Los autores agradecen Chalid Ghadban por su excelente asistencia técnica, Andreas Wodarz y Stephan ploma por su asesoramiento técnico en relación con confocal y microscopía de lapso de tiempo. No hay conflicto de intereses para cualquiera de los autores. Este trabajo es financiado por el Consejo Alemán de Investigación (DFG) en el Proyecto 2 de Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), por los Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Alemania) y por el Programa de Investigación de la Facultad de Medicina de la Georg-August-Universität Göttingen, Alemania.

Este nuevo modelo es una adaptación de un enfoque de cortes de cerebro organotípicos del hipocampo publicado previamente 9-12. Las modificaciones y adiciones se introdujeron para optimizar las interacciones de tejido de cáncer de células cerebrales y para garantizar la reproducibilidad. El estudio fue revisado y aprobado por el comité de ética local. Los animales fueron tratados cuidadosamente de acuerdo con las directrices para el cuidado de animales de la Medicina de la Universidad de Gotinga. El organotípico cocultivo de cortes de cerebro se puede subdividir en dos pasos. El primer paso es la preparación de la rebanada de cerebro organotípicos. Paso dos comprende la preparación de células tumorales y la deposición en el modelo de cocultivo. 1. Organotípicos Cerebro Slice <ol><li> Preparar el medio de disección que consiste en medio esencial mínimo (MEM), suplementado con glutamina 0,2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 4,5 mg / ml de glucosa. </li><li> Decapita a los ratones de cualquier cepa de ratón entre el día postnatalseis y ocho (P6-8). </li><li> Retire el cerebro rápidamente desde el cráneo bajo condiciones asépticas y la transfiere a un medio de disección enfriado con hielo. </li><li> Retire el polo frontal y el cerebelo de toda la sección del cerebro. </li><li> Fijar y estabilizar el cerebro en una etapa con pegamento crio y 5% de agarosa. </li><li> Cortar las secciones del cerebro horizontalmente hasta un espesor de 350 micras utilizando un vibratome. </li><li> Recoger cinco y cincuenta y seis rebanadas de todo el cerebro de un solo cerebro de ratón, dependiendo de la especie y la edad. </li><li> Preparar el medio de cultivo que consiste de 50% MEM, solución salina equilibrada de 25% de Hanks (HBSS), 25% de suero de caballo normal (NHS), glutamina 0,2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (Sigma, Múnich, Alemania), y glucosa 4,5 mg / ml. </li><li> Ponga cada pedazo de cerebro organotípicos en un m policarbonato transwell inserto de membrana 0.4 en una placa de seis pocillos con 1 ml de medio de cultivo en el menor también. </li><li> Organotípico Cultura rebanadas del cerebro durante la noche en una humidified atmósfera con 5% de CO2 a 37 ° C incubadora. </li></ol> 2. El Modelo Slice Coculture <ol><li> Incrustar 10 5 de tumor de GFP-transfectadas u otras células (por ejemplo, células MCF-7-GFP) en 20 l matriz de gel, que consta de 15% medio RPMI y 85% en gel de ECM. </li><li> Coloque la mezcla matriz de células MCF-7-gel en un espaciador metálico estéril (3,8 mm de diámetro) directamente adyacente a la región cortical de la rebanada de cerebro organotípicos y se incuba durante 2 hr. </li><li> Retire el espaciador y deje que el esferoide tumor 3D para co-cultivo con la rebanada organotípicos de 24-96 h. </li><li> Cambie el medio de cultivo cada dos días. </li></ol> 3. Inmunofluorescencia tinción de astrocitos y Microglial en el cerebro organotípicos rebanada Coculture <ol><li> Fijar el organotípico cocultivo de cortes de cerebro con 4% paraformaldehido durante 8 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar el cocultivo rebanada con PBST (PBS con 0,5% de Triton X-100) durante 5 min. </li><li> Bloquee las sejemplos con suero normal de cabra en PBST (01:20) a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Teñir los astrocitos mediante la incubación de la co-cultivo de cortes de cerebro con fibrilar glial anti-anticuerpo monoclonal proteína ácida (GFAP, 1:200 en PBST) durante 36 horas a 4 ° C seguido de cabra anti-ratón-TRITC (1:100 en PBST) tinción durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las muestras con PBST tres veces durante 5 min. </li><li> Tinción de las células de la microglía con ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 en PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Contrateñir el cocultivo de cortes de cerebro con DAPI (1:1000) durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Monte y cubreobjetos cocultivo de cortes de cerebro con medio de montaje DAKO fluorescente. </li><li> Evaluar el grado de invasión del tumor basado en el siguiente sistema de puntuación: 0 = ninguna de las células; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 de las células invadidas (primera medir la longitud de la sección de contacto entre el tapón del tumor y la rodaja, y luego medir el fraccionamienton de contacto detectable por las células invasoras). </li></ol> 4. Imágenes en vivo de la interacción entre células gliales y tumorales <ol><li> Lleve a cabo el experimento en una Leica DMI 6000B invertida microscopio a 10X lente de aumento y una cámara CCD 350 FX Leica DFC. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Investigaciones histológicas previas de la metástasis cerebral demostraron cambios rápidos y drásticos de las células gliales residentes, especialmente de los astrocitos y microglia 13. Para estudiar estos cambios y las interacciones con las células de carcinoma, este novedoso sistema de cocultivo es muy adecuado. Otros campos de investigación ya tienen experiencia de muchos años con cortes de cerebro organotípicos del hipocampo. Una ventaja es que los cultivos de cortes de cerebro organotípicos de hipocampo son viables y efectivamente conservado de días a semanas, lo que es adecuado para los experimentos a largo plazo. Desde la introducción de Stoppini del sistema de cortes de hipocampo organotípicos en 1991, que ha sido ampliamente utilizado, por ejemplo en la investigación de enfermedades degenerativas. Por lo tanto, este sistema de cocultivo innovador representa una modificación de un enfoque bien establecido con una amplia gama de aplicaciones en la biología del tumor 9,11. La modificación nos ofreció un modelo reproducible para evaluar el grado de invasión del tumor afterwards y culturas cultivadas por el método de interfaz son ideales para experimentos que requieren una estructura tridimensional. Varias técnicas se han utilizado para el cocultivo cortes de hipocampo organotípicos con otras células. Estos incluyen un sistema indirecto entre las células de macrófagos y la de cortes de cerebro organotípicos 14, y un cocultivo directo de dos rebanadas diferentes de la región del hipocampo 15. Agregados de glioma también se han cocultivadas con rodajas de cerebro 16. Estos modelos se pueden utilizar para analizar los eventos celulares y moleculares en las rodajas de cerebro, pero no permiten el contacto directo, fisiológica entre las células tumorales, la microglía y el parénquima cerebral. Además, este método permite la observación de la microglia y sin contaminación de óseas derivadas de médula periféricos monocitos / macrófagos. El uso de CCR2 y CX3CR1 modelo de ratón transgénico es una mejora crítico debido al hecho de que es difícil distinguir la microglía residente de la invasión de monocitoscon base en sus propiedades similares 17,18,19. Aunque la inyección intracerebral de células de carcinoma permite la investigación de la progresión del tumor, no puede decir mucho en cuanto a si las células como los macrófagos-rodeadas originan a partir de la población de la microglía residente-cerebro o de la médula derivadas de médula periféricos monocitos / macrófagos 17. El equipo de Kettenmann introdujo un modelo de cortes de cerebro organotípicos que involucró a la inoculación de células de glioma en rodajas de cerebro con un micromanipulador 20. Sin embargo, los gliomas malignos primarios difieren en muchos aspectos de los carcinomas metastásicos. En primer lugar, los gliomas malignos son de origen mesenquimal, no hacen metástasis fuera del sistema nervioso, y migran / invadir las células como simples sin la frontera entre el tumor y el tejido cerebral. Por el contrario, el crecimiento infiltrante es una característica típica patológica, y estos carcinomas generalmente migrar / invaden como cohortes. En segundo lugar, los carcinomas a menudo tratan de reconstruir las estructuras epiteliales en el cerebro, mientras que las células glialestratar de separar el tumor del tejido cerebral por un (pseudo) cápsula. Teniendo en cuenta las características biológicas y morfológicas, glioma maligno y metástasis de carcinomas no son realmente comparables. Por estas razones, hemos modificado y desarrollado un sistema de co-cultivo, donde no nos cocultivo inyectamos pero un tapón celular de carcinoma adyacente a la sección de cerebro. Asimismo, se observó la microglia y la acumulación de los astrocitos en la frontera de la clavija del tumor, lo que significa que la microglia entran en el enchufe del tumor y pueden ser detectadas fácilmente por microscopía de campo brillante y confirmaron posteriormente mediante microscopía confocal. Las células cancerosas invaden el corte de cerebro, que es comparable a la situación real en vivo y para una observación hecha por Baumert y sus colegas, quienes encontraron una zona de infiltración en el 63% de los casos de autopsia con metástasis cerebrales 21. Debido a la perfusión de la sangre falta, hay sólo residente macrófagos / microglia en esta cultura. Por otra parte, debido a la mIssing células T y, por lo tanto, ausente alo-reactividad, células de carcinoma humano podrían ser utilizados para cocultivo incluso con secciones de cerebro de ratones o ratas inmunocompetentes (NMRI, B6, o Wistar). Esto podría servir como una alternativa al modelo de ratón desnudo. Desde cuatro y cincuenta y seis rebanadas se pueden obtener de cada ratón, se requieren reducidas significativamente el número de animales, en comparación con los modelos de inyección existentes. Además, los animales no sufran durante un largo período de enfermedad metastásica y que no se someten a procedimientos quirúrgicos repetitivamente 22. Con este sistema de cocultivo, hemos demostrado la activación de la microglia por las células cancerosas y la capacidad de promover la invasión de células de cáncer. Además, esta es la primera vez, a nuestro conocimiento, no se encontraron microglia para transportar activamente células de carcinoma 23. A pesar de todas estas ventajas, el sistema de co-cultivo tiene, de hecho, también limitaciones. Todavía es un in vitromodelar falta las etapas de la metástasis antes de la colonización. Debido a la falta de perfusión, no es posible estudiar la extravasación. Por lo tanto, la forma alternativa de estudiar la extravasación es utilizar ya sea el modelo in vivo en inyección o el sistema de cámara de Boyden modificada con matriz extracelular, HUVEC y astrocitos para imitar la barrera sangre-cerebro 22,24. El método de cocultivo de cortes de cerebro es todavía un modelo fiable y reproducible con muchas ventajas y un potencial para una amplia variedad de aplicaciones, tales como el análisis de la colonización, en particular, con un enfoque sobre el papel de las células residentes. La combinación con otras técnicas establecidas (como la inmunohistoquímica, microscopía confocal y microscopía de lapso de tiempo) apoya la investigación de las interacciones directas de célula a célula. Es una alternativa y complementación de otras técnicas de fácil y ofrece acceso a la investigación de los indicios y efectos como impuestas por el microambiente metastásico.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

Los pacientes con metástasis cerebrales de los carcinomas tienen un mal pronóstico. Sin embargo, el proceso en el lugar de la metástasis apenas se ha investigado, en particular, el papel de las células del estroma (residente). Los estudios en los carcinomas primarios demuestran la influencia del microambiente en la metástasis, incluso en 1,2 pronóstico. Especialmente los macrófagos asociados a tumores (TAM) la migración de apoyo, la invasión y proliferación 3. Curiosamente, los principales sitios diana de la metástasis poseen los macrófagos específicos de tejido, tales como células de Kupffer en el hígado o la microglía en el SNC. Por otra parte, los sitios metastásicos también poseen otras células específicas de tejido, como astrocitos. Recientemente, los astrocitos se demostraron para fomentar la proliferación y la persistencia de las células cancerosas 4,5. Por lo tanto, las funciones de estos tipos de células específicas de tejido parecen ser muy importante en el proceso de 6,7 metástasis cerebral. A pesar de estas observaciones,Sin embargo, hasta ahora no hay una adecuada modelo vivo / in vitro disponible en para visualizar directamente las reacciones gliales durante la formación de la metástasis cerebral, en particular, mediante microscopía de campo claro. Reciente en vivo de imágenes en vivo de las células de carcinoma demostraron su comportamiento colonización cerebral 8. Sin embargo, este método es muy laborioso, costoso y técnicamente compleja. Además, este tipo de experimentos con animales se limitan a series pequeñas y cuentan con un considerable estrés para los animales (por implantación de la placa de vidrio, la inyección de las células tumorales, la anestesia repetitivo y fijación a largo plazo). Además, imágenes in vivo hasta ahora se limita a la visualización de las células de carcinoma, mientras que las interacciones con las células residentes aún no se han ilustrado. Por último, las investigaciones de las células de carcinoma humano en animales inmunocompetentes son imposibles 8. Por estas razones, hemos establecido un sistema de co-cultivo consipicadura de un corte de cerebro de ratón y células epiteliales organotípico incrustado en matrigel (esfera de células en 3D). Las esferas celulares de carcinoma de 3D se colocaron directamente junto al borde de cortes de cerebro con el fin de investigar la invasión del tejido cerebral vecino. Esto nos permite visualizar los cambios morfológicos y de las interacciones entre las células gliales y las células de carcinoma de fluorescencia e incluso por microscopía de campo claro. Después del experimento de cocultivo, el tejido cerebral o los esferoides de células 3D pueden ser recogidos y utilizados para otros análisis moleculares (por ejemplo, QRT-PCR, IHC, o inmunotransferencia), así como para investigaciones por microscopía confocal. Este método se puede aplicar para controlar los eventos dentro de un tejido cerebral para vivir día sin efectos perjudiciales a los cortes de cerebro. El modelo también permite la supresión selectiva y la sustitución de las células residentes por las células de un tejido de un donante para determinar el impacto diferenciado de un determinado genotipo. Por último, el modelo de cocultivo es una alternativa posiblea in vivo enfoques al probar manipulaciones farmacológicas específicas.

En primer lugar, todas las células de carcinoma utilizados (humanos: MCF-7 y murinos: 410,4) invadieron la de cortes de cerebro organotípicos de ratón. La invasión fue por lo tanto en especies independientes (Figura 1A), lo que indica una amplia gama de aplicaciones en una especie de forma independiente. Además, la microglia, así como los astrocitos acumuladas en la interfase como se describe anteriormente en vivo y en muestras de pacientes 13. Proyección de imagen de lapso de tiempo durante un período prolongado de tiempo no sólo reveló la viabilidad de la rebanada, pero también ofrece una buena plataforma para observar las interacciones celulares. Por experimentos de lapso de tiempo, se registraron las células microgliales para entrar en la esfera 3D celular mientras, a su vez, las células cancerosas también invadieron el corte de cerebro (Figuras 1B1-B2). Por otra parte, hemos demostrado previamente la capacidad de la microglia para el transporte de células de carcinoma mediante un mecanismo todavía enigmática para ayudar de ese modo en la invasión de carcinoma. El uso de técnicas de marcaje de inmunofluorescencia, nosco-localizaciones de las células tumorales y las células del estroma (por ejemplo, astrocitos y microglia), tanto en el tejido cerebral y en el enchufe de células tumorales (Figuras 1C-D), lo que sugiere una interacción estrecha entre estas células durante el proceso de invasión descrito. Se obtuvieron resultados comparables cuando rodajas de cerebro de ratón se cocultured ya sea con (Figuras 1D1-D3) células de carcinoma humano (Figuras 1C1-C3) o murino - que muestra la amplia gama de aplicaciones para el estudio de células de diferentes especies, genotipos y cepas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figura 1. Cerebro modelo cocultivo rebanada con un esferoide 3D ​​de ratón y células de carcinoma humano. A) La cuantificación de la invasión de células cancerosas en todo organotypic co-cultivos de sección de cerebro con el cáncer de mama de ratónlínea celular 410.4 o una línea celular de cáncer de mama humano MCF-7. Los datos representan el porcentaje del grado de invasión de células en cortes de cerebro en cada grupo con n ≥ 38. No hubo diferencia significativa entre estos dos grupos (prueba de Kruskal-Wallis). B) imágenes con lapso de tiempo de enteros organotypic co-cultivos de sección de cerebro con células MCF-7-GFP y las imágenes representativas de day2 (B1) y el día 5 (B2) fueron se muestra. imágenes de microscopía CD) confocal mostraron cohortes de carcinomas, astrocitos y microglia. Doble tinción de los astrocitos (anti-GFAP-TRITC, rojo) y microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violeta) de todo el co-cultivo con 350 m de espesor de cortes de cerebro organotípicos y el tapón de células tumorales transfectadas con GFP (verde): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) y 3D-410.4-GFP (D1-D3). Líneas blancas mostraron el borde de la rebanada del cerebro y el frente de la invasión tumoral. Las barras de escala representan 50 micras. La microglia, astrocitos unnd tumores colocalizations (C1 y D1), astrocitos-tumores colocalizations (C2 y D2) y colocalizations microglia-tumorales (C3 y D3) en el co-cultivo rebanada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a>

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Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K vistas.  University of Göttingen.  El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis. 

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

El trasplante de células del estroma mamario y células de carcinoma en los ratones C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Investigación

Medicina

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Un tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura del sistema para estudiar microambiente tumoral y dirigida Medicamentos Terapias

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

Simétrica bihemisférica post-mortem del cerebro de corte para estudiar sana y patológica condiciones cerebrales en humanos

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.