Los cultivos celulares bidimensionales no imitan adecuadamente el crecimiento tumoral in vivo. Para mejorar, se han desarrollado procedimientos 3D utilizando esferoides. Nuestro ensayo basado en el esferoide de glioblastoma 3D es particularmente adecuado para investigar la invasión de tumores cerebrales en el entorno saludable del tumor cerebral.
Los modelos de cultivo tridimensionales se pueden utilizar para recapitular una arquitectura multicelular, heterogeneidad y estado metabólico de los tumores, lo que permite una evaluación más rigurosa de los efectos farmacológicos. Asegúrese de no tocar la parte inferior del pozo o quitar completamente el sobrenadante, para mantener el gel en hielo, y para agregar las células al gel rápidamente. Para generar esferoides tumorales de tamaño uniforme, primero lave el cultivo celular tumoral de interés con cinco mililitros de PBS y trate las células con 0,5 a un mililitro de enzima de disociación.
Después de cinco minutos a 37 grados celsius, detenga la reacción con cuatro a 4,5 mililitros de PBS y transfiera las células separadas en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento completo. Después de contar, resuspender las células en un uno por 10 a la sexta célula por ocho mililitros de medio de crecimiento completo complementado con dos mililitros de 2%concentración de metilcelulosa y transferir la suspensión a un contenedor de sistema estéril. Luego agregue 100 microlitros de células a cada pozo de una placa inferior redonda de 96 pozos y coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius 5% durante tres a cuatro días.
Para realizar un ensayo de invasión, cuando las células tumorales se hayan formado esferoides de tamaño uniforme, transfiera cada estructura celular a un tubo de 500 microlitros y lave los esferoides una vez con 200 microlitros de PBS. Después del segundo lavado, transfiera los esferoides cuidadosamente en 100 microlitros de matriz de colágeno recién preparada y agregue cada suspensión de esferoides en el centro de cada pozo de una placa plana inferior de 96 pozos. Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius, agregue 100 microlitros de medio de crecimiento completo en la parte superior del gel en cada pocóyo.
Asegúrese de colocar todos los esferoides en el centro de cada pozo para obtener las mejores imágenes de la invasión de células tumorales. Para realizar un ensayo de migración, cuando las células tumorales se han formado esferoides de tamaño uniforme, recubrir una placa de seis pozos con 0,2 miligramos por mililitro de Matrigel en medio de crecimiento durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, retire el Matrigel y añada dos mililitros de medio de crecimiento completo a cada pocóyo.
Transfiera los esferoides de la placa inferior redonda en volúmenes de 50 microlitros en pozos individuales de la placa de seis pozos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente, mancha los esferoides con 10 nanogramos por mililitro de Hoechst durante 30 minutos a 37 grados Centígrados. Para la adquisición de imágenes después de un ensayo de invasión o migración, coloque la placa en el escenario de un microscopio confocal Brightfield equipado con una cámara de video y obtenga imágenes durante el período experimental adecuado.
Para analizar las imágenes de forma semiautomática, importe las imágenes a Fiji y haga clic en Plugins, Macros, Interactive Interpreter. Copie y pegue el bucle púrpura adaptado. Mantenga las oraciones púrpuras y agregue las oraciones verdes de interés según sea necesario.
A continuación, para medir el área de cada esferoide, haga clic en Analizar y medir. Para medir la hipoxia en áreas distintas de la estructura esférica, se puede utilizar la tinción de anhidrasa IX carbónica para determinar la actividad hipoxica. En este análisis representativo, se observaron más células positivas de anhidrasa carbónica IX en el centro esferoide.
Las células hipoxiicas ubicadas en el núcleo esferoide tienden a ser más glucolíticas que las células que rodean el núcleo. Las mitocondrias se pueden obtener mediante microscopía electrónica para su posterior análisis. El diámetro del esferoide está directamente correlacionado con la densidad de las células que componen la estructura celular 3D y las macros de Fiji se pueden utilizar para cuantificar la proliferación, invasión o migración de las células dentro de cada esferoide o migración de las células dentro de cada esferoide.
Los aumentos en el núcleo esferoide reflejan la estimulación de la proliferación celular. Tras la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial, la gran mayoría de la producción de ATP en las mitocondrias se ve comprometida reduciendo la proliferación en un 20%después de 72 horas. El tratamiento del cloruro de hidrógeno mejora la invasión del colágeno tipo I durante un período de 24 horas, pero reduce el área migratoria de los esferoides 1,5 veces en comparación con el control de los esferoides no tratados.
Según lo evaluado por imágenes en vivo, los esferoides demuestran una alta dinámica interna y se mueven rápidamente. El tamaño de los esferoides debe ser relativamente uniforme y se debe tener cuidado de manipular los esferoides al centro de los pozos para obtener los mejores resultados de imagen. Este método también se puede utilizar para investigar la proliferación de células tumorales, migración y muerte, así como la expresión de matriz extracelular, receptores celulares o proteínas intracelulares de interés.
Los esferoides también pueden encapsularse y el efecto del aumento de la tensión de la superficie celular se puede investigar al retirar las cápsulas.
