MS y YZ son apoyados por KCL y KCL-China becas de doctorado. MO fue financiado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Damos las gracias a Masaru Okabe y Jun-ichi Miyazaki para el plásmido PCX-EGFP y Alain Chedotal y Atenea Ypsilanti para consejos valiosos sobre la electroporación.

Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales. 1. Postnatal electroporación 1.1. Preparación de vidrio capilares, solución de ADN y Electroporador <ol><li> Preparar capilares de vidrio tirados (OD: 1.5 mm, ID: 0,86 mm) para la inyección de ADN. (Ajustes indicativos de un capilar extractor Sutter P-97 son: Heat 283; Tire 50; Velocity 90, Hora 50). Haga una marca en el capilar que corresponde a un volumen de aproximadamente 2 l. </li><li> Ajuste la tensión del electroporador a 5 pulsos cuadrados, 50 mseg / pulso a 100 V, con 850 intervalos ms (100 V, impulso ON 50 ms, pulso OFF 850 ​​ms, pulso 5). </li><li> Diluir de alta pureza (OD 260/280&gt; 1,80) plásmido de ADN libre de endotoxina a una concentración final de 1-2 mg / lcon endotoxina liberar tampón Tris-EDTA o PBS. Se recomienda añadir 0,1% Verde rápido a la solución de ADN (el colorante debe extenderse en el ventrículo cuando se inyecta con éxito). </li><li> Prepare los electrodos de 5-7 mm, el gel de electrodos y calentar la almohadilla térmica. </li></ol> 1.2. La electroporación <ol><li> Quitar un postnatal día 2 crías de ratones de la jaula y anestesiar por inhalación de isoflurano (con un flujo de ~ 0,6 L / min). </li><li> Después de aproximadamente 1 min, determinar el estado de anestesia usando la respuesta de presión del pie. Si no se produce ningún movimiento, proceder a la inyección intraventricular. </li><li> Carga de la aguja capilar con 1-2 l de ADN usando un tubo aspirador conectado al capilar. </li><li> En virtud de una fuente de luz fría, mantenga la cabeza de la cría entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante. Tire ligeramente de la piel de la espalda en la cabeza para ayudar a identificar el punto de inyección derecha. </li><li> Considere la posibilidad de una línea virtual entre el ojo y tél craneométricos lambda hito (Figura 1A). Insertar la aguja capilar en alrededor de un tercio de la longitud de esta línea de la lambda (alrededor de 1 mm desde el punto medio de línea) 15. Introduzca el capilar de unos 2 mm de profundidad, asegurándose de evitar la penetración profunda en el cerebro. </li><li> Inyectar plásmido soplando lentamente a través de la boca (una jeringa conectada al capilar también se puede utilizar). Durante este procedimiento, asegúrese de que sus dedos no están aplicando demasiada presión en el cerebro, ya que esto puede evitar la inyección de plásmido éxito. </li><li> Deje de inyección cuando se deja una cantidad mínima de solución de ADN en el capilar. Es aconsejable inyectar menos de 1 l para evitar un aumento perjudicial de la presión intracraneal. </li><li> Cubra ambos electrodos con gel y los colocan con el lado positivo en el lado lateral del hemisferio donde se inyectó el ADN (Figura 1A). Para la incorporación de ADN en el rostral SVZ, colocar electrodos ligeramente rostral a lapunto de inyección. Variando la posición del electrodo puede lograr especificidad regional de la electroporación en diferentes áreas de la SVZ 22,25. </li><li> Inicie la transferencia actual presionando el pedal del interruptor de pie del pulso. Cuando la electroporación es completa, verifique el voltaje en la pantalla electroporador (valores de tensión no deben estar por debajo de 90 V, ya que los valores de tensión más baja se correlaciona con la baja eficiencia de la electroporación). </li><li> Reanimar el cachorro bajo de oxígeno en la almohadilla caliente durante unos minutos y devolverlo a la jaula, colocándola lejos de la madre. Asegúrese de que la madre recupera el cachorro y se reúne con el resto de la camada. Después de la electroporación, deje cachorros con su madre durante 4-7 días antes de la siguiente etapa. </li></ol> 2. Preparación de las Culturas aguda de cortes de cerebro 2.1. Preparación de las soluciones y herramientas <ol><li> Las siguientes soluciones se requieren (también es posible utilizar DMEM de alta glucosa para la disección y de formación de imágenes17): Disección Medio (500 ml) Balanced medios de Gey - 500ml 45% de glucosa - 5ml Película Medio (10 ml) 45% de glucosa - 0.110 ml HEPES 1 M - 0.100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamina - 0.200 ml Dulbecco Modificado Medio Eagle (libre de rojo fenol) - 8,89 ml </li><li> Mediano película Calentar a 37 ° C. </li><li> Coloque Millicell inserta en un plato de cultivo de fondo 35 mm de vidrio que contiene 1 ml de medio de películas y colóquelo en un incubador humidificado a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Preparar vibratome accesorios (destornillador, cámara, hojas de afeitar, pegamento). </li><li> Preparar herramientas de disección: tijeras, pequeña espátula, pinzas rectas. </li><li> Preparar las herramientas para el manejo de rebanadas: pincel pequeño o un asa de inoculación suave (tamaño: 10 l), pipetas Pasteur de plástico, una caja de hielo y varios platos de plástico de 6 cm. </li><li> PreCool el medio de diseccióna 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Preparación del cerebro Slices <ol><li> Llene un recipiente de 6 cm con medio disección previamente enfriada y colocarlo en hielo (para mantener rodajas recién cortadas). </li><li> Después de la dislocación cervical, use tijeras para decapitar al cachorro ratón. Retire el cuero cabelludo con un bisturí, cortar el cráneo largo de la sutura sagital medial del OB en el cerebelo y retire suavemente las aletas craneales utilizando fórceps. Asegúrese de que todo el cerebro está expuesto y cuidadosamente diseccionar a cabo utilizando una espátula, teniendo especial cuidado de no dañar el tejido. La disección se tiene que hacer con cuidado, pero al mismo tiempo muy rápidamente (menos de un minuto si es posible). La dislocación cervical es nuestro método preferido porque la anestesia terminal con anestésicos drogas / gas pueden influir sobre las propiedades migratorias de los neuroblastos y la prosperidad de los cultivos de cortes de cerebro, que necesitan para ser fotografiado con relativa rapidez después del sacrificio de los animales. </li><li> Hemisect el cerebro con una razo cuchilla (Figura 2). Deseche hemisferio no inyectada o el uso para otros experimentos. </li><li> Coloque un pequeño trozo de cinta adhesiva en el titular vibratome y utilizar la cantidad mínima necesaria de pegamento para unir el hemisferio cerebral en la parte superior del mismo (Figura 2). Esto evita dañar la superficie de soporte debido a las aplicaciones repetidas de pegamento. </li><li> Deje que el pegamento se seque durante unos segundos. </li><li> Coloque en la bandeja del sostenedor vibratome lleno de solución disección previamente enfriada. Apuntar el bulbo olfatorio hacia la cuchilla (Figura 2). </li><li> Empiece a cortar el hemisferio cerebral usando los ajustes apropiados. Se recomiendan los siguientes parámetros: grosor de corte de 300 m; velocidad de ~ 3-5; frecuencia ~ 9. De alta frecuencia y baja velocidad se recomiendan para evitar daños en la división. </li><li> Recoger rebanadas utilizando un pincel pequeño o un asa de inoculación suave. Sólo mantener las rebanadas con OB visible (generalmente 2-3 rebanadas / cerebro). Típicamente, la porción que contiene la mayor parte de los RMS can se encuentra en ~ 300 micras desde la superficie inferior. </li><li> Compruebe las rebanadas con un microscopio fluorescente estándar para la señal de las buenas prácticas agrarias (asegurándose de darle la vuelta para comprobar la fluorescencia en ambos lados), y elegir los que muestran fluorescencia brillante a lo largo de la mayor parte de los RMS. </li></ol> 2.3. El cultivo de cerebro Slices <ol><li> En una campana de cultivo de células, cortar el tercio más caudal de la rebanada de cerebro y eliminar los restos de pegamento utilizando pinzas rectas finas o un bisturí microdisección. </li><li> Delicadamente aspirar el sector mediante una pipeta Pasteur de plástico (corte la punta de la pipeta para crear una abertura más grande, esto evitará dañar la rebanada) y colocarlo en el centro de un Millicell precalentado inserción. </li><li> Asegúrese de que el lado con la señal fluorescente brillante se coloca en contacto con el Millicell insertar (para formación de imágenes con un microscopio invertido). </li><li> Eliminar el exceso de solución de disección en la parte superior de la pieza de inserción con una pipeta. </li><li> Deja cultivos de corte aestablecerse en un C / 5% de CO 2 incubadora a 37 ° por lo menos durante 1 hora antes de exponer. </li></ol> 3. Time-lapse de imágenes de Neuroblast Migración <ol><li> Por lo menos 2 horas antes de la imagen, encienda el sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal spinning, invertida microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) enfriado cámara CCD digital, y el sistema de calefacción (Solent Scientific) fijado en la constante temperatura de 37 ° C. </li><li> Abra el módulo de adquisición de software Volocity y haga clic en el botón &quot;Viz&quot; y seleccione el láser (s) para la obtención de imágenes. </li><li> Dentro de 2 horas de preparación de cortes de cerebro, coloque el plato de fondo de vidrio que contiene el corte de cerebro en la cámara de imágenes en la platina del microscopio. </li><li> Utilice un objetivo Nikon CFI Súper Plan de Fluor ELWD 20X/0.45 bajo la luz fluorescente adecuado seleccionar y centrar el área de la rebanada que será fotografiada (por ejemplo, la primera parte descendente del RMS justo después de la zona de la inyección o la elbow región del RMS, o justo después del codo antes de neuroblastos entran en el OB). </li><li> Configure el time-lapse con las siguientes acciones: <ol><li> En el microscopio, haga clic en el botón L100 para permitir el escaneado láser de la muestra. </li><li> En Volocity, abra el láser cambiador ULTRAVIEW seleccionando el láser adecuado (por ejemplo, 488 nm láser para GFP). </li><li> Ajuste el tiempo de exposición (por lo general entre 100-500 mseg) y la intensidad del láser (generalmente 20-30%) en función de la intensidad de la señal fluorescente. </li><li> Ajuste la ganancia digital de imagen para mejorar la visualización de la célula. </li><li> Seleccione el intervalo z-stack de imagen dentro de la sección de cerebro (por lo general más de un intervalo de 100 a 120 m). Elija un intervalo con un número adecuado de células aisladas para evitar posibles solapamientos tanto como sea posible (esto facilitará el análisis de seguimiento posterior). </li><li> Seleccionar el espacio entre cada imagen Z-pila (normalmente 2-4 m). </li><li> Elija el momento intErval entre cada captura z-stack (por ejemplo, 3 min) y la duración total de imágenes (por ejemplo, 3 h). </li><li> Haga clic en el icono &quot;Guardar&quot; para guardar los cambios en los parámetros de la imagen. </li><li> Pulse el botón de grabación para comenzar a imágenes. </li></ol></li><li> Imágenes Alterno de muestras de control y experimentales (para / tratamiento farmacológico ejemplo vehículo o diferentes plásmidos por electroporación) en todo el mismo día. </li></ol> 4. Analizando las Migraciones Neuroblast <ol><li> En el módulo Volocity cuantificación, abra la biblioteca deseada creado después de completar un experimento de time-lapse. Seleccione &quot;Enfoque ampliado&quot; en el cuadro de la parte superior izquierda (Figura 4 A, paso 1). </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Medidas&quot; para mostrar la ventana de medición (Figura 4, paso 2). </li><li> Una lista de tareas es visible en la parte inferior izquierda de la pantalla. Drag &quot;Track&quot; (presente en la sección &quot;Miscelánea&quot; la partida en la parte inferior dela lista) en el espacio de arriba. Esto hará que la apertura de una nueva ventana llamada &quot;Track&quot; en la parte superior izquierda de la pantalla (Figura 4 A, paso 3). </li><li> Seleccione &quot;Puntos&quot; de la pestaña &quot;Input&quot; en la ventana Track (Figura 4A, paso 4). </li><li> Haga clic en la herramienta Punto (Figura 4A, el paso 5). </li><li> Iniciar el seguimiento de la migración de los neuroblastos haciendo clic con el ratón sobre la zona central del cuerpo celular y mantener el seguimiento del movimiento de la célula hasta el último punto del tiempo-lapso de tiempo que se alcance (por ejemplo, el punto número 61 para una película-hr larga 3) . </li><li> Para obtener datos eligen &quot;Make Pieza Medida&quot; en el Menú Medidas (Figura 4B, pasos 6-7). Aparecerá una ventana en el centro de la pantalla. </li><li> En esta ventana, seleccione &quot;Un nuevo elemento de medida llamada:&quot; y escriba un nombre (Figura 4C, el paso 8). Recuerde que debe seleccionar la opción &quot;Todos los puntos de tiempo&quot; antes de presser OK (Figura 4C, el paso 9). Un archivo de elemento de medición aparecerá en el archivo de lapso de tiempo y contendrá los parámetros para el análisis cuantitativo (por ejemplo, la distancia de migración, velocidad, desplazamiento y velocidad de desplazamiento). </li><li> Haga doble clic en el archivo de elemento de medición para abrir como una ventana (Figura 4D, el paso 10). </li><li> Para visualizar las pistas individuales de células analizadas, elegir la opción &quot;Punto de cadenas&quot; de las &quot;de pantalla&quot; Opciones (Figura 4D, paso 11). </li><li> Haga clic derecho sobre el archivo de artículos Medición y exportarlo como un archivo de texto, que luego pueden ser importados en programas como Excel para analizar los parámetros de migración. </li><li> Para medir los movimientos entre tramas consecutivas y pausas realizadas por cada célula durante el período de rodaje, en el archivo de artículos de Medidas Seleccione entre las opciones &quot;Display&quot; &quot;Point&quot; o &quot;poblaciones&quot; y haga clic en el identificador (cada pista tiene un ID único). Exportar el archivo resultante de procederción, como se explica en el paso 4.10. </li></ol>

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(67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Eficiente de la migración de células progenitoras neurales a lo largo de los RMS asegura su posterior maduración en neuronas funcionales 10. Corrientes prominentes de progenitores neurales dirigidos hacia el OB son visibles en la infancia humana y es probable que desempeñen un papel importante en el desarrollo del cerebro humano temprano postnatal 27. Por otra parte, estas células son capaces de sitios diana del cerebro afectadas por la lesión y 4,28 neurodegeneración. Ser capaz d...

En el cerebro de los mamíferos, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce después del nacimiento principalmente en dos regiones, la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular en el giro dentado del hipocampo 1. Considerable evidencia reunida en los últimos años destaca el papel primordial para la neurogénesis postnatal en funciones de la memoria del hipocampo y el bulbo olfatorio 1-3. Es importante destacar que la neurogénesis postnatal también tiene potencial terapéutico debido a su relación con los trastornos neurológicos degenerativos, y la capacidad de los neuroblastos a migrar a sitios de heridas en el cerebro 4-6. La zona subventricular (SVZ) ha surgido recientemente como un nicho neurogénico crucial. Neuroblastos derivados de SVZ migran hacia el bulbo olfatorio (OB) a través de la corriente migratoria rostral (RMS), haciendo de este el proceso de migración más largo del 1,7,8 cerebro postnatal. El / RMS / sistema OB de mamíferos SVZ se ha convertido en unmodelo útil para estudiar los diferentes pasos en la neurogénesis, como la proliferación, migración y diferenciación de 1,8. Muchos factores de crecimiento y señales extracelulares regulan la neurogénesis ZVS y la migración a lo largo de la RMS, pero los mecanismos moleculares intracelulares están lejos de ser plenamente entendidos 1,9. Migración correcta a lo largo de la RMS es crucial para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas 10. Además, algunos estudios han demostrado que los neuroblastos derivados de SVZ pueden migrar fuera de los RMS a los sitios de lesión cerebral 4-6,11-13. Por lo tanto, la investigación de la migración de los neuroblastos mecanismos de señalización de regulación es fundamental no sólo para entender la neurogénesis, sino también para aplicaciones terapéuticas potenciales. Aquí se describe un protocolo detallado para etiquetar progenitores neurales SVZ por electroporación in vivo después del parto y vigilar su migración a lo largo de los RMS en cultivos de cortes cerebrales agudos utilizando time-lapse confocal de disco giratorio microscópicapy. La electroporación es ampliamente utilizado en los estudios de desarrollo de embriones a los estadios adultos de 14-18. Es una poderosa herramienta para orientar y manipular progenitores neurales SVZ y representa una alternativa más barata y mucho más rápida que la inyección estereotáxica de vectores virales o generación de modelos transgénicos 1,15,19,20. Se trata de un procedimiento relativamente simple que no necesita cirugía y tiene altas tasas de supervivencia. Electroporación de shRNA o plásmidos que expresan recombinasa CRE en los modelos genéticos de ratones que emplean el sistema LoxP se puede utilizar para apuntar a genes de interés o para conseguir el etiquetado permanente de progenitores ZVS, lo que representa una herramienta útil para estudios de la neurogénesis adulta 21,22. Imaging RMS neuroblast migración en el cerebro intacto sigue siendo un reto debido a las limitaciones técnicas actuales. Sin embargo, este proceso se puede controlar utilizando el disco confocal hilado time-lapse microscopía de rodajas de cerebro de agudos, que proporcionan una adecuada sistem muy parecidas a las condiciones in vivo también susceptibles a la manipulación farmacológica 23,24. Acoplamiento de electroporación postnatal vivo con time-lapse facilitará la comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la motilidad neuroblastos y contribuir al desarrollo de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

La zona subventricular (SVZ) es uno de los principales nichos neurogénicos en el cerebro postnatal. Aquí, progenitores neurales proliferan y dan lugar a neuroblastos capaces de moverse a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB). Se requiere esta migración de larga distancia para la posterior maduración de las neuronas recién nacidas en el OB, pero los mecanismos moleculares que regulan este proceso aún no están claros. La investigación de las vías de señalización que controlan la motilidad neuroblastos no sólo puede ayudar a entender un paso fundamental en la neurogénesis, pero también tienen el potencial de regeneración terapéutica, dada la capacidad de estos neuroblastos en los sitios diana del cerebro afectadas por una lesión, accidente cerebrovascular, o degeneración. En este manuscrito se describe un protocolo detallado para la electroporación in vivo postnatal y la posterior time-lapse de la migración de los neuroblastos en el RMS ratón. Electroporación postnatal puede transfectar eficazmente SVZ progenitorcélulas, que a su vez generan neuroblastos migran a lo largo de la RMS. El uso de disco giratorio confocal time-lapse microscopía en cultivos de cortes cerebrales agudos, la migración de los neuroblastos se puede controlar en un ambiente muy parecido al estado in vivo. Por otra parte, la movilidad de los neuroblastos pueden ser rastreados y analizados cuantitativamente. A modo de ejemplo, se describe cómo utilizar la electroporación in vivo después del parto de un plásmido GFP-expresando etiquetar y visualizar los neuroblastos migran a lo largo de la RMS. La electroporación de plásmidos que expresan recombinasa CRE shRNA o en ratones knock-out condicionales que emplean el sistema LoxP también se puede utilizar para apuntar a los genes de interés. La manipulación farmacológica de cultivos de cortes cerebrales agudos se puede realizar para investigar el papel de las diferentes moléculas de señalización en la migración de los neuroblastos. Mediante el acoplamiento de la electroporación in vivo con time-lapse, esperamos comprender los mecanismos moleculares que controlan la motilidad de los neuroblastos y contribuir al desarrollo deción de nuevos enfoques para promover la reparación del cerebro.

Etiquetado de neuroblastos migratorias derivadas de SVZ se puede observar a lo largo de los RMS, generalmente 4-8 días después de una electroporación con éxito (Figura 1B). Puntos de tiempo más largos también pueden ser elegidos, pero menos de células se encuentran en el RMS ya que la mayoría de ellos se han entrado en el OB. Los neuroblastos comienzan a adquirir una morfología típica y las características de las células granulares maduras en el OB de alrededor de 2-3 semanas después de la ...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K vistas.  King's College London.  La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo. 

Video: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Investigación

Neurociencias

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...