Este trabajo fue apoyado por el Instituto Friedrich Miescher para la Investigación Biomédica, la Sociedad Max Planck y el Programa Científico Fronteras Humanos.

Fueron aprobadas y realizadas de conformidad con las directrices del Departamento del Cantón de Basilea-Ciudad Veterinario Todos los procedimientos con animales. 1. Hardware y software de instalación <ol><li> Dos fotones configuración microscopio de barrido: <ol><li> Utilice un láser infrarrojo pulsante como una fuente de iluminación (ancho de pulso &lt;120 fs). </li><li> Utilice una exploración de cabeza compuesto por un escáner de resonancia 8 o 12 kHz y un nivel galvanómetro Nota:. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 Hz a 750 x 400 píxeles. Una alta tasa de cuadros es fundamental para minimizar el movimiento del cerebro distorsión de la imagen inducida. Por otra parte, los resultados de escaneo rápido resonantes en un rendimiento de señal más alta y reduce fotoblanqueo 16 y fototoxicidad. </li><li> Utilice una velocidad alta Z-paso a paso piezoeléctrico secuencialmente tiempo adquirir imágenes intercaladas en múltiples profundidades Nota:. Esto es opcional y se utiliza para aumentar el rendimiento de datos a costa de la velocidad de fotogramas. </li><li> Utilice amsupresor ecánico para reducir la exposición al láser al tejido. Ajuste de la anchura de la supresor dependiendo de la amplitud de la escáner resonante Nota:. Debido a la naturaleza sinusoidal de la trayectoria de exploración de un escáner de resonancia, el haz de láser se mueve comparativamente lenta en los puntos de respuesta de exploración. Para prevenir el daño del tejido en estos puntos de entrega en donde la exposición al láser es más grande, un supresor de mecánica se introduce en el plano focal entre la exploración y lentes de tubo que detiene el haz de láser. </li><li> Para la adquisición de datos utilizar un digitalizador de alta velocidad (800 MHz) en combinación con un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA) Nota:. Los filtros de paso alto FPGA y cubos de la señal de PMT en píxeles. La combinación del filtro de paso alto en el FPGA y el filtro de paso bajo eficaz en el resultado amplificador de PMT en un filtro de paso de banda de aproximadamente centrada alrededor de la frecuencia de repetición del láser (80 MHz). Código FPGA ejemplo se proporciona como un suplemento. </li></ol></li><li> Configuración de la rueda de ardilla hinchable basado en el diseño de Dombeck y colegas 2 <ol><li> Conectar el soporte de la bola a una línea de suministro de aire usando un tubo de suministro de aire de al menos 10 mm de diámetro interior. Maximizar la sección transversal de la entrada de suministro de aire soporte de bola y colocar amplia cantidad de tubo entre el suministro de aire principal y el soporte de la bola Nota:. Aumento de la sección transversal y el aumento de longitud de la tubería de suministro de aire reduce la generación de ruido. </li><li> Colocar una bola de espuma de poliestireno (20 cm de diámetro) en un soporte de bola de diseño personalizado e impreso-3D. </li><li> Si el paradigma de comportamiento requiere solamente hacia delante (o hacia atrás) la locomoción, restringir el movimiento de la bola para el eje horizontal (pitch) mediante la inserción de un pasador (por ejemplo, una aguja hipodérmica 19 G) en el lado de la bola Nota:. Normalmente los animales se adaptan a la configuración mucho más rápido en este paradigma de rotación reducida. </li><li> Seguir el movimiento de la pelota, usando uno o dos ratones de ordenador ópticopara detectar el movimiento en torno a dos o de los tres ejes, respectivamente Nota:. Los ratones de ordenador idealmente deben operar con un diodo de infrarrojos para la menor interferencia con la imagen. </li></ol></li><li> Configuración del entorno de realidad virtual <ol><li> Prepare el entorno de realidad virtual Nota:. Un entorno de ejemplo basado en Panda3D, un motor de juego de libre acceso, se proporciona como un suplemento. Los objetos del entorno virtual se generan utilizando Wings3D, un modelador 3D de código abierto. El programa de ejemplo lee la información de posición en una tarjeta de adquisición de datos y esto se traduce en movimiento en el entorno virtual. El código también realiza la transformación no lineal necesario para el medio ambiente que se proyecta sobre una pantalla toroidal. La construcción detallada de la pantalla toroidal se ha descrito en otra parte 14,17. </li><li> Utilice proyectores LED o pantallas de ordenador con retroiluminación LED para mostrar el entorno virtual. Integrar una cir gatingCUIT para el parpadeo rápido de los LEDs durante la exploración Nota:. Un problema inherente en dos fotones de imágenes durante la estimulación visual es fuga de luz procedente del sistema de estimulación visual, que puede reducirse mediante el blindaje del objetivo. Sin embargo, la fuga de luz del sistema de estimulación visual puede ser completamente abolida mediante la sincronización de la salida de luz del proyector a los puntos de entrega del escáner de resonancia (cuando los datos no son adquiridos), como se hace con arenas LED utilizados para la estimulación visual durante la exploración en 18 de Drosophila. Esto resulta en una alternancia de alta velocidad efectiva de estimulación visual y adquisición de datos (véase la Figura 2). La frecuencia de parpadeo (24 kHz) es órdenes de magnitud por encima del umbral de fusión de parpadeo, por encima del cual el parpadeo ya no se percibe por el animal. El diagrama del circuito electrónico de esta modificación a un proyector LED comercial se muestra en la Figura 3. </li></ol></li><li> Cachorroil seguimiento <ol><li> Utilice una cámara de vídeo basado en CMOS (30 fps) para el seguimiento de posición de la pupila. Asegúrese de que la cámara no contiene un filtro de bloqueo de infrarrojos Nota:. La pupila es visible en alto contraste durante las grabaciones debido a la luz difusa procedente del láser de excitación de dos fotones que sale a través del ojo. Posición de la pupila y el diámetro se extrae en tiempo real mediante un software personalizado programado basado en el diseño de Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. La inyección de indicador de calcio Genética y Ventana de Implantes La inyección de un indicador de calcio 20 y la implantación de la ventana craneal 21 se realizó como se describió anteriormente con las siguientes adiciones: <ol><li> Inyectar el virus en la región de interés usando una pipeta de inyección de vidrio se rellenó con solución de virus y conectado a un sistema de inyección a presión. Ajustar la presión en función de la pipeta interna-de diámetro, típicamente aprox. 70-140 mbar, para inyectar aproximadamente 100 nl de solución de virus en el transcurso de 1-2 min. Pulsos de inyección de bajo volumen entregado a baja frecuencia (0,05 pulsos segundos a 2 Hz) deben ser utilizados con el fin de evitar el desbordamiento del virus a lo largo de la pipeta durante la inyección Nota:. Con el fin de controlar el volumen de inyección, la pipeta puede estar marcado en pequeña , longitudes iguales de tiempo (por ejemplo, 0,5 mm) bajo un microscopio estereoscópico. El desplazamiento del menisco entre las marcas puede ser utilizado para estimar el volumen inyectado. </li><li> Varias semanas después de la inyección de esto debería resultar en un bolo de células densamente marcados con un diámetro de aproximadamente 500 micras. La eficacia de expresión GECI en la región de interés depende de la elección de la combinación promotor GECI y, así como el título infeccioso y el serotipo de AAV recombinante utilizado Nota:. Como un ejemplo representativo, la inyección de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml en la corteza visual primaria de un ratón produce la expresión satisfactoria en aproximadamente dos semanas después de la inyección (Figura 1). </li><li> La barra de la cabeza no debe obstruir el campo visual del ratón, pero debe ser lo suficientemente rígido para permitir la formación de imagen estable durante comportamiento. Esto normalmente requiere dos puntos de unión en ambos lados de la barra de la cabeza (ver Figura 1). Para sujetar firmemente la barra de la cabeza en el cráneo, asegúrese de maximizar y seque el área del cráneo expuesta donde se colocará la barra de cabeza. Además, el uso de un bisturí o una jeringa, rayar el cráneo para crear ranuras superficiales, aumentando así el área de superficie para el encolado. Cubrir el hueso con tejido adhesivo cianoacrilato antes de colocar la barra de la cabeza con cemento dental. </li></ol> 3. Procedimiento experimental <ol><li> Dos o tres semanas después de la inyección de virus, compruebe la ventana implante craneal para la claridad y la expresión bajo epiiluminación de fluorescencia. Límites claramente visibles y claramente definidas de los vasos sanguíneos superficiales son una buena indicación de que el implante ventana es adecuado para la formación de imágenes (véase la Figura 1). </li><li> Medir y ajustar la potencia del láser a un valor por debajo de 50 mW a la muestra. </li><li> Encienda el flujo de aire a la rueda de ardilla esférica. </li><li> Para fijar la cabeza bajo el microscopio, anestesiar brevemente el animal con isoflurano para reducir el estrés. Colocar el animal en un recipiente de anestesia con isoflurano y esperar hasta que las paradas de animales en movimiento (aproximadamente 10 segundos). Retire el animal e inmediatamente la cabeza fijarlo en el microscopio. </li><li> Coloque el sistema de presentación visual lo más cerca posible al animal a todavía permitir el acceso al animal. El contacto visual a menos que el animal tiene con el experimentador, menos estresado el animal será durante la fase inicial del experimento. </li><li> Asegúrese de que la ventana de implante craneal está libre de polvo y suciedad. Limpie con aguasi es necesario. </li><li> Aplicar gel de ultrasonido claro como medio de inmersión entre la ventana craneal y objetivo de inmersión en agua. Esto resuelve los problemas de degradación de la imagen lento debido a la evaporación de agua o fugas y elimina la necesidad de montar un cono en la barra de la cabeza para contener el agua Nota:. Centrífuga el gel antes de su uso para eliminar todas las burbujas de aire, y tener cuidado de no crear ningún aire burbujas durante la aplicación del gel. Las burbujas de aire pueden afectar seriamente la calidad de imagen. </li><li> Envuelva un pedazo de cinta negro alrededor de la barra de objetivo y la cabeza de protección de la luz. </li><li> Mueva el entorno de arena virtual a su posición final y ajustar la cámara de vídeo para el seguimiento de los alumnos. </li><li> Ajuste el supresor de láser para que coincida con la amplitud de exploración utilizado durante el experimento. </li><li> Inicie la grabación de datos. </li></ol>

<ol>
	<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals.">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task.">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li><li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning.">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li><li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., H&#252;bener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse.">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li><li>Akerboom, J., Chen, T. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li><li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes.">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li><li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Margolis, D. J., L&#252;tcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation.">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li><li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>H&#246;lscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments.">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching).">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+Reality+for+Mice,+mousevr.blogspot.com.">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li><li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL/6+mice.">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li><li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2/3+of+mice.">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li><li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Schmidt-Hieber, C., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La clave para el éxito de comportamiento de formación de imágenes de dos fotones es la estabilidad de la preparación de dos maneras: <ol><li> En el transcurso de la implantación ventana días post, respuestas inflamatorias del tejido pueden conducir a la mejora de la formación de tejido de granulación y el cartílago que dificultar o incluso impedir formación de imágenes. </li><li> Durante el experimento, el cerebro tiene que ser lo suficientemente estable para evitar los artefactos de movimiento corrompa l...

Dos fotones de imágenes de los indicadores de calcio (genéticamente codificados como GCaMP5 7 o R-GECO 8, o colorantes sintéticos como OGB o Fluo4) ha emergido como un poderoso método para medir la actividad neuronal en ratones comportarse 1-6. Se permite la medición simultánea de la actividad de cientos de células en acción cerca de un solo potencial de resolución, de hasta aproximadamente 800 m por debajo de la superficie del cerebro 9,10. Por otra parte, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) la actividad neuronal se puede medir crónicamente 5,11,12, y en tipos de células genéticamente definidas 13. En conjunto, estos métodos proporcionan un grado de resolución temporal y espacial que abre una multitud de nuevas posibilidades en el estudio de la computación neuronal in vivo. La intervención quirúrgica es necesaria para exponer y etiquetar el cerebro de un ratón para la imagen. Las células se transfectaron usando típicamente un Vir adeno-asociado recombinante<html> nos sistema (AAV) para la entrega GECI y una ventana craneal se implanta en el sitio de la inyección para obtener acceso óptico al cerebro. Un bar de la cabeza se une entonces al cráneo para la fijación de la cabeza bajo el microscopio de dos fotones. El diseño y la implementación de estas medidas es fundamental ya que la mayoría de los problemas con las imágenes despierto surgen de la inestabilidad en la preparación. Idealmente, el procedimiento descrito aquí debe permitir para formación de imágenes crónica de hasta varios meses después de la cirugía. Para habilitar el comportamiento guiado visualmente durante dos fotones de imágenes, el ratón fijo cabeza se sienta en una cinta de correr esférica aire apoyado, que puede utilizar para navegar por un entorno de realidad virtual. Locomoción del ratón en la cinta se acopla al movimiento en el entorno virtual que se muestra en una pantalla toroidal que rodea el 14,15 ratón. Variables de comportamiento, tales como locomoción, el estímulo visual, y la posición de la pupila se pueden grabar 6. t &quot;&gt; Se describen los procedimientos involucrados en la crónica de dos fotones en ratones explorando un entorno de realidad virtual Los puntos clave abordados son:. reducción de artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz, la maximización del número de células grabadas de forma simultánea, y la minimización de el daño por luz. También dio detalles sobre la configuración de la rueda de ardilla hinchable, el seguimiento de los alumnos, y el entorno de realidad virtual. Los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de las poblaciones de células marcadas con fluorescencia en ratones fijos en la cabeza en un potencialmente amplia variedad de paradigmas de comportamiento .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">cover slips (d = 3-5 mm)</td>
			<td style="width:151px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">window implant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">InSight DeepSee laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12kHz resonance scanner</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>G1-003-30026</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Galvometer</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>G6215H</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 5772</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FPGA</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe 7965R</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCIe 6363</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emission filter 525/50</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piezo-electric z-drive</td>
			<td>Physikinstrumente</td>
			<td>P-726.1CD</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Controller for piezo-electric drive</td>
			<td>Physikinstrumente</td>
			<td>E665 LVPZT</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Objective 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI75</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Current amplifier</td>
			<td style="width:151px;">Femto</td>
			<td style="width:119px;">DHPCA-100</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Photomultiplier tube</td>
			<td style="width:151px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">USB Camera without IR filter</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>DMK22BUC03&#160;</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Objective 50 mm</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>M5018-MP&#160;</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Macro adapter rings</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>LAexSet</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical computer mouse</td>
			<td>Logitech</td>
			<td>G500</td>
			<td>motion tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Styrofoam ball 20 cm</td>
			<td>e.g. idee-shop.de</td>
			<td>08797.00.15</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LED projector</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SP-F10M&#160;</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI 6009</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Panda3D game engine</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Numpy library for Python</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scipy library for Python</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NI-DAQmx driver</td>
			<td style="width:151px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:151px;">Dahlhausen</td>
			<td style="width:119px;">5701.0342.10</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment

En los últimos años, dos fotones de imágenes se ha convertido en una herramienta muy valiosa en la neurociencia, ya que permite la medición de crónica de la actividad de las células identificadas genéticamente durante comportamiento 1-6. Aquí se describen los métodos para llevar a cabo de dos fotones en la corteza del ratón mientras el animal se desplaza un entorno de realidad virtual. Nos centramos en los aspectos de los procedimientos experimentales que son clave para obtener imágenes en un animal se comporta en un entorno virtual muy iluminada. Los principales problemas que se presentan en este montaje experimental que aquí la dirección estamos: minimizando los artefactos de movimiento relacionadas con el cerebro, reduciendo al mínimo la fuga de luz del sistema de proyección de realidad virtual, y minimizando el daño tisular inducida por láser. También proporcionamos software muestra para controlar el entorno de realidad virtual y de hacer el seguimiento de los alumnos. Con estos procedimientos y recursos debería ser posible convertir un microscopio de dos fotones convencional para su uso en comportarse ratones.

La calidad de imagen en imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones de células marcadas con un GECI depende en gran medida de la calidad de la ventana de implante craneal. Dos semanas después de la inyección del virus de la ventana del cráneo deben ser inspeccionados para mayor claridad. No debe haber ningún tejido de granulación o recrecimiento del hueso visible (Figura 1A). Por otra parte, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer sin cambios y los límites de l...

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

30.8K vistas.  Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.  Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual. 

Video: Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Development of a Virtual Reality Assessment of Everyday Living Skills

Cognitive impairments affect the majority of patients with schizophrenia and these impairments predict poor long term psychosocial outcomes.&#160; Treatment studies aimed at cognitive impairment in patients with schizophrenia not only require demonstration of improvements on cognitive tests, but also evidence that any cognitive changes lead to clinically meaningful improvements.&#160; Measures of &#8220;functional capacity&#8221; index the extent to which individuals have the potential to perform skills required for real world functioning. &#160;Current data do not support the recommendation of any single instrument for measurement of functional capacity.&#160; The Virtual Reality Functional Capacity Assessment Tool (VRFCAT) is a novel, interactive gaming based measure of functional capacity that uses a realistic simulated environment to recreate routine activities of daily living. Studies are currently underway to evaluate and establish the VRFCAT&#8217;s sensitivity, reliability, validity, and practicality.&#160;This new measure of functional capacity is practical, relevant, easy to use, and has several features that improve validity and sensitivity of measurement of function in clinical trials of patients with CNS disorders.

A challenge for proving treatment efficacy for cognitive impairments in schizophrenia is finding the optimizing measurement of skills related to everyday functioning.&#160; The Virtual Reality Functional Capacity Assessment Tool (VRFCAT) is an interactive gaming based computerized measure aimed at skills associated with everyday functioning, including baseline impairments and treatment related changes.

Desarrollo de una Evaluación de la Realidad Virtual de habilidades diarias de vida

Cognitive impairments affect the majority of patients with schizophrenia and these impairments predict poor long term psychosocial outcomes.&#160; ...

Investigación

Comportamiento

A Protocol for Housing Mice in an Enriched Environment

Environmental enrichment (EE) is a housing environment for mice that boosts mental and physical health compared to standard laboratory housing. Our recent studies demonstrate that environmental enrichment decreases adiposity, increases energy expenditure, resists diet induced obesity, and causes cancer remission and inhibition in mice. EE typically consists of larger living space, a variety of &#8216;toys&#8217; to interact with, running wheels, and can include a number of other novel environmental changes. All of this fosters a more complex social engagement, cognitive and physical stimulations. Importantly, the toy location and type of toy is changed regularly, which encourages the mice to adapt to a frequently changing and novel environment. Many variables can be manipulated in EE to promote health effects in mice. Thus these approaches are difficult to control and must be properly managed to successfully replicate the associated phenotypes. Therefore, the goal of this video is to demonstrate how EE is properly set up and maintained to assure a complex, challenging, and controlled environment so that other researchers can easily reproduce the protective effects of EE against obesity and cancer.

Environmental enrichment for mice requires a complex and challenging setup, as well as comprehensive husbandry and handling techniques to assure robust metabolic and anti-cancer effects in the mice. This protocol provides detailed procedures to reproduce the above mentioned effects in mice.

Un Protocolo para ratones Viviendas en un ambiente enriquecido

Environmental enrichment (EE) is a housing environment for mice that boosts mental and physical health compared to standard laboratory housing. Our recent ...

Multifunctional Setup for Studying Human Motor Control Using Transcranial Magnetic Stimulation, Electromyography, Motion Capture, and Virtual Reality

The study of neuromuscular control of movement in humans is accomplished with numerous technologies. Non-invasive methods for investigating neuromuscular function include transcranial magnetic stimulation, electromyography, and three-dimensional motion capture. The advent of readily available and cost-effective virtual reality solutions has expanded the capabilities of researchers in recreating &#8220;real-world&#8221; environments and movements in a laboratory setting. Naturalistic movement analysis will not only garner a greater understanding of motor control in healthy individuals, but also permit the design of experiments and rehabilitation strategies that target specific motor impairments (e.g. stroke). The combined use of these tools will lead to increasingly deeper understanding of neural mechanisms of motor control. A key requirement when combining these data acquisition systems is fine temporal correspondence between the various data streams. This protocol describes a multifunctional system&#8217;s overall connectivity, intersystem signaling, and the temporal synchronization of recorded data. Synchronization of the component systems is primarily accomplished through the use of a customizable circuit, readily made with off the shelf components and minimal electronics assembly skills.

Transcranial magnetic stimulation, electromyography, and 3D motion capture are commonly used non-invasive techniques for investigating neuromuscular function in humans. In this paper, we describe a protocol that synchronously samples data generated by all three of these tools along with the unique addition of virtual reality stimulus presentation and feedback.

Configuración de múltiples funciones para el estudio de control de motores Humano Usando estimulación magnética transcraneal, electromiografía, Captura de movimiento, y Realidad Virtual

The study of neuromuscular control of movement in humans is accomplished with numerous technologies. Non-invasive methods for investigating neuromuscular ...

Using Virtual Reality to Transfer Motor Skill Knowledge from One Hand to Another

As far as acquiring motor skills is concerned, training by voluntary physical movement is superior to all other forms of training (e.g. training by observation or passive movement of trainee&#39;s hands by a robotic device). This obviously presents a major challenge in the rehabilitation of a paretic limb since voluntary control of physical movement is limited. Here, we describe a novel training scheme we have developed that has the potential to circumvent this major challenge. We exploited the voluntary control of one hand and provided real-time movement-based manipulated sensory feedback as if the other hand is moving. Visual manipulation through virtual reality (VR) was combined with a device that yokes left-hand fingers to passively follow right-hand voluntary finger movements. In healthy subjects, we demonstrate enhanced within-session performance gains of a limb in the absence of voluntary physical training. Results in healthy subjects suggest that training with the unique VR setup might also be beneficial for patients with upper limb hemiparesis by exploiting the voluntary control of their healthy hand to improve rehabilitation of their affected hand.

We describe a novel virtual-reality based setup which exploits voluntary control of one hand to improve motor-skill performance in the other (non-trained) hand. This is achieved by providing real-time movement-based sensory feedback as if the non-trained hand is moving. This new approach may be used to enhance rehabilitation of patients with unilateral hemiparesis.

Uso de realidad Virtual para transferir Motor habilidad conocimiento de un lado a otro

As far as acquiring motor skills is concerned, training by voluntary physical movement is superior to all other forms of training (e.g. training by ...

Mobile Game-based Virtual Reality Program for Upper Extremity Stroke Rehabilitation

Stroke rehabilitation requires repetitive, intensive, goal-oriented therapy. Virtual reality (VR) has the potential to satisfy these requirements. Game-based therapy can promote patients&#39; engagement in rehabilitation therapy as a more interesting and a motivating tool. Mobile devices such as smartphones and tablet PCs can provide personalized home-based therapy with interactive communication between patients and clinicians. In this study, a mobile VR upper extremity rehabilitation program using game applications was developed. The findings from the study show that the mobile game-based VR program effectively promotes upper extremity recovery in patients with stroke. In addition, patients completed two weeks of treatment using the program without adverse effects and were generally satisfied with the program. This mobile game-based VR upper extremity rehabilitation program can substitute for some parts of the conventional therapy that are delivered one-on-one by an occupational therapist. This time-efficient, easy to implement, and clinically effective program would be a good candidate tool for tele-rehabilitation for upper extremity recovery in patients with stroke. Patients and therapists can collaborate remotely through these e-health rehabilitation programs while reducing economic and social costs.

Here, we present a protocol to develop and apply a mobile game-based virtual reality program for the recovery of upper limb dysfunction in patients with stroke. The present study shows that the mobile program is feasible and effectively promotes upper limb recovery in stroke patients.

Programa de realidad Virtual basado en el juego de móvil para la rehabilitación de movimiento de la extremidad superior

Stroke rehabilitation requires repetitive, intensive, goal-oriented therapy. Virtual reality (VR) has the potential to satisfy these requirements. ...

A Method to Study Adaptation to Left-Right Reversed Audition

An unusual sensory space is one of the effective tools to uncover the mechanism of adaptability of humans to a novel environment. Although most of the previous studies have used special spectacles with prisms to achieve unusual spaces in the visual domain, a methodology for studying the adaptation to unusual auditory spaces has yet to be fully established. This study proposes a new protocol to set-up, validate, and use a left-right reversed stereophonic system using only wearable devices, and to study the adaptation to left-right reversed audition with the help of neuroimaging. Although individual acoustic characteristics are not yet implemented, and slight spillover of unreversed sounds is relatively uncontrollable, the constructed apparatus shows high performance in a 360&#176; sound source localization coupled with hearing characteristics with little delay. Moreover, it looks like a mobile music player and enables a participant to focus on daily life without arousing curiosity or drawing attention of other individuals. Since the effects of adaptation were successfully detected at the perceptual, behavioral, and neural levels, it is concluded that this protocol provides a promising methodology for studying adaptation to left-right reversed audition, and is an effective tool for uncovering the adaptability of humans to a novel environments in the auditory domain.

The present study proposes a protocol to investigate the adaptation to left-right reversed audition achieved only by wearable devices, using neuroimaging, which can be an effective tool for uncovering the adaptability of humans to a novel environment in the auditory domain.

Un método para estudiar la adaptación a izquierda y derecha invertida Audition

An unusual sensory space is one of the effective tools to uncover the mechanism of adaptability of humans to a novel environment. Although most of the ...

Measuring the Kinematics of Daily Living Movements with Motion Capture Systems in Virtual Reality

The inability to complete instrumental activities of daily living (IADL) is a precursor to various neuropsychological diseases. Questionnaire-based assessments of IADL are easy to use but prone to subjective bias. Here, we describe a novel virtual reality (VR) test to assess two complex IADL tasks: handling financial transactions and using public transportation. While a participant performs the tasks in a VR setting, a motion capture system traces the position and orientation of the dominant hand and head in a three-dimensional Cartesian coordinate system. Kinematic raw data are collected and converted into &#39;kinematic performance measures,&#39; i.e., motion trajectory, moving distance, and time to completion. Motion trajectory is the path of a particular body part (e.g., dominant hand or head) in space. Moving distance refers to the total distance of the trajectory, and time to completion is how long it took to complete an IADL task. These kinematic measures could discriminate patients with cognitive impairment from healthy controls. The development of this kinematic measuring protocol allows detection of early IADL-related cognitive impairments.

We designed a virtual reality test to assess instrumental activities of daily living (IADL) with a motion capture system. We propose a detailed kinematic analysis to interpret the participant&#39;s various movements, including trajectory, moving distance, and time to completion to evaluate IADL capabilities.

Medición de la cinemática de los movimientos diarios de vida con sistemas de captura de movimiento en la realidad Virtual

The inability to complete instrumental activities of daily living (IADL) is a precursor to various neuropsychological diseases. Questionnaire-based ...

A Networked Desktop Virtual Reality Setup for Decision Science and Navigation Experiments with Multiple Participants

Investigating the interactions among multiple participants is a challenge for researchers from various disciplines, including the decision sciences and spatial cognition. With a local area network and dedicated software platform, experimenters can efficiently monitor the behavior of the participants that are simultaneously immersed in a desktop virtual environment and digitalize the collected data. These capabilities allow for experimental designs in spatial cognition and navigation research that would be difficult (if not impossible) to conduct in the real world. Possible experimental variations include stress during an evacuation, cooperative and competitive search tasks, and other contextual factors that may influence emergent crowd behavior. However, such a laboratory requires maintenance and strict protocols for data collection in a controlled setting. While the external validity of laboratory studies with human participants is sometimes questioned, a number of recent papers suggest that the correspondence between real and virtual environments may be sufficient for studying social behavior in terms of trajectories, hesitations, and spatial decisions. In this article, we describe a method for conducting experiments on decision-making and navigation with up to 36 participants in a networked desktop virtual reality setup (i.e., the Decision Science Laboratory or DeSciL). This experiment protocol can be adapted and applied by other researchers in order to set up a networked desktop virtual reality laboratory.

This paper describes a method for conducting multi-user experiments on decision-making and navigation using a networked computer laboratory.

Una instalación de realidad Virtual Desktop en red para la decisión de la ciencia y experimentos de navegación con múltiples participantes

Investigating the interactions among multiple participants is a challenge for researchers from various disciplines, including the decision sciences and ...

Virtual Reality Experiments with Physiological Measures

Virtual reality (VR) experiments are increasingly employed because of their internal and external validity compared to real-world observation and laboratory experiments, respectively. VR is especially useful for geographic visualizations and investigations of spatial behavior. In spatial behavior research, VR provides a platform for studying the relationship between navigation and physiological measures (e.g., skin conductance, heart rate, blood pressure). Specifically, physiological measures allow researchers to address novel questions and constrain previous theories of spatial abilities, strategies, and performance. For example, individual differences in navigation performance may be explained by the extent to which changes in arousal mediate the effects of task difficulty. However, the complexities in the design and implementation of VR experiments can distract experimenters from their primary research goals and introduce irregularities in data collection and analysis. To address these challenges, the Experiments in Virtual Environments (EVE) framework includes standardized modules such as participant training with the control interface, data collection using questionnaires, the synchronization of physiological measurements, and data storage. EVE also provides the necessary infrastructure for data management, visualization, and evaluation. The present paper describes a protocol that employs the EVE framework to conduct navigation experiments in VR with physiological sensors. The protocol lists the steps necessary for recruiting participants, attaching the physiological sensors, administering the experiment using EVE, and assessing the collected data with EVE evaluation tools. Overall, this protocol will facilitate future research by streamlining the design and implementation of VR experiments with physiological sensors.

Virtual reality (VR) experiments can be difficult to implement and require meticulous planning. This protocol describes a method for the design and implementation of VR experiments that collect physiological data from human participants. The Experiments in Virtual Environments (EVE) framework is employed to accelerate this process.

Experimentos de realidad virtual con medidas fisiológicas

Virtual reality (VR) experiments are increasingly employed because of their internal and external validity compared to real-world observation and ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...