Este trabajo fue financiado por una subvención del Proyecto Fideicomiso Wellcome concedido a la EP y GL (089236/Z/09/Z). SG fue apoyado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Agradecemos a Matthieu Vermeren para el tipo de regalo del vector shRNA y Jennifer Shieh de valiosos consejos sobre nucleofection neuroblastos.

Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales. 1. Disección y disociación de rata RMS neuroblastos <ol><li> Preparar las soluciones necesarias para la disección RMS y disociación: </li></ol> Medio de disección (100 ml) Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) - 98,5 ml 5 M de HEPES, pH 7,4 a 0,5 ml La penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / ml y 10.000 g / ml) - 1 ml Medio de disociación (2 ml) HBSS - 1.760 ml 10x Tripsina (2,5%) - 200 l Dnase1 (1 mg / ml) - 40 l Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) + 10% de suero de ternera fetal (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml El medio completo (12 ml) Medianas Neurobasal - 11,46 ml B27 Suplemento - 250 l L-Glutamina (200 mm) - 125 l Glucosa (45%) - 165 l 2. Filter-esterilizar el% de FCS DMEM + 10 y el medio completo y preequilibrate en un 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora. <ol><li> Disección <ol><li> Sacrificar una camada de ratas P6-P7 (unos 12 cachorros) por dislocación cervical y decapitar con unas tijeras. </li><li> Hacer una incisión anteroposterior en la piel a lo largo de la sutura sagital medial desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí. Pelar la piel y repita la misma incisión a lo largo del cráneo. </li><li> Retire suavemente las aletas craneales con fórceps y retirar con cuidado el cerebro con una espátula, teniendo cuidado de incluir los bulbos olfatorios. </li><li> Cortar el tercero más caudal del cerebro y lo descarta. </li><li> Picar ªe tejido cerebral en 1,4 mm de espesor rebanadas coronales utilizando un cortador de tejidos. </li><li> Coloque las rebanadas en platos que contenían medio disección fría y separe con cuidado usando una aguja. </li><li> El RMS aparece como un triangular, zona translúcida en el centro de las secciones de obstetricia y como una pequeña área circular en rodajas de cerebro más caudales. Cortar las RMS de cada rebanada con un cuchillo microquirúrgico, teniendo cuidado de evitar la inclusión de tejido circundante. En crías de ratas P7, por lo general los ~ 8 rebanadas más rostral (incluyendo OB) contienen el RMS. </li><li> Recoger los fragmentos de RMS con una pipeta Pasteur de plástico y colocarlos en un plato pequeño que contiene medio de disección en frío en hielo. </li><li> Cuando la disección es completa, la transferencia de los fragmentos de RMS en un tubo de 15 ml con una pipeta de plástico. Deja fragmentos para ubicarse en la parte inferior del tubo. </li></ol></li><li> Disociación <ol><li> Sustituya el medio de disección con 2 ml de medio de disociación. </li><li> Se tritura los fragmentos de RMS por suavemente pipetting la suspensión de fragmentos de arriba abajo sobre 10 veces con una pipeta P1000. </li><li> Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un 37 ° C baño de agua durante 2 min. </li><li> Pipetear la solución de nuevo 10 veces y asegurarse de que los fragmentos han disociado (la suspensión debe enturbiarse). </li><li> Inactivar la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. </li><li> En la alícuota Mientras tanto, la cantidad requerida de ARNsi / ADN en tubos de Eppendorf (generalmente 3-5 g de ADN / shRNA o 5-9 ARNsi g oligo por nucleofection, sin embargo, la cantidad de ADN / ARNsi puede requerir optimización). </li><li> Retire el exceso de medios y resuspender el botón celular por pipeteo suave en 5 ml de DMEM precalentado + 10% FCS. </li><li> Realizar un recuento de células. Esperar ~ 1 × 10 6 células por rata cachorro cerebro. Se requiere un mínimo de 2,5 x 10 6 células por cada nucleofection, mientrasresultados óptimos se logran utilizando 3-4 x 10 6 células por nucleofection. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. Asegúrese de eliminar la mayor cantidad media de lo posible. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol><li> Inmediatamente resuspender el sedimento de células en ratas (o el ratón si el uso de células de ratón) solución nucleofection neurona previamente se incubó a temperatura ambiente. Utilice 100 l por nucleofection Nota:. Típicamente una camada de ratas de 12 crías es suficiente para llevar a cabo 4 nucleofections y una camada de ratón (12 cachorros) es suficiente para llevar a cabo 2 nucleofections. </li><li> Transferir 100 l de la suspensión celular a cada tubo Eppendorf que contenía ARNsi / ADN y mezclar suavemente 2-3x por pipeteado con una pipeta P200. </li><li> Añadir la muestra (suspensión cell-DNA/siRNA) a la parte inferior de la nucleofectioncuvette, teniendo cuidado de evitar burbujas. </li><li> Nucleofect mediante el programa G-013 (para las células de rata) o O-005 (paracélulas de ratón). Uno nucleofection tarda aproximadamente 5 seg. </li><li> Añadir rápidamente 1 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS a la muestra nucleofected. </li><li> Repita los pasos 2,4 y 2,5 para el resto de las muestras. Nota: para obtener resultados óptimos, todo el procedimiento nucleofection no debe durar más de 5 minutos. </li><li> Transfiera cada muestra a un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionado por el kit nucleofection. Evitar la transferencia de cualquier residuo celular para el tubo. </li><li> Centrifugar las muestras a 433 xg durante 5 min. </li><li> Quite cuidadosamente todo exceso de medio y resuspender el precipitado en 25 a 30 l de precalentado DMEM + FCS al 10% utilizando una pipeta P20. No utilice más de 30 l de medio. </li><li> Pipetear la suspensión como una gota en el lado interior de una tapa de la placa de p35. </li><li> Invertir la tapa sobre el plato de p35 que contiene 2 ml de medio completo (véase también la Figura 1). </li><li> Deja en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante almenos de 5 horas y un máximo de 7 horas. Un mayor tiempo de incubación permite una mejor reagregación de grupos de células. </li><li> Transfiera las gotas que cuelgan de la tapa en el medio completo en el plato con una pipeta P1000 con una punta de corte. </li><li> Se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante 24 h para nucleofections de ADN y 48 h para nucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. Incorporación <ol><li> Preparar medio completo (25 ml) y preequilibrate que a 37 ° C / 5% de CO 2 durante unas pocas horas. </li><li> Saque las alícuotas congeladas de la matriz de la membrana basal de -80 ° C congelador y descongelar en hielo en la cámara frigorífica. </li><li> Para cada nucleofection preparar un plato de 6 cm que contiene hasta ocho 13 mm coverlips estériles. </li><li> Colocar las cápsulas en una caja de hielo cubierta con papel film. Es importante mantener los cubreobjetos fresco para evitar la solidificación de la matriz durante el procedimiento de incrustación. </li><li> Para mantener la humedad, coloque una tira de tejido húmedo dentro de un plato de 15 cm que wenfermo puede utilizar para almacenar hasta tres placas de 6 cm que contienen los neuroblastos embebidos. </li><li> Añadir medio completo a la matriz descongelada en una relación de 01:03. Por ejemplo, mezclar 40 l de medio completo con 120 l de la matriz con la pipeta. Esta cantidad de matriz es suficiente para incrustar agregados en ocho cubreobjetos de 12 mm. </li><li> La transferencia de los grupos de células reaggregated a un tubo de 15 ml y centrifugar a 433 xg durante 5 min. </li><li> Retire el exceso de medios y resuspender el precipitado en 10 l de medio completo. </li><li> Coloque 2 l de suspensión de agregados de células en cada cubreobjetos estéril y añadir 18 l de matriz / mezcla de medio completo. Use la punta de la pipeta para ampliar la matriz a través de todo el cubreobjetos. </li><li> Colocar inmediatamente el recipiente de 6 cm que contiene los cubreobjetos en el plato de 15 cm y dejar en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 15-20 min. Cuando la matriz se ha solidificado, añadir con cuidado 5 ml de medio completo a cada 6 cm plato toma el cuidado de empujarpor cualquier cubreobjetos flotante con una punta de pipeta. </li><li> Incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% CO 2 para permitir que los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares. </li></ol> 4. Ensayo de Migración 3D <ol><li> Preparar las soluciones necesarias para la inmunotinción. <ol><li> Prepare la solución de bloqueo: Solución de bloqueo de cabra (50 ml) Tampón fosfato salino (PBS) - 5 ml Suero de cabra - 7,5 ml 10% de Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H 2 O - 36 ml </li><li> Se filtra y se almacena a 4 º C. </li><li> Preparar la solución de fijación: La fijación de solución (100 ml) El paraformaldehído (PFA) - PRECAUCIÓN 4 g: siempre manejar PFA bajo una campana La sacarosa - 20 g (opcional) PBS hasta 100 ml </li><li> En un plato caliente y con agitación constante disolver la PFA en 80 ml de PBS mantuvo a 65 ° C. </li><li> Una vez que la PFA se haya disuelto, añadir 20 g de sacarosa. </li><li> Ajustar el pH a7.4 (por lo general mediante la adición de ~ 60 l 1 M NaOH por 100 ml de solución). </li><li> Llevar a un volumen total de 100 ml con PBS. </li></ol></li><li> La inmunotinción <ol><li> Coloque cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. </li><li> Enjuague cubreobjetos con PBS 2x. </li><li> Fijar los agregados neuroblast RMS con solución fijadora durante 45 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado - en una plataforma oscilante). </li><li> Bloquee durante 30-60 min con solución de bloqueo de cabra. </li><li> Diluir anticuerpos primarios en solución de bloqueo de cabra e incubar durante la noche a 4 ° C. (Si se desea, faloidina fluorescente (1:400) y el colorante Hoechst (1:10.000) pueden también ser añadidos a la solución de anticuerpo primario para visualizar la actina filamentosa y núcleos). </li><li> Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado). </li><li> Diluir los anticuerpos secundarios de cabra en solución de bloqueo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague coverslips con PBS 3 veces (5 min / lavado) </li><li> Monte cubreobjetos con medio de montaje fluorescente y dejar secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Análisis de migración <ol><li> Captura de imágenes de agregados neuroblast RMS fijos con un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 10X. Incluye una barra de escala de la imagen de una muestra en. </li><li> Para configurar la escala para la cuantificación, mida la barra de escala en la imagen mediante la selección de la herramienta &#39;Recta&#39; en la barra de herramientas ImageJ. </li><li> Elija la opción &quot;Analizar&quot; y haga clic en &#39;establecer la escala&#39;. </li><li> En la ventana de escala establecida la &quot;distancia conocida&quot; y marque la casilla &quot;global&quot; para mantener la misma configuración para todas las mediciones. </li><li> Utilice la herramienta de línea segmentada &quot;en la barra de herramientas ImageJ para medir la distancia desde el borde de la suma a la más lejana neuroblast migrado en 6 sectores diferentes alrededor de todo el conjunto (Figura 3B). Considere sólo aislados agagregados para su análisis. </li><li> Calcular una distancia media de migración desde los 6 valores obtenidos para cada agregado. </li><li> Mida 10-20 agregados para cada condición en cada experimento y piscina resultados independientes de un mínimo de tres experimentos independientes. Incluya siempre un control nucleofection (GFP o un sh / control siRNA por ejemplo.). </li></ol></li></ol>

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A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La migración de los neuroblastos a lo largo de los RMS a la ubicación final en el OB es un paso fundamental en la neurogénesis postnatal. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan este proceso complejo están lejos de ser plenamente comprendido. El procedimiento experimental descrito aquí permite el estudio de la migración de los neuroblastos in vitro. Hemos adaptado un protocolo previamente publicado para el aislamiento de los neuroblastos RMS de ratón o de rata postnatal temprano 25. Para lograr resultados óptimos es importante para dominar el paso de la disección, ya que es crucial para mantener el intervalo de tiempo entre la disección y nucleofection a un mínimo. Después de nucleofection, neuroblastos pueden reaggregated, incrustados en una matriz de tres dimensiones y se dejaron migrar durante un período de 24 horas. Alternativamente, para fines distintos de la migración (por ejemplo, inmunofluorescencia o análisis de transferencia Western), las células se pueden sembrar inmediatamente después de nucleofection en polyornithine/laminin-cubreobjetos recubiertos, donde sobreviven hasta 4-5 días. Ratón y rata neuroblastos migran en Matrigel en un grado similar, sin embargo las células de ratón parecen tener una tendencia más fuerte a migrar en las cadenas de que las células de rata. Dependiendo del objetivo del estudio, los neuroblastos pueden nucleofected con diferentes plásmidos que codifican proteínas fluorescentes o proteínas de tipo / mutante silvestres de interés. Para los plásmidos de expresión de proteínas óptimos con un promotor CAG (promotor de β-actina con potenciador de CMV y β-globina cola poli-A) 26 son altamente recomendados. Por otra parte, oligos siRNA o plásmidos shRNA pueden nucleofected para derribar blancos de interés. Agotamiento de proteína eficaz puede ser visualizado por inmunofluorescencia o por Western blot (generalmente lisar agregados incrustados de 1 de rata crías con 50 l de tampón de lisis estándar). Nucleofection es un método relativamente sencillo para transfectar neuroblastos primarios, ofrece una alternativa más fácil y más rápido a vitransfección mediada por vector RAL, y puede lograr alta (~ 70-80%) la eficacia de transfección. Es fundamental trabajar con rapidez durante el procedimiento nucleofection, desde que salió de neuroblastos en la solución nucleofection por un tiempo prolongado reduce drásticamente la viabilidad celular. El rendimiento promedio de la celda de la disección RMS es relativamente baja para los ratones P7 (~ 5 x 10 5 células / cerebro) en comparación con las ratas P7 (~ 1 x 10 6 células / cerebro) y se requieren al menos 3 x 10 6 células por nucleofection para lograr la transfección con ~ 50% de eficiencia. Por otra parte, los neuroblastos de ratas parecen resistir mejor a nucleofection comparación con los neuroblastos de ratón. Por lo tanto, las crías postnatal temprano (P6-P7) de ratas podrían representar una fuente neuroblast conveniente, considerando también que la organización de rata y ratón RMS son notablemente simiLAR 27 y que el alcance de la rata y el ratón neuroblastos la migración in vitro también es comparable. Se recomienda no guardar los racimos reaggregated de neuroblastos nucleofected en suspensión durante más de 48 horas para evitar los efectos anormales en la morfología celular y la migración (nuestras observaciones no publicadas). El ensayo 3D se describe aquí se puede utilizar para cuantificar la migración de neuroblastos en un punto de tiempo fijo después de la incrustación en la matriz (por ejemplo. 24 h). Los agregados de diferentes tamaños se pueden utilizar en el análisis, ya que no existe una correlación significativa entre el tamaño de los agregados y la distancia de migración (nuestras observaciones no publicadas). Para visualizar e investigar más a fondo la dinámica de la migración de los neuroblastos, time-lapse se puede utilizar. Se recomienda realizar el análisis de la migración dentro de un intervalo de 24 horas después de la incrustación, ya que la velocidad de neuroblastos parece disminuir drásticamente en los puntos de tiempo más largos (nuestras observaciones no publicadas). &lt;/ P&gt; Existen algunas limitaciones a este protocolo. En primer lugar, nucleofection hasta ahora se puede utilizar para principios de neuroblastos de roedores postnatales, mientras que la infección con vectores virales sigue siendo el método de transfección más eficaz para los neuroblastos adultos 28. En segundo lugar, el ensayo in vitro de la migración en no reproduce completamente la compleja arquitectura de los RMS observados in vivo. De hecho, aunque los neuroblastos mantienen la capacidad de migrar de una manera similar a sus contrapartes en vivo, en la configuración experimental descrito aquí que carecen de interacciones con otros componentes de RMS tales como astrocitos y los vasos sanguíneos, que también contribuyen a regular su motilidad 9,29, 30. Este problema puede ser abordado en el futuro mediante la optimización de los sistemas modelo de co-cultivo en tres dimensiones. En conclusión, la combinación de nucleofection con un ensayo de migración 3D representa una herramienta valiosa para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacenla migración de los neuroblastos. Este procedimiento proporciona un método experimental inicial, rápido y relativamente sencillo para evaluar el papel de los reguladores de candidatos de la migración de los neuroblastos, que se pueden validar aún más por otros enfoques, como la electroporación in vivo postnatal y time-lapse de cultivos de cortes cerebrales 28,31,32 .

En el cerebro de mamífero posnatal, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce durante toda la vida y se limita a dos nichos neurogénicos: la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular de la circunvolución dentada del hipocampo 1. Varios estudios recientes han demostrado el importante papel de la neurogénesis adulta en la facilitación de las tareas de aprendizaje y memoria 2,3. Además, la evidencia de la proliferación y el reclutamiento de células progenitoras neurales después de una lesión cerebral 4-7 plantea la posibilidad de la activación farmacológica de la neurogénesis en la reparación neural. Neurogénesis postnatal es regulado estrictamente en todas sus fases, que incluyen la proliferación neuronal progenitor, migración, diferenciación, supervivencia, y la integración sináptica definitiva de neuronas recién nacidas 8. Progenitores neurales (neuroblastos) derivadas de células madre en la ZVS migran a grandes distancias a través de la migratoria rostralcorriente (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB), donde maduran hasta convertirse en neuronas funcionales 9. Neuroblastos migratorios son predominantemente unipolar, con un cuerpo celular alargado que se extiende un único proceso de liderazgo. Estas células se mueven en las cadenas de una manera colectiva, deslizando una sobre la otra 10. La migración es un paso crucial para la posterior maduración de los progenitores derivados de SVZ en neuronas funcionales 11 y es controlado por múltiples factores y moléculas de orientación incluyendo: molécula de adhesión celular neural polisialiladas (PSA-NCAM) 12, Efrinas 13, integrinas 14, aberturas 15, factores de crecimiento y neurotransmisores 16 17, sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso no se entiende completamente. La investigación de las vías de señalización intracelular que regulan la migración de neuroblastos no sólo proporcionará una mejor comprensión de la neurogénesis adulta, sino que también contribuirá al desarrollo de la nueva terapéuticaenfoques para promover la reparación del cerebro. Este manuscrito describe un protocolo detallado para estudiar el papel de los reguladores de candidatos de la migración de los neuroblastos in vitro utilizando nucleofection y un ensayo de migración 3D. Nucleofection es una técnica de transfección de células basado en un método mejorado de electroporación. Corriente eléctrica específica de tipo celular y solución nucleofection permiten la transferencia de macromoléculas polianiónicos tales como ADN y shRNA vectores y siRNA oligonucleótidos directamente en el núcleo de la célula y permiso de transfección de dividir lentamente o mitóticamente inactivas las células como neuronas embrionarias de mamíferos y 18. Este método es rápido, relativamente fácil de realizar y los resultados en la transfección altamente reproducible de una amplia gama de tipos de células incluyendo los neuroblastos primarios y las neuronas 19-21. La disociación de tejido RMS permite el aislamiento de los neuroblastos migratorios, que puede ser nucleofected con éxito con ADN / SHRVectores NA o oligos siRNA dirigidos genes de interés. Tras nucleofection, neuroblastos se reaggregated en gotas colgantes y posteriormente embebidos en una matriz de Matrigel en tres dimensiones. Estas condiciones permiten a los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares que recapitulan el modo de migración observado in vivo, proporcionando así un excelente sistema modelo para investigar las vías de señalización implicadas en la migración de los neuroblastos y para evaluar la influencia de los tratamientos farmacológicos en la motilidad de estas células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

La zona subventricular (SVZ) situado en la pared lateral de los ventrículos laterales juega un papel fundamental en la neurogénesis adulta. En este área restringida del cerebro, células madre neurales proliferan y generan constantemente neuroblastos que migran tangencialmente en cadenas a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) para alcanzar el bulbo olfatorio (OB). Una vez en el OB, los neuroblastos cambiar a la migración radial y a continuación, se diferencian en neuronas maduras capaces de incorporar en la red neuronal preexistente. La migración de los neuroblastos adecuada es un paso fundamental en la neurogénesis, lo que garantiza la correcta maduración funcional de las neuronas recién nacidas. Dada la capacidad de los neuroblastos derivados de ZVS para apuntar a áreas lesionadas en el cerebro, la investigación de los mecanismos intracelulares que subyacen a su movilidad no sólo mejorará la comprensión de la neurogénesis, pero también puede promover el desarrollo de estrategias de neurorregenerativas. Este manuscrito describe un detalladoprotocolo para la transfección de roedor primario RMS neuroblastos postnatales y el análisis de su motilidad utilizando un ensayo in vitro de 3D ​​en la migración recapitulando su modo de migración observada in vivo. Ambos neuroblastos rata y ratón pueden ser rápida y eficiente a través de nucleofection transfectadas con el plásmido de ADN, pequeña horquilla (sh) ARN corto de interferencia o (si) oligos de ARN objetivo genes de interés. Para el análisis de la migración, las células se nucleofected reaggregated en &#39;gotas colgantes, y posteriormente embebidos en una matriz tridimensional. Nucleofection per se no menoscabe significativamente la migración de los neuroblastos. El tratamiento farmacológico de los neuroblastos nucleofected y reaggregated también se puede realizar para estudiar la función de las vías de señalización implicadas en la migración de los neuroblastos.

Los neuroblastos se pueden aislar con éxito a partir de tejido disecado RMS (Figura 1A) y embebidos en una matriz tridimensional. Las células aisladas a partir de cualquiera de rata o de ratón postnatal de RMS son inmunopositivas para marcadores neuroblast migratorias, tales como doblecortina (DCX), tubulina βIII o PSA-NCAM (Figuras 1B-C). Neuroblastos disociadas se pueden nucleofected de manera eficiente con el ADN (por ejemplo. Un plásmido de GFP-codificación, Figura 2) o plásmidos shRNA (Figura 4) para lograr el agotamiento de la proteína, que puede ser evaluado mediante análisis de transferencia Western (Figura 4B) o inmunofluorescencia (no se muestra) . Las células nucleofected con plásmidos que codifican GFP migran radialmente hacia fuera racimos neuroblast reaggregated (Figura 3A). La cuantificación de la relativa distancia migrada 24 h después de la incorporación (Figura 3B) no muestra diferencias en la migración entre GFP-posit<html> ive células y células nonnucleofected GFP-negativos (Figura 3C), lo que indica que nucleofection per se no interrumpe la migración. También hay ninguna diferencia significativa en la medida de la migración entre los neuroblastos nucleofected y neuroblastos migran directamente de explantes RMS (datos no presentados). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. La disección de los neuroblastos RMS. (A) Representación esquemática de la disección de los neuroblastos RMS. Para una descripción detallada, por favor referirse al texto. (B) Las células de rata RMS aislados son immunopositive para los fabricantes de neuroblastos migratorios DCX y tubulina βlll. Bar, 20 m. (C) Las células que migran fuera del RMS explantes ratón expresan la neuroblast migratoria marcadores DCX y PSA-NCAM. Bar, 20 micras.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Ratón nucleofection neuroblastos. Disociada ratón RMS neuroblastos se nucleofected con pMAX-GFP, reaggregated, incrustados en una matriz tridimensional y permite migrar durante 6 horas. Los neuroblastos migran fuera de un grupo de células reaggregated (superior, contraste de fase fotos) muestran una alta eficiencia de transfección (abajo, canal GFP fotos). Los paneles de las columnas de la derecha muestran altos cuadros de ampliación correspondientes a los recuadros resaltados en los paneles de la columna izquierda. Bares, 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:c<html> ontenido-width = src &quot;6 pulgadas&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 3. Migración de ensayo 3D. (A) neuroblastos de rata se nucleofected con pMAX-GFP (GFP) o pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, incrustado en la matriz y de izquierda a migrar durante 24 h. Las células fueron fijadas y se inmunotiñeron para GFP (verde) y βIII tubulina (rojo). Bar, 50 m. (B) Medición de distancia de migración utilizando ImageJ. El grupo de células reaggregated está dividida en 6 sectores iguales. La distancia entre el borde de la agrupación (línea de puntos) y la célula migrado más lejos se mide para cada sector. (C) Cuantificación de la distancia relativa migró por las células nucleofected, células nonnucleofected (GFP-positivas) y de control (-GFP negativo) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 4&quot; fo: content-width = &quot;6 pulgadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figura 4. Monitoreo de la migración de los neuroblastos después shRNA nucleofection. (A) neuroblastos de rata se nucleofected con un shRNA vector de control (PCA-b-EGFPm5 silenciador 3, que también expresa EGFP 23) o el mismo vector que contiene una, una proteína actina-agrupación shRNA orientación Fascin 24. Las células fueron reaggregated más de 48 horas, embebidas en la matriz y se dejaron migrar durante 24 horas. Los agregados se fijaron y se inmunotiñeron para GFP (verde) y βIII tubulina (rojo). Bar, 50 m. (B) fascin Efectiva agotamiento se puede detectar 50 horas después de shRNA nucleofection por Western blot. La actina se muestra aquí como control de carga (C) Análisis cuantitativo de distancia de migración relativa mostrando que el agotamiento fascin entorpece seriamente la migración de los neuroblastos. (Media ± SEM; ** p &lt;0.01, n = 3 experimentos independientes). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K vistas.  King's College London.  La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Investigación

Neurociencias

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Ratón Rombencéfalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de la Migración facial Branchiomotor Neurona

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...