Establecer la bomba a una velocidad de flujo de 850 l / min y equilibrar el sistema hasta una sola gota de la de color azul ddH2O emerge fuera de la aguja de la jeringa. </li><li> Fijar con cuidado el tubo de ultracentrífuga para un soporte de pinzas y perforar la parte inferior del tubo con una jeringa de 23 G 1 en aguja larga. Conectar la bomba al tubo de ultracentrífuga mediante la inserción de la aguja unida a la tubería de la bomba en la parte superior del tubo, y recoger las gotas de la parte inferior directamente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles. Se recoge una fracción cada 30 segundos, por un importe de aproximadamente 425 l por fracción y un total de 12 fracciones por gradiente. Tenga en cuenta que la última fracción (fracción 12) por lo general contiene el desplazamiento ddH2O y debe desecharse. </li><li> Después del fraccionamiento, MEasure la densidad de todas las fracciones separadas utilizando una balanza analítica como se menciona en el paso 5.1.2. </li><li> Precipitar el ADN de cada fracción (alrededor de 425 l) mediante la adición de primero 1 l de glucógeno (20 mg / l en ddH2O, esterilizado en autoclave) como un portador para la precipitación de baja cantidad de ADN. Mezclar bien por inversión. </li><li> Añadir dos volúmenes (850 mu l) de solución de polietilenglicol (PEG) (disolver 150 g de polietilenglicol 6000 y 46,8 g de NaCl en ddH2O a un volumen total de 500 ml. Filtro, esterilizar y autoclave. La solución de PEG es 30 % de PEG 6000 y NaCl 1,6 M), y se mezcla de nuevo por inversión de diez veces. </li><li> Dejar los tubos a temperatura ambiente durante al menos dos horas (si es necesario, durante la noche) para precipitar el ADN. </li><li> Centrifugar los precipitados a 13.000 xg durante 30 min a TA. Un pellet visible debe formar. </li><li> Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y se lava el sedimento con 500 l de etanol al 70%. Centrifugar bajo el mismocondiciones para 10 min de nuevo. </li><li> Desechar con cuidado el sobrenadante y aire secar el sedimento a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Volver a disolver el precipitado de ADN se seca en 30 l de ddH2O y mezclar bien golpeando suavemente el tubo. Cuantificar el ADN en cada fracción del gradiente como en el paso 4.3 Tienda de las muestras bajo -20 o -80 º C si se requiere el almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li></ol> 6. ADN Caracterización por Pyrosequencing <ol><li> Asegúrese de que el ADN nativo no marcado (12 C) ocupa el intervalo de densidad de 1,705 g / ml a 1,720 g / ml, mientras que 13 de ADN marcada con C tiene una densidad de alrededor de 1,720 a 1,735 g / ml. Tenga en cuenta que tanto el nativo y el 13 de ADN marcado con C extraído de muestras ambientales pueden abarcar varias fracciones del gradiente. Esperamos que el ADN de luz para estar asociado con las fracciones 9-11 y el ADN pesado para ser asociado con las fracciones 4-6. </li><li> Se combinan las fracciones clave para crear un solo &quot;compilado&quot; representante fracción acacuerdo con la asignación máxima específica de la densidad de ADN-resuelto. Alternativamente, otros medios para examinar las fracciones separadas mediante el uso de la espectrometría de masas de relación isotópica (IRMS) 22 o un método de toma de huellas digitales, tales como electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE) 23, pueden ayudar a elegir fracciones apropiadas antes de la secuenciación. </li><li> Realice pirosecuenciación de los 16S rRNA PCR-amplificación de los genes de las fracciones pesadas, intermedias y claras compilados de cada gradiente individual. Usando este método, la identificación del linaje y la abundancia relativa de especies de bacterias metabólicamente activas en el SIP muestras incubadas es posible. Realizar pirosecuenciación de la siguiente manera: <ol><li> Realice pirosecuenciación amplificación utilizando un instrumento Roche 454 FLX con reactivos de titanio. </li><li> Preparar amplicones de barras para la multiplexación usando el cebador de fusión establecido Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) y Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 ampliado con the imprimación respectivo adaptador A / B y los identificadores múltiplex específicos de la muestra (MID). </li><li> Aplicar una PCR de un solo paso con 30 ciclos, usando un Hot Start Taq polimerasa, para generar la biblioteca de secuenciación. </li><li> Secuenciar los amplicones basados ​​en el protocolo del proveedor, y se extienden las lecturas de la dirección de avance (Gray28F) como se describe en <a href="http://www.researchandtesting.com/">http://www.researchandtesting.com/</a> . </li></ol></li></ol> 7. Pyrosequencing Análisis de Datos <ol><li> Analizar la secuencia en bruto lee genera por la pirosecuenciación 454 con los &quot;puntos de vista cuantitativos en ecología microbiana&quot;, oleoducto software QIIME 26. Lleve a cabo el procesamiento de la siguiente manera: <ol><li> Inicialmente, convierta el archivo sff generado-454-máquina para FASTA, QUAL y archivos Flowgram con el guión process_sff.py. </li><li> Validar el archivo de asignación (basado en check_id_map.py) y asignar multiplexado lee a sam biológicapios con el guión split_libraries.py. Recorte la baja calidad termina con un tamaño de ventana deslizante de 50 y un valor medio del parámetro de calidad de corte de 25, eliminan también secuencias ambiguas cortas (la longitud &lt;200 pb) a partir del conjunto de datos. </li><li> DeNoise los datos 454 usando el denoise_wrapper.py. </li><li> A continuación, el clúster de alta calidad se lee en unidades taxonómicas operacionales (Otus) usando el método múltiple OTU picking (pick_otus.py con un 97% de similitud de secuencias cut-offs). </li><li> Elige una secuencia representante de cada OTU usando pick_rep_set.py. </li><li> Asigne la taxonomía para el representante conjunto de secuencias basado en assign_taxonomy.py. Utilice el clasificador Ribosomal Database Project (RDP) con una seguridad mínima para la asignación de registro se establece en 0,80. </li><li> Alinear el representante secuencia se compara con los prealigned Greengenes núcleo 16S secuencias utilizando el algoritmo PyNast (align_seqs.pycon el mínimo de identidad de secuencia por ciento conjunto a 75). </li><li> Además, agotan las quimeras de los nuevos análisis ejecutando identify_chimeric_seqs.py. </li><li> Retire todas las posiciones brecha (no útiles para la inferencia filogenética) con la plantilla lanemask (filter_alignment.py) antes de la construcción de un árbol filogenético (make_phylogeny.py). </li><li> Finalmente, generar tablas OTU con make_otu_table.py, que describe la aparición de filotipos bacterianas dentro de cada muestra. Utilice la tabla OTU para construir el mapa de calor para la comparación de la abundancia y la actividad bacteriana. </li><li> Si es necesario, calcular el alfa y beta diversidad dentro y entre las muestras, respectivamente. De la misma manera, las curvas de rarefacción (gráficos de la diversidad frente a la profundidad de secuenciación) y Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) parcelas que representan las relaciones entre las comunidades microbianas pueden prepararse también. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+obligate+mutualist+Wigglesworthia+glossinidia+influences+reproduction,+digestion,+and+immunity+processes+of+its+host,+the+tsetse+fly.">The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).</li><li>Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary-dependent+trans-generational+immune+priming+in+an+insect+herbivore.">Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.</a> Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Note:+Gut+bacteria+produce+components+of+a+locust+cohesion+pheromone.">A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone.</a> J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).</li><li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+interactions+in+insect-microbial+symbioses:+Aphids+and+their+symbiotic+bacteria+Buchnera.">Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera.</a> Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).</li><li>Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+stable+isotopes+to+measure+the+metabolic+activity+of+the+human+intestinal+microbiota.">Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li><li>Gil, R., Latorre, A., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+endosymbionts+of+insects:+insights+from+comparative+genomics.">Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics.</a> Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).</li><li>Brune, A., VH, R. e. s. h., Card&#233;, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).</li><li>Breznak, J. A., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microorganisms+in+the+digestion+of+lignocellulose+by+termites.">Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites.</a> Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).</li><li>Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Census+of+the+bacterial+community+of+the+gypsy+moth+larval+midgut+by+using+culturing+and+culture-independent+methods.">Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).</li><li>Funke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrolysis+of+quorum-sensing+molecules+in+the+gut+of+lepidopteran+larvae.">Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae.</a> Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).</li><li>Tang, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity+and+variability+of+gut+commensal+microbiota+in+polyphagous+lepidopteran+larvae.">Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+identification+and+in-situ+detection+of+individual+microbial-cells+without+cultivation.">Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation.</a> Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).</li><li>Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+and+evolution+-+a+ribosomal-rna+approach.">Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach.</a> Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).</li><li>Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+acceptor-dependent+identification+of+key+anaerobic+toluene+degraders+at+a+tar-oil-contaminated+aquifer+by+Pyro-SIP.">Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).</li><li>Lu, Y. H., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+stable+isotope+probing+of+methanogenic+archaea+in+the+rice+rhizosphere.">In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere.</a> Science. 309, 1088-1090 (2005).</li><li>Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+as+a+tool+in+microbial+ecology.">Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology.</a> Nature. 403, 646-649 (2000).</li><li>Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+probing+of+microorganisms+thriving+at+thermodynamic+limits:+Syntrophic+propionate+oxidation+in+flooded+soil.">Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).</li><li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation.">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li><li>Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+identification+and+quantification+of+glucose+metabolism+in+seven+bacterial+species.">Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species.</a> J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).</li><li>Dunford, E. A., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Stable-Isotope+Probing+(DNA-SIP).">DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP).</a> J. Vis. Exp. (42), (2010).</li><li>Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation-independent+identification+of+candidate+dehalorespiring+bacteria+in+tetrachloroethylene+degradation.">Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).</li><li>Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+DNA-+and+rRNA-based+stable+isotope+probing+by+fractionation+and+quantitative+analysis+of+isopycnic+centrifugation+gradients.">Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients.</a> Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).</li><li>Ishak, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+diversity+in+Solenopsis+invicta+and+Solenopsis+geminata+ant+colonies+characterized+by+16S+amplicon+454+pyrosequencing.">Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing.</a> Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).</li><li>Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tag-encoded+FLX+amplicon+pyrosequencing+for+the+elucidation+of+microbial+and+functional+gene+diversity+in+any+environment.">Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment.</a> Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+QIIME+to+Analyze+16S+rRNA+Gene+sequences+from+microbial+communities.">Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).</li><li>Dillon, R. J., Dillon, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+bacteria+of+insects:+nonpathogenic+interactions.">The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions.</a> Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).</li><li>Neufeld, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+stable-isotope+probing.">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).</li><li>Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+probing+-+linking+microbial+identity+to+function.">Stable isotope probing - linking microbial identity to function.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El intestino de la mayoría de los insectos alberga una comunidad microbiana rica y compleja, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas se alojan allí, superando en número a las propias células del huésped en la mayoría de los casos. Por lo tanto, el intestino del insecto es un &quot;punto caliente&quot; para diversas actividades microbianas, que representa múltiples aspectos de las relaciones de microbios, de patogénesis obligar mutualismo 27. Aunque muchos estudios han descrit...

Asociaciones simbióticas Insecto-bacterianas son conocidos por un gran número de especies de insectos 7. En estas asociaciones simbióticas, microorganismos desempeñan papeles importantes en el crecimiento y desarrollo de insectos. Los microbios se han demostrado contribuir a la reproducción de los insectos 1, la biosíntesis de feromona 3, la nutrición, incluyendo la síntesis de los aminoácidos esenciales 4, y la digestión de los alimentos inaccesibles para el anfitrión. A pesar de la gran variedad de asociaciones-intestinal bacteriana, se sabe mucho menos sobre el papel funcional que desempeñan en favor del insecto. Sólo en el caso de las termitas, la digestión simbiótica de lignocelulosa llevada a cabo por los procariotas, protozoos y hongos, ha sido ampliamente estudiado 8,9. En contraste con esto, se sabe poco acerca de la asociación simbiótica presente en el intestino de los insectos generalistas, es decir, la rosquilla negra, Spodoptera littoralis. Por otra parte, debido a su cambio frecuente de los ejércitos de las plantas, en generalist insectos y sus viscerales comunidades bacterianas asociadas están expuestos permanentemente a los nuevos desafíos relacionados con sus hábitos de alimentación que consumen las plantas con una gran cantidad de fitoquímicos. Además de esto, el medio ambiente intestinal en los lepidópteros, representa de por sí un ambiente hostil para el crecimiento de bacterias debido a la alta pH intestinal 10. Particularmente en el caso de S. littoralis, oscila entre 10,5 en el intestino anterior, ca. 9 en el intestino medio a pH casi 7 en el intestino posterior 11. Por otro lado, la comunidad bacteriana asociada con el intestino de S. littoralis es simple. Tang, Freitak, et al 12. Informaron de un máximo de 36 filotipos pertenecientes a un total de 7 especies de bacterias diferentes como los únicos miembros de la comunidad bacteriana asociada a este insecto. Además de esto, no se requiere ningún procedimiento de cría complicado para el crecimiento de los insectos en el laboratorio. Además, este y el corto ciclo de vida del insecto facilitar múltiples gestudios enerational, convirtiendo esta especie en un sistema modelo ideal para el estudio de las interacciones gut-microbio. Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación basados ​​en la PCR, el número de estudios que se ocupan de la biota intestinal de varios organismos (es decir, los seres humanos, insectos, u organismos marinos) se ha incrementado. Por otra parte, los resultados son independientes de aislamiento y cultivo de las bacterias del intestino albergado como en el pasado. Casi el 99% de las bacterias no son cultivables y la simulación de las condiciones ambientales reinantes en el intestino es difícil 12. Mediante el uso de PCR, 16S rRNA fragmentos de genes (un marcador de gen filogenético ampliamente utilizado entre las bacterias) podrían ser amplificadas selectivamente a partir de una plantilla de ADN mixta de comunidades bacterianas intestinales, secuenciados, y se clonaron. Con esta información, el usuario es capaz de identificar las especies bacterianas después de recuperar la información de la secuencia de bases de datos públicas 13,14. Sin embargo, la secuenciación se acerca a describir bacterianacomunidades siguen siendo insuficientes debido a la falta de información sobre la contribución metabólica intrínseca de las especies individuales dentro de la comunidad. De isótopos estables de sondeo (SIP) es una técnica de cultivo libre prometedor. A menudo se utiliza en microbiología ambiental para analizar filogenias microbianos vinculados a las actividades metabólicas particulares. Esto se logra mediante el seguimiento, la etiqueta de isótopos de átomos estables a partir de sustratos en biomarcadores microbianos, tales como ácidos grasos de fosfolípidos derivados de, ADN, ARN y 5. Al considerar los ácidos nucleicos, la metodología se basa en la separación de 13 ADN marcado con C o ARN a partir del ADN no marcado por ultracentrifugación en gradiente de densidad 6. Debido a esta conexión directa entre la etiqueta de ADN y la actividad metabólica, un análisis molecular de aguas abajo de los ácidos nucleicos identifica la especie y proporciona información sobre las actividades metabólicas. Por otra parte, la combinación de ADN-SIP y pirosecuenciación tal como se aplica porPilloni, von Netzer, et al. 15, permite una identificación sencilla y sensible particular de las especies de bacterias presentes en la fracción de ADN pesado 13 C-etiquetados. Hasta ahora, esta técnica se ha aplicado para describir las comunidades bacterianas involucradas en los procesos biogeoquímicos en el suelo bajo aeróbicas y anaeróbicas 16,17 18,19 condiciones. Además del uso en las ciencias ambientales, la técnica se ha aplicado en las ciencias médicas según lo informado por Reichardt, et al. 5, que describe las actividades metabólicas de los diferentes grupos filogenéticos de la microbiota intestinal humana en respuesta a un carbohidrato no digerible. Aquí utilizamos 13 C-glucosa para &quot;etiqueta&quot; el ADN de las especies de bacterias metabólicamente activas en el intestino. La glucosa es un azúcar utilizado por la mayoría de las especies bacterianas a lo largo de la vía de Entner-Doudoroff generalizada (ED), aunque se conocen excepciones 20. Estejustifica el uso de 13 C-glucosa como sonda metabólica confiable que proporciona un vínculo entre los metabolitos de interés y la fuente de carbono a lo largo de las vías establecidas. Dependiendo de la pregunta científica, otros sustratos, es decir, 13 C-metano, 13 CO 2, o plantas cultivadas en una atmósfera de 13 CO 2, se puede utilizar para hacer frente a las actividades metabólicas. En este punto, se presenta el protocolo utilizado en la caracterización metabólica de la comunidad bacteriana del intestino de un insecto generalista, es decir, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Por otra parte, la técnica se acopló a la pirosecuenciación, que a su vez permite la identificación de la comunidad bacteriana de intestino de insecto con alta resolución y precisión. A medida que el sustrato principal, 13 de glucosa marcada con C se utilizó durante los experimentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872"> 
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Dumont #5 Mirror Finish Forceps</td>
			<td style="width:203px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:135px;">11251-23</td>
			<td style="width:151px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speed Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>5305 000.304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH Co. Germany</td>
			<td>P986.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoVue spectrophotometer</td>
			<td>GE HealthCare, UK</td>
			<td>28-9569-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler pro/thermocycler</td>
			<td>Eppendorf Germany</td>
			<td>6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge (Optima L-90K)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>A20684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge rotor (NVT 90)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>362752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick-Seal, Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transilluminator UVstar 15 </td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metabolically active bacteria in the gut of the generalist spodoptera littoralis via dna stable isotope probing using 13c-glucose

Tripas de la mayoría de los insectos son habitadas por comunidades complejas de bacterias no patógenas simbióticas. Dentro de estas comunidades microbianas es posible identificar especies comensales o bacterias mutualistas. Estos últimos, se han observado para servir a múltiples funciones para el insecto, es decir, ayudar en la reproducción de insectos 1, reforzar la respuesta inmune 2, la producción de feromonas 3, así como la nutrición, incluyendo la síntesis de los aminoácidos esenciales 4, entre otros. Debido a la importancia de estas asociaciones, se han hecho muchos esfuerzos para caracterizar las comunidades hacia abajo a los miembros individuales. Sin embargo, la mayoría de estos esfuerzos se basaban en métodos de cultivo o se basó en la generación de fragmentos del gen 16S rRNA que se secuenciaron para la identificación final. Desafortunadamente, estos enfoques sólo identificaron las especies bacterianas presentes en el intestino y no proporcionaron Informatde iones sobre la actividad metabólica de los microorganismos. Para caracterizar las especies bacterianas metabólicamente activas en el intestino de un insecto, hemos utilizado isótopos estables (SIP) in vivo empleando 13 C-glucosa como un sustrato universal. Esta es una técnica de cultivo libre prometedora que permite la vinculación de las filogenias microbianos para su actividad metabólica particular. Esto es posible mediante el seguimiento, la etiqueta de isótopos de átomos estables a partir de sustratos en biomarcadores microbianos, tales como ADN y ARN 5. La incorporación de isótopos 13 C en el ADN aumenta la densidad de la etiqueta de ADN en comparación con el no marcado (12 C) uno. En el extremo, el ADN marcado con C 13 o de ARN se separaron por ultracentrifugación en gradiente de densidad de la C-12 no marcado uno similar 6. Posterior análisis molecular de los isotopómeros de ácido nucleico separadas proporciona la conexión entre la actividad metabólica y la identidad de las especies. A continuación, presentamos el protocolo utilizado para caracterizar las bacterias metabólicamente activas en el intestino de un insecto generalista (nuestro modelo de sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). El análisis filogenético del ADN se realizó utilizando la pirosecuenciación, lo que permitió alta resolución y precisión en la identificación de intestino de insecto de la comunidad bacteriana. Como sustrato principal, se utilizó 13 de la glucosa marcado con C en los experimentos. El sustrato se alimenta a los insectos utilizando una dieta artificial.

Para conseguir el marcaje suficiente de las bacterias metabólicamente activas presentes en el intestino del insecto, el insecto debe ser expuesto al sustrato 13 C-rica durante un período previamente optimizado suficiente para permitir la separación de la fracción más pesada marcado fácilmente de la no marcado uno más ligero. En nuestro caso, 13 C-glucosa fue complementado en la dieta artificial a una concentración final de 10 mM durante 1 día (figura 1A). La misma cantidad...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose at JoVE.co

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.

La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

Guts of most insects are inhabited by complex communities of symbiotic nonpathogenic bacteria. Within such microbial communities it is possible to ...

identification-metabolically-active-bacteria-gut-generalist

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

15.2K vistas.  Max Planck Institute for Chemical Ecology.  La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión. 

Video: Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Extracción de ADN de los microbios del intestino de las termitas (Zootermopsis Angusticollis) y visualizar microbios intestinales

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Investigación

Biología

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocolo experimental para el uso de Drosophila como sistema modelo de invertebrado para ensayos de toxicidad en el laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Establecimiento De Cultivos Binarios Estables De Saccharibacterias Simbióticas De La Cavidad Oral

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...