Este protocolo utiliza la detección del índice de refracción para medir los subproductos del metabolismo del carbono que se acumulan comúnmente en sistemas libres de células basados en lisato. También hace uso de la espectrometría de masas para detectar un panel aún más amplio de metabolitos centrales que se generan en los lisados metabólicamente activos. Las dos técnicas utilizadas en este protocolo proporcionan la capacidad de describir cuantitativamente las reacciones químicas que ocurren en un sistema basado en lisato y libre de células, lo que permite detectar una gama más amplia de metabolitos, incluidos los presentes en bajas concentraciones en el fondo de lisato complejo.
En la demostración de los procedimientos estarán Jaime Lorenzo Dinglasan y David Reeves, investigadores graduados de la División de Biociencias. Comience combinando los diferentes componentes en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para preparar reacciones finales con 4,5 miligramos por mililitro de proteína de lisato total. Preparar reacciones de ingeniería metabólica libre de células, o CFME, con volúmenes finales de 50 microlitros por triplicado por punto de tiempo.
Terminar las reacciones triplicadas en sus puntos de tiempo apropiados inmediatamente agregando un volumen igual de ácido tricloroacético al 5% al volumen de reacción final de cada muestra. Luego diluya cada muestra agregando dos veces el volumen de agua estéril a cada mezcla de reacción. Para recapitular el tiempo cero, mezcle el mismo volumen de ácido tricloroacético al 5% que el volumen total de reacción final con el lisato antes de agregar el resto de los componentes de la reacción.
Este paso de acidificación precipita las enzimas de lisato antes de que metabolizen significativamente la glucosa. Vórtice las muestras y centrífuga en una microcentrífuga de sobremesa a 11, 600 veces g durante cinco minutos, y transfiera los sobrenadantes que contienen los analitos orgánicos a los tubos limpios. Almacene las muestras a menos 20 grados centígrados si los análisis de HPLC se realizarán más adelante.
Asegúrese de descongelar las muestras almacenadas en hielo antes de continuar con el siguiente paso. Filtre cada sobrenadante con un filtro de poro de 0,22 micrómetros. Después de la centrifugación, transfiera cada filtrado a un vial de vidrio HPLC limpio.
Cargue los viales en la bandeja de muestreado automático del sistema HPLC que ya se ha configurado para su análisis. En la barra de menús, seleccione Secuencia, Nueva plantilla de secuencia. Seleccione Secuencia.
Guarde la plantilla de secuencia como nombre de plantilla de secuencia S.Seleccione secuencia, tabla de secuencia. Anexar N filas correspondientes a N viales. A continuación, introduzca las posiciones de los viales y los nombres de las muestras en Vial y Nombre de la muestra, respectivamente, de acuerdo con su disposición en la bandeja del muestreador automático.
Seleccione el método generado como se describe en el manuscrito en el menú desplegable Nombre del método e introduzca 50 microlitros como inyección por vial para cada fila. Haga clic en Aplicar y guarde la plantilla de secuencia seleccionando Secuencia, Guardar plantilla de secuencia. Asegúrese de que la plantilla de secuencia esté cargada seleccionando Secuencia, Plantilla de secuencia de carga, nombre de plantilla de secuencia S.Después de lograr una línea de base estable en la gráfica en línea, haga clic con el botón derecho en el panel Módulo RID, Control, Válvula de reciclaje desactivada para dirigir el flujo de disolvente a través del detector RID al desperdicio.
Para iniciar la adquisición de datos, seleccione Secuencia en la barra de menús y, a continuación, seleccione Tabla de secuencia, Ejecutar. Seleccione Vista de análisis de datos en el menú Ver. Busque el nombre del archivo de secuencia en la lista de archivos en el lado izquierdo de la pantalla.
En el panel central de la pantalla, vaya a Selección de vista de señal, Señal RID para ver los cromatogramas de muestra. Seleccione una fila correspondiente a cualquiera de las muestras en el panel superior de la pantalla. Los picos correspondientes a los analitos objetivo se organizarán a lo largo del eje de tiempo de retención como glucosa, succinato, lactato, formiato, acetato y etanol en muestras donde todos estos metabolitos están presentes.
Discernir si los picos de interés están bien integrados por el software. Se debe dibujar automáticamente una línea roja como base de cada pico. Si la línea roja está torcida, la integración automática ha fallado.
A continuación, seleccione el botón Integración manual del conjunto de herramientas de integración y dibuje manualmente una base de pico para integrar el área de pico. Seleccione la herramienta Cursor del Conjunto de herramientas común para hacer clic en los picos correctamente integrados. El área de pico y el tiempo de reacción correspondiente del pico seleccionado se resaltarán como una fila de tabla en el panel inferior fuera de la pantalla.
Para exportar áreas pico, seleccione Archivo, Exportar, Resultados de integración. Trazar los valores del área pico frente a las concentraciones conocidas de muestras en una hoja de cálculo. Haga clic con el botón secundario en los datos trazados y, a continuación, seleccione Agregar línea de tendencia, Formato de línea de tendencia, Mostrar ecuación en el gráfico.
En una hoja de cálculo separada, use las ecuaciones de las líneas de tendencia de curva estándar para convertir los valores de área pico en concentraciones para cada analito de cada muestra. Calcule las áreas pico promedio y los valores de error estándar entre triplicados para la visualización de datos. Establezca reacciones triplicadas por punto de tiempo, excepto el tiempo cero, en hielo como se describe en el manuscrito.
En lugar de glucosa, use una concentración final de glucosa 100-milimolar-13C6 en las reacciones. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados durante una, dos y tres horas. Para comenzar con el análisis, pipetee un volumen equivalente del disolvente de extracción a cada muestra.
Si las muestras se congelaron, agregue el disolvente de extracción antes de que las muestras se descongelen por completo para evitar la reactivación del metabolismo de la glucosa. Realice todos los pasos de procesamiento de muestras en hielo. Para recapitular el tiempo cero, pipetear el volumen final del disolvente de extracción a un volumen apropiado de lisato para la concentración final deseada de 4,5 miligramos por mililitro en 50 microlitros de volumen de reacción.
Agregue el resto de los componentes de reacción como se describió anteriormente. Este paso de acidificación precipita las enzimas de lisato antes de que metabolizen significativamente la glucosa. Incubar las muestras en disolvente de extracción sobre hielo durante 30 minutos con un suave agitación.
Luego centrifuge las muestras a 21, 000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius para separar el sobrenadante de la proteína precipitada. Transfiera 50 microlitros del sobrenadante a viales de automuestreador y cargue los viales en la bandeja dentro del muestreador automático de cuatro grados centígrados. Después de preparar el instrumento para el análisis, configure una secuencia de ejecución utilizando el software de adquisición e interpretación de datos del sistema LC-MS/MS.
En Roadmap, Sequence Setup, haga clic con el botón derecho en la tabla para insertar tantas filas como ejemplos. Para cada fila, ajuste el volumen de inyección a cinco microlitros y la posición a la posición respectiva del vial en la bandeja del muestreador automático. Introduzca nombres de archivo como nombres de ejemplo y establezca la ruta de archivo deseada para los resultados de la ejecución.
Para iniciar la ejecución, resalte todos los nombres de archivo de la secuencia. En la barra de menús, seleccione Acciones, Ejecutar secuencia. Abra MZmine e importe los archivos de salida sin procesar obtenidos anteriormente.
En la barra de menús, seleccione Métodos de datos sin procesar, Importación de datos sin formato y seleccione los archivos correspondientes a los ejemplos. Siga los pasos descritos en el manuscrito para completar el análisis de MZmine. Exporte las áreas de pico sin procesar al final del análisis de MZmine como un archivo CSV.
Abra una hoja de cálculo para calcular las masas de metabolitos etiquetados con 13C del metabolismo de la glucosa para la búsqueda dirigida. Utilice masas calculadas de metabolitos etiquetados con 13C para buscar y anotar características de masa a carga a partir de los resultados de MZmine. Compruebe manualmente los espectros de las anotaciones putativas en un navegador de calidad para confirmar las anotaciones.
Abra Roadmap, Qual Browser. Desde la barra de herramientas, abra el archivo sin procesar para importar datos de MS sin procesar de cada muestra. Dibuje una línea por debajo del rango deseado de tiempos de retención correspondiente a la anotación putativa en el cromatograma iónico total para ver un espectro de masas.
En los experimentos de HPLC-RID, la glucosa se consumió dentro de las primeras tres horas de la reacción y se fermentó principalmente a lactato. La acumulación de etanol también ocurrió significativamente dentro de las primeras tres horas de la reacción y se detuvo a partir de entonces. El acetato estuvo presente inicialmente en las reacciones como un componente del tampón S30 y solo se acumuló debido al metabolismo después de seis horas, cuando el consumo de glucosa se había ralentizado.
Por lo tanto, el lactato y el etanol pueden considerarse como los principales productos finales de fermentación en el metabolismo de la glucosa libre de células a base de lisato. Se observó que tanto el formiato como el succinato se sintetizaron como productos de fermentación menores. La glucosa-13C6 se consumió observablemente a través de la glucólisis, como lo demuestran las fluctuaciones en los intermedios glicolíticos.
De acuerdo con los datos de detección del índice de refracción de HPLC, la glucosa se acumuló en lactato-13C3 y también se fermentó a succinato-13C3 dentro de las primeras tres horas de la reacción. También se observó la incorporación de carbonos derivados de la glucosa-13C6 a los fosfatos de azúcar 6-fosfogluconolactona, 6-fosfogluconato, ribulosa-5-fosfato y sedoheptulosa-7-fosfato, confirmando la participación de la vía de la pentosa fosfato en el metabolismo de la glucosa de lisato. Se encontró que el metabolismo de la glucosa lisada alimenta la síntesis de tirosina-13C9, al tiempo que proporciona un precursor para la producción de histidina-13C5.
Es importante que las muestras de control representen con precisión el tiempo cero. Por lo tanto, asegúrese de que las proteínas en el lisato se inactivan antes de mezclar en la solución que contiene fuentes de energía. También asegúrese de que la integración automática de picos de muestras de prueba, muestras de control y estándares también sea consistente, de modo que las áreas de pico extraídas sean comparables.
