המחברים מודים Chalid Ghadban לסיועו הטכני המעולה, אנדראס Wodarz וסטפן Heermann לייעוץ הטכני שלהם לגבי confocal ומיקרוסקופיה הזמן לשגות. אין ניגוד עניינים לכל אחד מהכותבים. עבודה זו ממומנת על ידי מועצת המחקר הגרמנית (DFG) בפרויקט 2 של Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), על ידי Dres. באייר-Stiftung (אדן Württembergischer Krebspreis, גרמניה) ועל ידי תכנית המחקר של הפקולטה לרפואה, גיאורג אוגוסט-אוניברסיטת גטינגן שבגרמניה.

זה דגם חדש הוא עיבוד של גישת פרוסת המוח בהיפוקמפוס organotypic שפורסמה בעבר 9-12. שינויים ותוספות הוכנסו כדי לייעל את אינטראקציות רקמת סרטן תאי מוח ועל מנת להבטיח שחזור. המחקר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית. טופלו בעלי חיים בזהירות על פי ההנחיות לטיפול בבעלי החיים בגטינגן לרפואה באוניברסיטה. Coculture פרוסת מוח organotypic אפשר לחלק לשני שלבים. שלב הראשון הוא ההכנה של פרוסת מוח organotypic. שלב שני כולל את הכנת תאים הסרטניים ותצהיר במודל coculture. 1. Organotypic מוח פרוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לנתיחה בהיקף של מדיום המינימום ההכרחי (MEM), בתוספת 0.2 גלוטמין מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, ו4.5 מ&quot;ג / מיליליטר של גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכברים מכל זן עכבר בין יום הלידהשישה ושמונה (P6-8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח במהירות מהגולגולת בתנאי aseptic ולהעביר אותו למדיום לנתיחה קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוט הקדמי ובמוח קטן מכל החלק במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן ולייצב את המוח על במה עם דבק cryo וagarose 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את החלקים במוח בצורה אופקית בעובי 350 מיקרומטר באמצעות vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 5:56 פרוסות מוח כולו ממוח עכבר אחת, בהתאם למין וגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התרבות בינונית בהיקף של MEM 50%, פתרון 25% הנקס &#39;מאוזן מלח (HBSS), 25% בסרום סוס רגיל (NHS), 0.2 גלוטמין מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין (Sigma, מינכן, גרמניה), וגלוקוז 4.5 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את כל פרוסה מוח organotypic על הוספת קרום 0.4 מיקרומטר פוליקרבונט transwell בצלחת שש היטב עם 1 מיליליטר של מדיום גידול בנמוך יותר טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לילה פרוסות מוח organotypic התרבות בhumidifieאווירת ד עם 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. דגם Slice Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע 10 5 של גידול-transfected GFP או תאים אחרים (תאים למשל MCF-7-GFP) ב20 מטריצת ג&#39;ל μl, בהיקף של 15% מדיום RPMI ו85% ג&#39;ל ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת מטריצת MCF-7-ג&#39;ל לspacer סטרילי המתכתי (קוטר 3.8 מ&quot;מ) ישירות בסמוך לאזור בקליפת המוח של פרוסת מוח organotypic ו דגירה במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את spacer ולאפשר אליפטית גידול 3D לcoculture עם פרוסת organotypic ל24-96 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מדיום התרבות בכל יום אחר. </li></ol> 3. הכתמה Immunofluorescence של האסטרוציטים וmicroglial בOrganotypic המוח פרוס Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן coculture פרוסת מוח organotypic עם paraformaldehyde 4% במשך 8 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coculture פרוסה עם PBST (PBS עם 0.5% טריטון X-100) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את יםamples עם סרום נורמלי עז בPBST (1:20) בטמפרטורת חדר במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את האסטרוציטים ידי דוגרים coculture פרוסת המוח עם נוגדן fibrillary נגד גליה חומצי חד שבטי חלבון (GFAP, 1:200 בPBST) ל36 שעות ב 4 ° C ואחרי עז אנטי עכבר TRITC (1:100 בPBST) מכתים במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות עם פעמים PBST שלוש למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאי microglial עם ILB 4-Alexa פלואוריד 647 (1:100 בPBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain coculture מוח פרוסה עם DAPI (1:1,000) במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההר וcoverslip coculture פרוסת המוח עם מדיום הרכבה ניאון DAKO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הכיתה של פלישת גידול המבוסס על שיטת הניקוד הבאה: 0 = אף אחד מהתאים; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 מהתאים פלשו (ראשון למדוד את אורכו של קשר הקטע שבין התוספת הגידול ופרוס, ולאחר מכן למדוד את fraction מגע לזיהוי על ידי התאים הפולשים). </li></ol> 4. הדמיה חיה של האינטראקציה בין גליה ותאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הניסוי מתחת לייקה הפוך מיקרוסקופ DMI 6000B ב10X עדשת הגדלה ומצלמת CCD 350 FX היקה DFC. </li></ol>

<ol>
	<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seed+and+soil+hypothesis+revisited--the+role+of+tumor-stroma+interactions+in+metastasis+to+different+organs.">The seed and soil hypothesis revisited--the role of tumor-stroma interactions in metastasis to different organs.</a> Int. J. Cancer. 128, 2527-2535 (2011).</li><li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+metastasis.">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 239-252 (2009).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-related+inflammation.">Cancer-related inflammation.</a> Nature. 454, 436-444 (2008).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+organ+microenvironment+in+brain+metastasis.">The role of the organ microenvironment in brain metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 21, 107-112 (2011).</li><li>Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+enhance+the+invasion+potential+of+glioblastoma+stem-like+cells.">Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells.</a> PloS one. 8, e54752 (2013).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12, 895-904 (2006).</li><li>Eichler, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+brain+metastases-translation+to+new+therapies.">The biology of brain metastases-translation to new therapies.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 344-356 (2011).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Kreutz, S., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+and+neuronal+damage:+differential+effects+of+THC,+AEA+and+2-AG+on+activated+microglial+cells+and+degenerating+neurons+in+excitotoxically+lesioned+rat+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Cannabinoids and neuronal damage: differential effects of THC, AEA and 2-AG on activated microglial cells and degenerating neurons in excitotoxically lesioned rat organotypic hippocampal slice cultures.</a> Exp. Neurol. 203, 246-257 (2007).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Fuller, L., Dailey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rodent+hippocampal+slice+cultures.">Preparation of rodent hippocampal slice cultures.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4848 (2007).</li><li>Lorger, M., Felding-Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+changes+in+the+brain+microenvironment+during+initial+steps+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Capturing changes in the brain microenvironment during initial steps of breast cancer brain metastasis.</a> Am. J. Pathol. 176, 2958-2971 (2010).</li><li>Brana, C., Biggs, T. E., Mann, D. A., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+hippocampal+slice+co-culture+system:+application+to+the+study+of+HIV-induced+brain+damage.">A macrophage hippocampal slice co-culture system: application to the study of HIV-induced brain damage.</a> J. Neurosci. Methods. 90, 7-11 (1999).</li><li>Kim, J. A., Yamada, M. K., Nishiyama, N., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mossy+fiber+pathfinding+in+multilayer+organotypic+cultures+of+rat+hippocampal+slices.">Mossy fiber pathfinding in multilayer organotypic cultures of rat hippocampal slices.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 23, 115-119 (2003).</li><li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model.">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 513-520 (2000).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. , (2011).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J. Immunol. 188, 29-36 (2012).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+microglia.">Physiology of microglia.</a> Physiol. Rev. 91, 461-553 (2011).</li><li>Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+stimulate+the+invasiveness+of+glioma+cells+by+increasing+the+activity+of+metalloprotease-2.">Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 754-762 (2005).</li><li>Baumert, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathology-based+substrate+for+target+definition+in+radiosurgery+of+brain+metastases.">A pathology-based substrate for target definition in radiosurgery of brain metastases.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 66, 187-194 (2006).</li><li>Palmieri, D., Chambers, A. F., Felding-Habermann, B., Huang, S., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+metastasis+to+a+sanctuary+site.">The biology of metastasis to a sanctuary site.</a> Clin. Cancer Res. 13, 1656-1662 (2007).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+colonization+of+brain+tissue+by+breast+cancer+cells+in+a+Wnt-dependent+way.">Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way.</a> Glia. 58, 1477-1489 (2010).</li><li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459, 1005-1009 (2009).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

חקירות היסטולוגית קודמות של גרורות במוח הראו שינויים מהירים ודרסטי של תאי גליה תושב, במיוחד של האסטרוציטים ומיקרוגליה 13. ללמוד את השינויים האלה ואת אינטראקציות עם קרצינומה של התאים, מערכת coculture רומן הזה היא גם מתאימה. כבר יש לי תחומי מחקר אחרים ניסיון ארוך שנים עם פרוסות מוח בהיפוקמפוס organotypic. אחד יתרונות הוא שהתרבויות הפרוסה המוח בהיפוקמפוס organotypic הן קיימא והיעילות השתמרה במשך ימים עד שבועות, מה שהופך אותו מתאים לניסויים לטווח ארוך. מאז ההשקה של Stoppini של המערכת הפרוסה בהיפוקמפוס organotypic ב1991, זה היה בשימוש נרחב, למשל במחקר של מחלות ניווניות. לפיכך, מערכת coculture לחדש זה מייצגת שינוי של גישה מבוססת היטב עם מגוון רחב של יישומים ב9,11 ביולוגיה גידול. השינוי הציע לנו מודל לשחזור כדי להעריך את הציון של af פלישת גידולterwards ותרבויות גדלו בשיטת הממשק מתאימות בצורה אידיאלית לניסויים הדורשים מבנה תלת ממדים. כמה טכניקות שנוצלו כדי coculture פרוסות בהיפוקמפוס organotypic עם תאים אחרים. אלה כוללים מערכת עקיפה בין תאי מקרופאג ופרוסת מוח organotypic 14, וcoculture ישיר של שתי פרוסות שונות מהאזור בהיפוקמפוס 15. אגרגטים גליומה יש גם cocultured עם פרוסות מוח 16. מודלים אלה יכולים לשמש כדי לנתח את האירועים תאיים ומולקולריים בפרוסות המוח, אבל לא מאפשרים מגע ישיר, פיסיולוגי בין תאים סרטניים, מיקרוגליה וparenchyma המוח. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת התצפית של מיקרוגליה ללא זיהום של מונוציטים / מקרופאגים היקפיים המופק ממוח עצם. השימוש במודל עכבר מהונדס CCR2 וCX3CR1 הוא שיפור קריטי בשל העובדה שקשה להבחין מיקרוגליה תושב מפולשים מונוציטיםהמבוסס על המאפיינים דומים שלהם 17,18,19. למרות הזרקה תוך מוחית של קרצינומה של תאים מאפשרת חוקרת התקדמות גידול, שהוא לא יכול להגיד הרבה, האם התאים כמו מקרופאג-המוקף מקורן אוכלוסיית מיקרוגליה מוח תושב או ממונוציטים / מקרופאגים שמקורם במח עצם היקפיים 17. צוות של Kettenmann הציג מודל פרוסת מוח organotypic כי המעורבים ייחסו תאי גליומה לפרוסות מוח עם micromanipulator 20. עם זאת, גליומות הממארת הראשונית שונה בהרבה דרישת שלום מקרצינומות גרורתי. ראשית, גליומות הממארת הן ממוצא mesenchymal, לא לשלוח גרורות מחוץ למערכת העצבים, ולהעביר / לפלוש לתאים בודדים כללא גבול בין גידול ורקמת המוח. לעומת זאת, צמיחת infiltrative היא מאפיין פתולוגי טיפוסי, וקרצינומות כזו בדרך כלל להעביר / לפלוש כקבוצות. שנית, קרצינומות לעתים קרובות מנסות לבנות מחדש את מבני אפיתל במוח, ואילו תאי גלייהמנסה להפריד את הגידול מרקמת המוח על ידי כמוסה (פסאודו). בהתחשב בתכונות ביולוגיות ומורפולוגיים, גליומה וגרורות של קרצינומות הממאירות הן לא ממש דומות. מסיבות אלה, אנו שונה ופיתחו מערכת coculture בו אנחנו לא coculture להזריק אבל התוספת תא קרצינומה סמוכה לפרוסת המוח. יתר על כן, צפינו microglial וצבירת astrocytic בגבול של התוספת הגידול, כלומר, מיקרוגליה להיכנס לתוספת הגידול וניתן היה לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר ואישרו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. התאים הסרטניים לפלוש לתוך פרוסת המוח, שהוא דומה לאמיתי במצב vivo ולתצפית שנעשתה על ידי Baumert ועמיתיו, שמצאו את אזור חדירה ב63% מהמקרים ניתוח שלאחר המוות במוחה גרורות 21. בגלל טפטוף הדם החסר, יש רק מקרופאגים / מיקרוגליה תושב בתרבות זו. יתר על כן, בגלל מ &#39;תאי issing T, ולכן נעדרו allo-תגובתיות, קרצינומה של תאים אנושיים יוכל לשמש עבור coculture אפילו עם פרוסות מוח של עכברים עם מערכת חיסון או חולדות (NMRI, B6, או Wistar). זה יכול לשמש כתחליף לעכבר מודל העירום. מאז ניתן להשיג 4:56 פרוסות מכל עכבר, מספרים מופחתים באופן משמעותי של בעלי חיים נדרשים, בהשוואה לדגמי הזרקה הקיימת. בנוסף, בעלי החיים לא סובלים לתקופה של מחלה גרורתית ארוכה והם לא עוברים תהליכים אופרטיביים שוב ושוב 22. עם מערכת coculture זה, יש לנו הפגין ההפעלה של מיקרוגליה על ידי תאים סרטניים ואת היכולת של קידום פלישת תאי הסרטן. בנוסף, זו הפעם הראשונה, למיטב ידיעתנו, מיקרוגליה נמצאו להובלה באופן פעיל בתאי קרצינומה 23. למרות כל היתרונות הללו, מערכת coculture יש, אכן, גם מגבלות. זה עדיין במבחנהמודל חסר השלבים של גרורות לפני קולוניזציה. בגלל חוסר זלוף, לא ניתן ללמוד את extravasation. לפיכך, הדרך החלופית ללמוד extravasation היא להשתמש גם in vivo המערכת הקאמרית בוידן הותאם מודל הזרקה או עם מטריצה ​​תאית, HUVEC והאסטרוציטים לחקות את מחסום דם מוח 22,24. שיטת coculture פרוסת המוח היא עדיין מודל אמין לשחזור עם יתרונות רבים ופוטנציאל למגוון רחב של יישומים, כגון ניתוח של התישבות, בפרט עם דגש על תפקידם של תאי תושב. שילוב עם טכניקות אחרות שהוקמו (כגון אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיה confocal ומיקרוסקופיה הזמן לשגות) תומך בחקירה של אינטראקציות תא אל התא ישירים. זוהי חלופה קלה ושלמה של טכניקות אחרות, ומציעה גישה לחקירה של הרמזים ואפקטים כמו שהוטלו על ידי microenvironment גרורתי.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt,Germany</td>
			<td>24020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco, Darmstadt , Germany</td>
			<td>32360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>PAA Laboratories Inc., C&#246;lbe, Germany</td>
			<td>E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Pan Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum (NHS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>10091148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>B. Braum, Melsungen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica SM 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>BD Falcon, Heidelberg,Germany</td>
			<td>353090</td>
			<td>transwell membrane insert (0.4 &#956;m pore size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM gel</td>
			<td>Trevigen, R&#38;D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany</td>
			<td>3432-005-01</td>
			<td>Basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic spacer</td>
			<td>Kig GmbG, Kirkel, Germany</td>
			<td>DIN 433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-lapse microscope and camera</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomy microscope</td>
			<td>Zeiss, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>Stemi SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>G3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, F(ab&#39;)2- TRITC</td>
			<td>Santa Cruz, Heidelberg, Germany</td>
			<td>SC3796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>132450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6&#39;-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride)</td>
			<td>Sigma, Steinheim, Germany</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent mounting medium</td>
			<td>DAKO, Glostrup, Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture system with an organotypic brain slice and 3d spheroid of carcinoma cells

יש חולים עם גרורות במוח של קרצינומות פרוגנוזה גרועה. עם זאת, התהליך באתר גרורתי בקושי נחקר, במיוחד את תפקידו של תושב תאים (סטרומה). מחקרים בקרצינומות העיקרית להדגים את ההשפעה של microenvironment על ​​גרורות, אפילו על 1,2 הפרוגנוזה. במיוחד מקרופאגים הגידול משויכים (TAM) הגירת תמיכה, פלישה והתפשטות 3. מעניין לציין, כי אתרי המטרה העיקריים של גרורות ברשות מקרופאגים רקמות ספציפיות, כגון תאי Kupffer בכבד או מיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, האתרים גרורתי גם להחזיק תאי רקמה ספציפית אחרים, כמו האסטרוציטים. לאחרונה, האסטרוציטים הודגמו לטפח התפשטות והתמדה של תאים סרטניים 4,5. לכן, נראה שפונקציות של סוגי תאי רקמות ספציפיות אלה כדי להיות חשובים מאוד בתהליך של 6,7 גרורות במוח. למרות תצפיות אלה,עם זאת, עד עכשיו אין מתאים in vivo / במבחנה מודל זמין ישירות לדמיין תגובות גליה במהלך היווצרות גרורה במוח, בפרט על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר. אחרונים בתחום ההדמיה לחיות vivo של תאי קרצינומה הפגין קולוניזציה ההתנהגות המוחית שלהם 8. עם זאת, שיטה זו היא מאוד מייגע, יקרה ומורכבת מבחינה טכנית. בנוסף, סוגים של ניסויים בבעלי חיים אלה מוגבלים לסדרות קטנות ומגיעים עם לחץ משמעותי עבור בעלי החיים (על ידי השתלה של צלחת הזכוכית, הזרקה של תאים סרטניים, הרדמה חוזרת וקיבוע לטווח ארוך). יתר על כן, in vivo הדמיה מוגבלת עד כה להדמיה של תאי הסרטן, ואילו אינטראקציות עם תאי תושב טרם מאוירות. לבסוף, חקירות של קרצינומה של תאים אנושיים בבעלי חיים עם מערכת חיסון הן בלתי אפשריים 8. מסיבות אלה, הקמנו consi מערכת cocultureעוקץ של פרוסה organotypic עכבר מוח ותאי האפיתל המוטבע בmatrigel (מרחב תא 3D). תחומי תא קרצינומה 3D הונחו ישירות ליד קצה פרוסת המוח כדי לחקור את הפלישה של רקמת המוח הסמוכה. זה מאפשר לנו לחזות שינויים מורפולוגיים ויחסי גומלין בין תאי גליה וקרצינומה של התאים על ידי הקרינה ואפילו על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר. לאחר ניסוי coculture, רקמת המוח או הספרואידים תא 3D יכולה להיות שנאספו ומשמשת לניתוחים נוספים מולקולריים (למשל qRT-PCR, IHC, או immunoblot), כמו גם לחקירות על ידי מיקרוסקופיה confocal. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לפקח על האירועים בתוך רקמת מוח חי במשך ימים בלי השפעות מזיקות לפרוסות המוח. המודל גם מאפשר דיכוי והחלפה של תאי תושב על ידי תאים מרקמות תורמות כדי לקבוע את ההשפעה מובהקת של גנוטיפ נתון סלקטיבית. לבסוף, מודל coculture הוא אלטרנטיבה מעשיתלin vivo גישות כאשר בודקים מניפולציות תרופתי ממוקדות.

ראשית, כל התאים המשמשים קרצינומה (אנושי: MCF-7 והעכבריים: 410.4) פלשו פרוסת מוח עכבר organotypic. הפלישה הייתה אפוא מינים עצמאיים (איור 1 א), אשר מצביעה על מגוון רחב של יישומים באופן מינים עצמאיים. בנוסף, מיקרוגליה, כמו גם האסטרוציטים שנצברו בממשק כפי שתואר לעיל in vivo ו בדגימות מטופל 13. זמן לשגות הדמיה על פני תקופה ממושכת של זמן חשפה לא רק את הכדאיות של הפרוסה, אלא גם הציעה פלטפורמה טובה כדי לבחון את האינטראקציות הסלולר. על ידי ניסויי זמן לשגות, תאי microglial נרשמו להיכנס תוך מרחב תא 3D, בתורו, תאי הסרטן פלשו גם פרוסת המוח (איורים 1B1-B2). יתר על כן, יש לנו הראינו בעבר את היכולת של מיקרוגליה להובלת קרצינומה של תאים על ידי מנגנון עדיין חידתי כדי לסייע בכך בפלישת קרצינומה. באמצעות שימוש בטכניקות תיוג immunofluorescence, אנחנותאר שיתוף מגויר של תאים סרטניים ותאי סטרומה (למשל מיקרוגליה ואסטרוציטים), שניהם ברקמת המוח ובתוספת של תאי גידול (איורים 1C-D), המצביעים על יחסי גומלין הדוקים בין תאים אלה במהלך תהליך הפלישה. תוצאות דומות התקבלו כאשר פרוסות מוח העכבר היו cocultured או עם אדם (איורים 1C1-C3) או עכברי קרצינומה של תאים (איורים 1D1-D3) - מראה את מגוון הרחב של יישומים לחקר תאים ממינים שונים, גנוטיפים וזנים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> איור 1. מודל מוח פרוס coculture עם אליפטית 3D של עכבר וקרצינומה של תאים אנושיים. א) כימות של פלישת תאים סרטנית בcocultures פרוסת המוח כל organotypic עם סרטן שד בעכברשורת תאים 410.4 או שורת תאי סרטן שד אנושית MCF-7. הנתונים מייצגים את אחוז את מידת פלישת תא למוח פרוס בכל קבוצה עם ≥ n 38. לא היה הבדל משמעותי בין שתי קבוצות אלה (מבחן קרוסקל-ארהב). ב &#39;) זמן לשגות תמונות של cocultures פרוסת המוח כל organotypic עם תאי MCF-7-GFP ותמונות מייצגות מday2 (B1) ויום 5 (B2) היו מוצג. תמונות מיקרוסקופיה CD) Confocal הראו קבוצות של קרצינומות, האסטרוציטים ומיקרוגליה. צביעה כפולה של האסטרוציטים (אנטי GFAP-TRITC, אדום) ומיקרוגליה (ILB4-Alexa פלואוריד 647, סגול) של כל coculture עם 350 מיקרומטר פרוסה עבה organotypic המוח ותוספת transfected GFP גידול התאים (הירוקה): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) ו3D-410.4-GFP (D1-D3). מקפים לבנים הראו הקצה של פרוסת המוח ומול פלישת גידול. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר. מיקרוגליה, האסטרוציטיםnd colocalizations גידולים (C1 ו-D1), colocalizations האסטרוציטים-גידולים (C2 ו-D2) וcolocalizations מיקרוגליה גידול (C3 ו-D3) בcoculture פרוסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר</a>

Watch this Scientific Journal Video about Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells at JoVE.com

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב של מניפולציות וניתוחים.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

coculture-system-with-an-organotypic-brain-slice-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K Views.  University of Göttingen.  Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב ש?...

Video: Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

מודל עכבר orthotopic של קרצינומה של בלוטת התריס אנפלסטית

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

סימטרי Bihemispheric לאחר מות מוח חיתוך לחקר בריא והגבלות מוח פתולוגיים בבני אדם

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate personalized patient treatment. However, the absence of tumor-specific microenvironment in currently used models, e.g., patient-derived cell lines and xenografts, only allows limited predictive insights. Organotypic slice cultures (OTSCs) comprise intact multicellular tissue, which can be rapidly used for the spatially resolved drug response testing.
This protocol describes the generation and cultivation of viable tumor slices of pancreatic cancer and its metastasis. Briefly, tissue is casted in low melt agarose and stored in cold isotonic buffer. Next, tissue slices of 300 &#181;m thickness are generated with a vibratome. After preparation, slices are cultured at an air-liquid interface using cell culture inserts and an appropriate cultivation medium. During cultivation, changes in cell differentiation and viability can be monitored. Additionally, this technique enables the application of treatment to viable human tumor tissue ex vivo and subsequent downstream analyses, such as transcriptome and proteome profiling.
OTSCs provide a unique opportunity to test the individual treatment response ex vivo and identify individual transcriptomic and proteomic profiles associated with the respective response of distinct slices of a tumor. OTSCs can be further explored to identify therapeutic strategies to personalize treatment of primary pancreatic cancer and metastasis.

This protocol describes the preparation of organotypic slice cultures (OTSCs). This technique facilitates the ex vivo cultivation of intact multicellular tissue. OTSCs can be used immediately to test for their respective response to drugs in a multicellular environment.