Nuestro protocolo se puede utilizar para visualizar la complejidad estructural de los organoides, permitiendo el mapeo de la identidad, el sulfato y la distribución en estas estructuras 3D a la resolución de una sola célula. Nuestro protocolo rápido de tres días está totalmente optimizado para organoides de diverso origen y utiliza una preparación sencilla de muestras, que incluye un paso de compensación óptica no tóxico y un método de montaje basado en silicio. Aunque nuestro protocolo es sencillo, algunos de ellos son pasos críticos como el manejo organizado, o la preparación de la diapositiva, se pueden explicar mejor a través de la demostración visual que a través del texto.
Para recuperar organoides de 100 a 500 micrómetros de diámetro cultivados en extracto de membrana sótano en placas de 24 pozos, lave cada soldadura para ser cosechada con PBS sin interrumpir las matrices 3D, y coloque la placa sobre hielo. Agregue un mililitro de solución de recuperación helada a cada pozo y coloque la placa en una coctelera horizontal a cuatro grados Centígrados durante 30 a 60 minutos. Sumerja las puntas de una pipeta de un mililitro en una solución de 1%BSA en PBS y pipetee hacia arriba y hacia abajo dos veces para cubrir cada punta con BSA.
A continuación, agregue cinco mililitros de 1%PBS BSA a un tubo de 15 mililitros por condición, e invierta el tubo dos o tres veces antes de desechar la solución, para recubrir el interior del tubo. Para recoger los organoides, utilice una punta recubierta para re-suspender suavemente el contenido del pozo de cinco a 10 veces, y tire de todos los organoides de cada condición en un solo tubo recubierto de 15 mililitros. Enjuague cada pozo con un mililitro de BSA de hielo 1%PBS para asegurarse de que se han recogido todos los organoides, y transfiera los lavados a los tubos apropiados.
Traiga el volumen final en cada tubo hasta 10 mililitros con PBS frío, y sedimente los organoides por centrifugación para obtener una paleta apretada sin una capa visible de matriz 3D. Para fijar los organoides, utilice una punta de pipeta recubierta de un mililitro para re-suspender cuidadosamente cada pellet en un mililitro de para formaldehído helado, y fijar a cuatro grados Celsius durante 45 minutos. Rea suspenda suavemente los organoides a la mitad del tiempo de fijación.
Después de 45 minutos, agregue 10 mililitros de PBS helado más 20 preadolescentes a cada tubo y mezcle suavemente por inversión, antes de colocar los tubos a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Para bloquear los organoides, al final de la incubación, gire hacia abajo las muestras y vuelva a suspender los gránulos en al menos 200 microlitros de tampón de lavado organoides helados por pozo a planchar. Luego transfiera los organoides a pozos individuales de una placa de suspensión de 24 pozos para una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Para el etiquetado inmunológico añadir 200 microlitros de tampón de lavado organoides en un pozo de referencia vacío, y permitir que los organoides se asienten en la parte inferior de la placa. Cuando los organoides se hayan asentado, incline la placa en un ángulo de 45 grados para permitir la extracción de todos los microlitros excepto los últimos 200 de tampón de lavado. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón de lavado organoide que contengan los anticuerpos primarios de interés, y coloque la placa durante la noche a cuatro grados centígrados con balanceo suave y temblores a 40 revoluciones por minuto.
A la mañana siguiente, agregue un mililitro de tampón de lavado organoide a cada pozo, y deje que los organoides se asienten en la parte inferior de la placa durante tres minutos. Cuando los organoides se hayan asentado, retire todos menos los últimos 200 microlitros de cada pozo, y lave los organoides con tres lavados de dos horas con un mililitro de tampón de lavado organoide fresco, y meceduras y temblores suaves por lavado. Después del tercer lavado, deje que los organoides se asienten en la parte inferior de la placa durante tres minutos antes de retirar todos los microlitros de cada pozo, excepto los últimos 200, de cada pozo.
Añadir 200 microlitros de tampón de lavado organoides que contengan los anticuerpos secundarios apropiados a cada pozo para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados con balanceo y agitación leves. A la mañana siguiente, lave los organoides con tres lavados de dos horas en un mililitro de tampón de lavado organoide fresco por lavado, como se ha demostrado. Después del último lavado, transfiera los organoides a un tubo de 1,5 mililitros por pozo, y recoja los organoides por centrifugación.
Para la limpieza óptica de los organoides, retire el mayor tampón de lavado posible de cada tubo, sin interrumpir los organoides, y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros modificada para agregar al menos 50 microlitros de FUnGI a cada pellet. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, los organoides se pueden almacenar hasta una semana a cuatro grados centígrados, o hasta seis meses a menos 20 grados centígrados. Para preparar diapositivas para imágenes organoides mediante microscopía confocal, llene una jeringa de 10 mililitros con un sellador de silicona y conecte una punta de pipeta de 200 microlitros modificada a la jeringa.
Utilice la jeringa para dibujar un rectángulo de uno por dos centímetros en el centro de una diapositiva, y utilice una segunda punta de pipeta de 200 microlitros modificada para colocar organoides despejados en el centro del rectángulo. Para colocar un resbalón de cubierta sobre los organoides, coloque el lado izquierdo del resbalón de la cubierta hacia abajo primero, antes de bajar lentamente el resbalón de la cubierta de izquierda a derecha hasta que no haya aire atrapado. A continuación, aplique suavemente presión a todos los bordes del resbalón de la cubierta para fijarlo firmemente al sellador de silicona.
Para crear imágenes de los organoides, coloque la diapositiva en el escenario de un microscopio de escaneo láser confocal y seleccione un objetivo de inmersión múltiple de 25 X para imágenes confocales. Ajuste el microscopio a los ajustes de adquisición adecuados, seleccionando una baja potencia láser para reducir el blanqueo fotográfico. Utilice el modo de pila Z para definir los límites superiores del extremo inferior y establezca el tamaño del paso Z en óptimo.
Cuando utilice imágenes de estructuras organoides grandes, o múltiples organoides juntos, utilice el modo de mosaico con una superposición del 10% e indique el área de interés. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, obtenga una representación renderizada en 3D de la imagen en el software de imágenes y optimice las propiedades de brillo, contraste y representación 3D. A continuación, exporte instantáneas RGB de los resultados como archivos TIFF.
La fuerza de las imágenes 3D en comparación con las imágenes 2D se ilustra con estas imágenes de organoides de la glándula mamaria del ratón que se generaron como se demostró. La capa central de estos organoides representativos consiste en células luminales positivas K8/K18 en forma de columnar, y la capa externa contiene células de albahaca K5 positivas alargadas, recapitulando la morfología de la glándula mamaria in vivo. Esta organización polarizada es difícil de apreciar desde una sección óptica 2D del mismo organoide.
Otro ejemplo de una estructura compleja que es imposible de interpretar sin información 3D es la red de canalículos positivos MRP2 que facilitan la recolección del líquido biliar de los organoides hepáticos humanos. Además, la calidad y resolución obtenidas permite la segmentación semiautomática y el análisis de imágenes. Por lo tanto, los números de células totales y la presencia de marcadores se pueden cuantificar en subtipos celulares específicos en organoides enteros.
Al segmentar los núcleos de un organoide completo que contiene 140 células, se pueden identificar tres células que muestran una alta positividad para el marcador del ciclo celular Ki67. El agente de compensación óptica, FUnGI, supera a la limpieza no clara y fructosa-glicerol en calidad de señal fluorescente en profundidad dentro de un organoide. Con los organoides despejados FUnGI que demuestran una intensidad de fluorescencia mejorada general en comparación con los organoides no aclarados.
Tenga en cuenta que cualquier BME sobrante en la muestra puede resultar en una penetración de anticuerpos reducida y puede conducir a una señal de fondo alta. Además, los organoides quísticos no deben limpiarse ópticamente si colapsan. Con ligeras adaptaciones al protocolo, las muestras se pueden utilizar con super resolución confocal, multi fotón y microscopía de hoja de luz.
