وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست مشروع المنح منحت لPD وGL (089236/Z/09/Z). وأيد من قبل SG التكنولوجيا الحيوية والدكتوراه مجلس بحوث العلوم البيولوجية studentship. نشكر ماتيو Vermeren للهدية نوع من ناقلات shRNA وجنيفر لShieh النصائح القيمة على أرومة عصبية nucleofection.

هذا الإجراء هو وفقا للوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة (قانون الإجراءات العلمية الحيوانية، 1986). ينبغي أن تتبع العلماء المبادئ التوجيهية الموضوعة والتي وافقت عليها الهيئات التنظيمية الحيوان المؤسسية والوطنية. 1. تشريح والتفكك من الجرذ RMS Neuroblasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول المطلوبة للتشريح والتفكك RMS: </li></ol> تشريح المتوسطة (100 مل) محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) - 98.5 مل 5 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7،4-0،5 مل البنسلين الستربتوميسين (10،000 وحدة / مل و 10،000 ميكروغرام / مل) - 1 مل تفارق المتوسطة (2 مل) HBSS - 1.760 مل 10X التربسين (2.5٪) - 200 ميكرولتر DNAse1 (1 ملغ / مل) - 40 ميكرولتر Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ الجنين مصل العجل (FCS) (40 مل) DMEM -36 مل FCS - 4 مل متوسطة كاملة (12 مل) متوسطة Neurobasal - 11.46 مل B27 الملحق - 250 ميكرولتر L-الجلوتامين (200 ملي) - 125 ميكرولتر الجلوكوز (45٪) - 165 ميكرولتر 2. فلتر تعقيم٪ السفح DMEM + 10 والمتوسطة كاملة وpreequilibrate لهم في 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية القمامة الفئران P6-P7 (حوالي 12 الجراء) من قبل خلع عنق الرحم وقطع رأس مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الجلد الأمامي الخلفي على طول الدرز منتصف السهمي من الأنف إلى المخيخ بشفرة المشرط. سلخ الجلد وتكرار نفس شق على طول الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة اللوحات الجمجمة مع ملقط وإزالة بعناية الدماغ مع ملعقة، مع الحرص على تضمين بصيلات الشم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض ثالث أكثر الذيلية من الدماغ وتخلص منه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم عشره أنسجة المخ إلى 1.4 ملم شرائح سميكة الاكليلية باستخدام المروحية الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح في الأطباق التي تحتوي على تشريح الباردة المتوسطة وفصلها بعناية باستخدام إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وRMS يظهر على شكل الثلاثي، منطقة شفافة في وسط أقسام OB ونتيجة ل، منطقة دائرية صغيرة في أكثر شرائح الدماغ الذيلية. قطع RMS من كل شريحة بسكين المجهرية، مع الحرص على تجنب بما في ذلك الأنسجة المحيطة. في الفئران الوليدة P7، وعادة ما ~ 8 شرائح الأكثر منقاري (بما في ذلك OB) تحتوي على RMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع شظايا RMS مع البلاستيك ماصة باستير ووضعها في صحن صغير يحتوي على تشريح الباردة المتوسطة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تشريح كاملة، نقل شظايا RMS في أنبوب 15 مل مع ماصة بلاستيكية. ترك شظايا ليستقر في الجزء السفلي من الأنبوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة تشريح مع 2 مل من التفكك المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن شظايا RMS بواسطة بلطف عipetting تعليق جزء صعودا وهبوطا حول 10X باستخدام ماصة P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأنبوب مع شظايا الأنسجة في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الحل مرة أخرى 10X والتأكد من أن شظايا وقد فصل (ينبغي أن تصبح تعليق غائم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبطال نشاط التربسين وذلك بإضافة 5 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 433 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون ذلك قسامة المبلغ المطلوب من سيرنا / الحمض النووي في أنابيب إيبندورف (عادة 3-5 DNA ميكروغرام / shRNA أو 5-9 ميكروغرام سيرنا بنسبة ضئيلة في nucleofection، ولكن كمية الحمض النووي / سيرنا قد تتطلب الأمثل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة المتوسطة و resuspend بيليه الخلية من قبل pipetting لطيف في 5 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ عدد خلايا. نتوقع ~ 1 × 10 6 خلايا في الفئران الجرو الدماغ. وثمة حاجة إلى الحد الأدنى من 2.5 × 10 6 خلايا لكل nucleofection، في حينوتتحقق أفضل النتائج باستخدام 3-4 × 10 6 خلايا في nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 433 x ج لمدة 5 دقائق. تأكد من إزالة أكبر قدر ممكن المتوسطة. </li></ol></li></ol> 2. Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend فورا بيليه خلية في الفئران (الماوس أو إذا باستخدام خلايا فأر) الخلايا العصبية حل nucleofection المحتضنة سابقا في درجة حرارة الغرفة. استخدام 100 ميكرولتر لكل nucleofection ملاحظة: عادة القمامة الفئران من 12 الجراء هي كافية لتنفيذ 4 nucleofections والقمامة الماوس (12 الجراء) كافية لأداء nucleofections 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية لكل أنبوب إيبندورف تحتوي على سيرنا / الحمض النووي والمزيج بلطف 2-3X من قبل pipetting مع ماصة P200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة نموذج (cell-DNA/siRNA التعليق) إلى الجزء السفلي من nucleofectioncuvette، مع الحرص على تجنب الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nucleofect باستخدام برنامج G-013 (للخلايا الفئران) أو O-005 (لخلايا فأر). واحد nucleofection يستغرق حوالي 5 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة إضافة 1 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS إلى عينة nucleofected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.4 و 2.5 لجميع العينات الأخرى. ملاحظة: لأفضل النتائج، يجب إجراء nucleofection بأكمله لن يدوم أكثر من 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل عينة إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من prewarmed DMEM + 10٪ FCS باستخدام ماصة بلاستيكية المقدمة من عدة nucleofection. تجنب نقل أي حطام الخلوية في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 433 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية كل المتوسطة الزائدة و resuspend بيليه في 25-30 ميكرولتر من prewarmed DMEM + 10٪ FCS باستخدام ماصة P20. لا تستخدم أكثر من 30 ميكرولتر من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة التعليق كشرط قطرة على الجانب الداخلي من غطاء طبق P35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس غطاء على طبق P35 يحتوي على 2 مل من المتوسط ​​كاملة (انظر أيضا الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك في الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ CO 2) في للا يقل عن 5 ساعة وتصل إلى 7 ساعة. أطول فترة حضانة يسمح إعادة تجميع أفضل من مجموعات الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قطرات شنقا من الغطاء في المتوسط ​​كاملة في طبق باستخدام ماصة P1000 مع خفض الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة لnucleofections DNA و 48 ساعة لnucleofections سيرنا / shRNA. </li></ol> 3. تضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة كاملة (25 مل) وpreequilibrate ذلك عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لبضع ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخراج مأخوذة المجمدة من مصفوفة الغشاء القاعدي من -80 ° C الفريزر وذوبان الجليد على الجليد في غرفة باردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل nucleofection إعداد الطبق 6 سم تحتوي على ما يصل إلى ثمانية 13 ملم coverlips العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأطباق على الجليد مربع مغطاة تتشبث فيلم. فمن المهم للحفاظ لل coverslips بارد لمنع تصلب مصفوفة أثناء إجراء التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على الرطوبة، ووضع شريط من الأنسجة رطبة داخل صحن 15 سم أن ثسوء استخدامها لاستيعاب ما يصل إلى ثلاثة أطباق 6 سم تحتوي على neuroblasts المضمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المتوسطة كاملة إلى مصفوفة إذابة في نسبة 01:03. على سبيل المثال، مزيج 40 ميكرولتر من المتوسطة كاملة مع 120 ميكرولتر من المصفوفة من قبل pipetting. هذا المبلغ من مصفوفة كافية لتضمين المجاميع على ثمانية 12 ملم coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مجموعات الخلايا reaggregated إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 433 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة المتوسطة و resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من المتوسطة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 2 ميكرولتر من تعليق خلية الكلي على كل ساترة العقيمة وإضافة 18 ميكرولتر من المصفوفة / كاملة خليط المتوسطة. استخدام غيض ماصة لنشر مصفوفة على ساترة بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على الفور 6 سم صحن يحتوي لل coverslips في صحن 15 سم وتترك في الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ CO 2) لمدة 15-20 دقيقة. عندما عزز المصفوفة، إضافة بلطف 5 مل المتوسطة كاملة لكل 6 سم أخذ الطبق الرعاية لدفعأسفل أي ساترة العائمة مع طرف ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 للسماح neuroblasts تهاجر من المجاميع الخلية. </li></ol> 4. 3D الهجرة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول المطلوبة للالمناعية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل كتلة: الحل كتلة الماعز (50 مل) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) - 5 مل مصل الماعز - 7.5 مل 10٪ تريتون X-100 - 1.5 مل BSA - 50 ملغ H 2 O - 36 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تحديد: تحديد الحل (100 مل) بارافورمالدهيد (PFA) - تنبيه 4 ز: دائما التعامل مع PFA تحت غطاء محرك السيارة السكروز - 20 غ (اختياري) برنامج تلفزيوني يصل إلى 100 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على طبق ساخن وتحت التحريك المستمر بحل PFA في 80 مل الحفاظ على برنامج تلفزيوني في 65 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد حل PFA، إضافة 20 غرام من السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الرقم الهيدروجيني إلى7.4 (عادة عن طريق إضافة 60 ميكرولتر 1 ~ M هيدروكسيد الصوديوم في 100 مل من محلول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إحضار إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 مل مع برنامج تلفزيوني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع coverslips في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف coverslips مع PBS 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح المجاميع أرومة عصبية RMS مع الحل تحديد لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف coverslips مع PBS 3X (5 دقيقة / غسيل - على منصة هزاز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع لمدة 30-60 دقيقة مع كتلة الحل الماعز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الأولية في الماعز حل كتلة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. (إذا رغبت في ذلك، phalloidin الفلورسنت (1:400) وهويشت صبغ (1:10،000) ويمكن أيضا أن يضاف إلى حل الأجسام المضادة الأولية لتصور أكتين الخيطية ونوى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف coverslips مع PBS 3X (5 دقيقة / غسيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الثانوية الماعز في حل كتلة واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف coversliملاحظة 3X مع برنامج تلفزيوني (5 دقيقة / غسيل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل coverslips مع الفلورسنت المتوسطة المتزايدة وتترك لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الهجرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور من RMS المجاميع أرومة عصبية ثابتة مع المجهر الفلورسنت باستخدام الهدف 10X. تشمل شريط النطاق في صورة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد مقياس لتقدير وقياس حجم شريط في الصورة عن طريق اختيار أداة &quot;خط مستقيم&quot; على شريط الأدوات يماغيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر الخيار &#39;تحليل&#39; وانقر على &#39;تعيين نطاق&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في إطار نطاق تعيين &quot;مسافة المعروف &#39;ووضع علامة في مربع&#39; العالمية &#39;للحفاظ على نفس الإعدادات لكافة القياسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة &quot;خط مجزأة&quot; على شريط الأدوات يماغيج لقياس المسافة من حافة مجموعها إلى أبعد أرومة عصبية هاجر في 6 قطاعات مختلفة في جميع أنحاء المجموعة بأكملها (الشكل 3B). تنظر AG معزولة فقطgregates للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مسافة متوسط ​​الهجرة من القيم التي تم الحصول عليها 6 لكل الكلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 10-20 المجاميع لكل حالة في كل المستقلة نتائج التجربة وبركة من حد أدنى من ثلاث تجارب مستقلة. وتشمل دائما السيطرة nucleofection (على سبيل المثال. GFP أو ركلات الترجيح السيطرة / سيرنا). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Neurogenesis+in+the+Mammalian+Brain:+Significant+Answers+and+Significant+Questions.">Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adult-born+neurons+facilitates+learning+and+and+memory.">Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory.</a> Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).</li><li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction?.">Is adult neurogenesis essential for olfaction?.</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li><li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke.">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li><li>Jin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain.">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).</li><li>Kim, Y., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+subventricular+zone+stem+cells+after+neuronal+injury.">Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury.</a> Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).</li><li>Massouh, M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De-routing+neuronal+precursors+in+the+adult+brain+to+sites+of+injury:+Role+of+the+vasculature.">De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature.</a> Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).</li><li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis.">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li><li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Neuronal+Migration+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li><li>Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+migration+of+neuronal+precursors.">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li><li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Neuronal+Migration+Changes+the+Fate+of+Developing+Neurons+in+the+Postnatal+Olfactory+Bulb.">Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li><li>Battista, D., Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polysialic+Acid+Triggers+Dispersion+of+Subventricularly+Derived+Neuroblasts+into+Surrounding+CNS+Tissues.">Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues.</a> J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).</li><li>Conover, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Eph/ephrin+signaling+affects+migration+and+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone.">Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone.</a> Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).</li><li>Mobley, A. K., McCarty, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta+8+Integrin+is+Essential+for+Neuroblast+Migration+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream.</a> Glia. 59, 1579-1587 (2011).</li><li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+slits+in+the+control+of+cell+migration+in+the+rostral+migratory+stream.">Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).</li><li>Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+regulates+migration+of+olfactory+interneuron+precursors+in+the+rostral+migratory+stream+through+Met-Grb2+coupling.">Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling.</a> J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).</li><li>Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+signaling+in+postnatal+neurogenesis:+The+first+leg.">Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg.</a> Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).</li><li>Dityateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+electroporation-based+gene+transfer+into+primary+dissociated+neurons.">Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons.</a> J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).</li><li>Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Regulates+Cell+Soma+Translocation+and+the+Distribution+of+Adhesion+Proteins+in+Migrating+Neurons.">Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.</a> PloS One. 6, (2011).</li><li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons.">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e2373 (2011).</li><li>Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+primary+neurons.">Nucleofection of primary neurons.</a> Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).</li><li>Causeret, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21-Activated+Kinase+Is+Required+for+Neuronal+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).</li><li>Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+knockdown+of+neuropilin-1+in+the+developing+chick+nervous+system+by+siRNA+hairpins+phenocopies+genetic+ablation+in+the+mouse.">Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse.</a> Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li><li>Ward, M., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+neuronal+migration+in+the+central+nervous+system.">Investigations of neuronal migration in the central nervous system.</a> Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Selection+for+High-Expression+Transfectants+with+a+Novel+Eukaryotic+Vector.">Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Acute+Slices+of+the+Adult+Mouse+Forebrain.">Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Vis. Exp. , e4061 (2012).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling.">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Vessels+Form+a+Migratory+Scaffold+in+the+Rostral+Migratory+Stream.">Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li><li>Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Postnatal+Electroporation+and+Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Mouse+Acute+Brain.">In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain.</a> J. Vis. Exp. , (2013).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هجرة neuroblasts على طول RMS إلى الموقع النهائي في OB هو خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. ومع ذلك، فإن آليات الجزيئية التي تتحكم في هذه العملية المعقدة بعيدة كل البعد عن أن يكون مفهوما بشكل كامل. إجراء التجارب وصفها هنا يسمح للدراسة الهجرة أرومة عصبية في المختبر. تكيفنا بروتوكول نشرت سابقا لعزل RMS neuroblasts من المبكر بعد الولادة الماوس أو الفئران 25. لتحقيق أفضل النتائج من المهم لإتقان الخطوة تشريح، لأنه أمر حاسم للحفاظ على الفاصل الزمني بين التشريح وnucleofection إلى الحد الأدنى. بعد nucleofection، neuroblasts يمكن reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد وغادر إلى الهجرة خلال فترة 24 ساعة. بدلا من ذلك، لأغراض أخرى غير الهجرة (على سبيل المثال المناعي أو تحليل لطخة غربية)، وخلايا يمكن مطلي مباشرة بعد nucleofection على polyornithine/laminin-coverslips المغلفة، حيث يعيش ما يصل إلى 4-5 أيام. الفأر والفئران تهاجر neuroblasts في Matrigel إلى حد مماثلة، ولكن تظهر خلايا فأر لديهم ميل إلى الهجرة أقوى في سلاسل من خلايا الفئران. اعتمادا على الهدف من هذه الدراسة، neuroblasts يمكن nucleofected مع البلازميدات مختلفة ترميز البروتينات الفلورية أو نوع / متحولة البروتينات البرية من الفائدة. لأفضل البلازميدات البروتين التعبير مع المروج CAG (β أكتين المروج مع محسن CMV وغلوبين بولي β-A الذيل) ويوصى بشدة 26. علاوة على ذلك، oligos سيرنا أو البلازميدات shRNA يمكن nucleofected لضربة قاضية من الأهداف الفائدة. استنزاف البروتين فعالة يمكن تصور بواسطة المناعي أو لطخة غربية (عادة lysing المجاميع جزءا لا يتجزأ من 1 الفئران الجرو مع 50 ميكرولتر من العازلة تحلل قياسي). Nucleofection هي طريقة بسيطة نسبيا لبالنقل neuroblasts الأولية، ويقدم بديلا أسهل وأسرع لالسادسراؤول بوساطة ناقلات ترنسفكأيشن، ويمكن تحقيق عالية (~ 70-80٪) كفاءة ترنسفكأيشن. فمن الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة أثناء إجراء nucleofection، منذ ان ترك neuroblasts في حل nucleofection لفترة طويلة يقلل بشكل كبير بقاء الخلية. ومتوسط ​​العائد خلية من RMS تشريح منخفضة نسبيا بالنسبة للفئران P7 (~ 5 × 10 5 خلية / الدماغ) بالمقارنة مع الفئران P7 (~ 1 × 10 6 خلية / الدماغ) ويطلب من لا يقل عن 3 × 10 6 خلايا في nucleofection لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن مع ~ 50٪. علاوة على ذلك، تظهر neuroblasts الفئران لمقاومة أفضل للnucleofection مقارنة neuroblasts الماوس. وبالتالي، الجراء بعد الولادة المبكرة (P6-P7) الفئران قد تمثل مصدرا أرومة عصبية مريحة، معتبرا أيضا أن تنظيم الجرذان والفئران RMS هي سيمي بشكل ملحوظلار 27 وأن مدى الجرذان والفئران في المختبر أرومة عصبية الهجرة هي أيضا قابلة للمقارنة. فإنه من المستحسن عدم إبقاء الكتل reaggregated من neuroblasts nucleofected في التعليق لمدة أطول من 48 ساعة لتجنب آثار غير طبيعية على التشكل الخلية والهجرة (الملاحظات غير منشورة لدينا). مقايسة 3D الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لقياس الهجرة أرومة عصبية عند نقطة زمنية محددة بعد التضمين في المصفوفة (على سبيل المثال 24 ساعة). مجاميع من أحجام مختلفة يمكن استخدامها في التحليل، حيث لا يوجد ارتباط كبير بين حجم الركام وبعد الهجرة (الملاحظات غير منشورة لدينا). لتصور ومواصلة التحقيق في ديناميات الهجرة أرومة عصبية، ويمكن استخدام الوقت الفاصل بين التصوير. فمن المستحسن لإجراء التحليل الهجرة ضمن فاصل زمني 24 ساعة بعد التضمين، منذ سرعة neuroblasts يبدو أن ينخفض ​​بشكل كبير في نقاط زمنية أطول (الملاحظات غير منشورة لدينا). &lt;/ ع&gt; هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. الأولى، nucleofection يمكن أن تستخدم حتى الآن في أوائل neuroblasts القوارض بعد الولادة، في حين العدوى الفيروسية مع نواقل يبقى الأسلوب الأكثر فعالية لترنسفكأيشن neuroblasts الكبار 28. الثانية، في المختبر فحص الهجرة لا تتكاثر بشكل كامل العمارة المعقدة للRMS لوحظت في الجسم الحي. في الواقع، على الرغم من neuroblasts الحفاظ على القدرة على الهجرة بطريقة مماثلة لنظيراتها في الجسم الحي، في الإعداد التجريبية وصفها هنا أنها تفتقر إلى التفاعل مع غيرها من مكونات RMS مثل الخلايا النجمية والأوعية الدموية، والتي تسهم أيضا في تنظيم الحركة على 9،29، 30. ويمكن معالجة هذه المسألة في المستقبل عن طريق الاستفادة المثلى من نظم نموذج coculture ثلاثية الأبعاد. في الختام، والجمع بين nucleofection مع مقايسة الهجرة 3D يمثل أداة قيمة لفهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة وراءالهجرة أرومة عصبية. يوفر هذا الإجراء التجريبي وسيلة أولية وسريعة وبسيطة نسبيا لتقييم دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية، والتي يمكن التحقق من صحتها عن طريق مزيد من المناهج الأخرى مثل التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بعد الولادة والوقت الفاصل بين التصوير من الثقافات شريحة الدماغ 28،31،32 .

في الثدييات بعد الولادة الدماغ، وتوليد خلايا عصبية جديدة (تكوين الخلايا العصبية) ويحدث في جميع مراحل الحياة ويقتصر على اثنين من منافذ العصبية: منطقة subventricular (SVZ) من البطينين الوحشي والمنطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من الحصين 1. وقد أظهرت العديد من الدراسات الحديثة على الدور الهام للتكوين الخلايا العصبية الكبار في تسهيل مهام التعلم والذاكرة 2،3. علاوة على ذلك، دليل على انتشار وتجنيد الأسلاف العصبية التالية إصابات الدماغ 4-7 يثير إمكانية تفعيل الدوائية من تكوين الخلايا العصبية في إصلاح العصبية. وينظم تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة بدقة في جميع مراحلها، والتي تشمل انتشار العصبية السلف، والهجرة، والتمايز والبقاء، والتكامل متشابك النهائي من الخلايا العصبية المولود حديثا 8. الأسلاف العصبية (neuroblasts) المشتقة من الخلايا الجذعية في SVZ الهجرة على مسافة كبيرة من خلال المهاجرة منقاريتيار (RMS) نحو البصلة الشمية (OB) حيث تنضج الخلايا العصبية الوظيفية في 9. neuroblasts المهاجرة في الغالب أحادي القطب، مع خلايا الجسم ممدود تمتد عملية رائدة واحد. هذه الخلايا تتحرك في سلاسل بطريقة جماعية، ينزلق أكثر من 10 آخرين. الهجرة هي خطوة حاسمة لنضوج اللاحقة من الأسلاف SVZ المستمدة من الخلايا العصبية الوظيفية في 11 وتسيطر عليها عوامل متعددة والجزيئات التوجيه بما في ذلك: polysialylated العصبية جزيء التصاق الخلية (PSA-NCAM) 12، 13 Ephrins، لل integrins 14، 15 الشقوق، عوامل النمو 16 و 17 الناقلات العصبية، ولكن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العملية ليست مفهومة تماما. وسوف تحقق في مسارات الإشارات داخل الخلايا تنظيم الهجرة أرومة عصبية ليس فقط توفير فهم أفضل لتكوين الخلايا العصبية الكبار، ولكن سوف تسهم أيضا في تطوير علاجية جديدةالنهج لتعزيز إصلاح الدماغ. يصف هذا المخطوط بروتوكول مفصلة لدراسة دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية في المختبر باستخدام nucleofection ومقايسة الهجرة 3D. Nucleofection هو أسلوب ترنسفكأيشن الخلية يعتمد على طريقة محسنة من التثقيب الكهربائي. خلية من نوع التيار الكهربائي محددة والحل nucleofection السماح بنقل الجزيئات polyanionic مثل الحمض النووي وناقلات shRNA وأليغنوكليوتيد سيرنا مباشرة في نواة الخلية وترنسفكأيشن تصريح تقسيم ببطء أو ميتوتيكلي الخلايا الخاملة مثل الخلايا العصبية الجنينية والثدييات 18. هذا الأسلوب هو سريعة وسهلة نسبيا لأداء ونتائج في ترنسفكأيشن تكرار للغاية من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية الابتدائية وneuroblasts 19-21. تفكك الأنسجة RMS يسمح عزلة neuroblasts المهاجرة، والتي يمكن nucleofected بنجاح مع الحمض النووي / SHRناقلات NA أو oligos سيرنا استهداف الجينات في المصالح. nucleofection التالية، يتم reaggregated neuroblasts في شنقا قطرات وجزءا لا يتجزأ في وقت لاحق في Matrigel مصفوفة ثلاثية الأبعاد. هذه الظروف تسمح neuroblasts إلى الهجرة من المجاميع الخلية تلخص وضع الهجرة لوحظت في الجسم الحي، وبالتالي توفير نظام نموذجا ممتازا للتحقيق في مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الهجرة وأرومة عصبية لتقييم تأثير العلاجات الدوائية على حركية هذه الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

منطقة subventricular (SVZ) الموجود في الجدار الجانبي من البطينين الوحشي يلعب دورا أساسيا في تكوين الخلايا العصبية الكبار. في هذه المنطقة المحظورة من الدماغ، والخلايا الجذعية العصبية تتكاثر وتولد باستمرار neuroblasts التي تهاجر بشكل طفيف في سلاسل على طول تيار المهاجرة منقاري (RMS) لتصل إلى البصلة الشمية (OB). مرة واحدة في OB، neuroblasts التحول إلى الهجرة شعاعي ثم تفرق في الخلايا العصبية الناضجة قادرة على أن تدرج في الشبكة العصبية الموجودة مسبقا. الهجرة أرومة عصبية الصحيح هو خطوة أساسية في تكوين الخلايا العصبية، وضمان نضوج وظيفية الصحيح من الخلايا العصبية الوليد. ونظرا لقدرة neuroblasts SVZ المستمدة من استهداف المناطق المصابة في الدماغ، والتحقيق في الآليات داخل الخلايا الكامنة وراء الحركة التي لن تعزز فقط فهم تكوين الخلايا العصبية ولكن أيضا يمكن أن تعزز وضع استراتيجيات neuroregenerative. يصف هذا المخطوط مفصلةبروتوكول لترنسفكأيشن من القوارض الأولية RMS neuroblasts بعد الولادة وتحليل حركية بهم باستخدام 3D في المختبر فحص الهجرة تلخص طريقتهم في الهجرة لوحظت في الجسم الحي. ويمكن لكل من الجرذان والفئران neuroblasts تكون بسرعة وكفاءة transfected عبر nucleofection مع أي الحمض النووي البلازميد، دبوس صغير (ش) RNA أو قصيرة التدخل (الاشتراكية) oligos RNA استهداف الجينات في المصالح. لتحليل الهجرة، وreaggregated الخلايا nucleofected في &#39;قطرات شنقا&#39; وبعد ذلك جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. Nucleofection في حد ذاته لا يضعف بشكل كبير من الهجرة من neuroblasts. ويمكن أيضا العلاج الدوائي من neuroblasts nucleofected وreaggregated أن يؤديها لدراسة دور مسارات الإشارات التي تنطوي عليها الهجرة أرومة عصبية.

Neuroblasts يمكن عزل بنجاح من تشريح الأنسجة RMS (الشكل 1A) وجزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. الخلايا المعزولة من الفئران أو الماوس إما RMS ما بعد الولادة هي immunopositive لعلامات أرومة عصبية المهاجرة، مثل doublecortin (DCX)، βIII تويولين أو PSA-NCAM (أرقام 1B-C). neuroblasts يمكن فصلها nucleofected بكفاءة مع الحمض النووي (على سبيل المثال. GFP البلازميد ترميز، الشكل 2) أو البلازميدات shRNA (الشكل 4) لتحقيق استنزاف البروتين، والتي يمكن تقييمها من خلال تحليل لطخة غربية (الشكل 4B) أو المناعي (لا يظهر) . خلايا nucleofected مع البلازميدات ترميز GFP ترحيل شعاعيا للخروج مجموعات أرومة عصبية reaggregated (الشكل 3A). الكمي من النسبية ترحيلها مسافة 24 آخر ساعة تضمينها (الشكل 3B) لا يظهر أي اختلاف في الهجرة بين GFP-يفترض<html> إيف الخلايا وGFP سلبية، وخلايا nonnucleofected (الشكل 3C)، مشيرا إلى أن nucleofection في حد ذاته لا يعطل الهجرة. هناك أيضا لا يوجد فرق كبير في مدى الهجرة بين neuroblasts وneuroblasts nucleofected المهاجرة مباشرة من إإكسبلنتس RMS (لا تظهر البيانات). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> الشكل 1. تشريح neuroblasts RMS. (أ) تمثيل تخطيطي للRMS أرومة عصبية تشريح. للحصول على وصف مفصل يرجى الرجوع إلى النص. (ب) خلايا الفئران المعزولة RMS هي immunopositive لصانعي أرومة عصبية المهاجرة DCX وتويولين βlll. بار، و 20 ميكرومتر. (C) خلايا المهاجرة من الماوس RMS إإكسبلنتس تعبر عن أرومة عصبية المهاجرة علامات DCX وPSA-NCAM. بار، و 20 ميكرومتر.0989/50989fig1highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> الشكل 2. الماوس أرومة عصبية nucleofection. تنفصل الماوس RMS تم nucleofected neuroblasts مع pMAX-GFP، reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، وسمح للهجرة لمدة 6 ساعة. Neuroblasts المهاجرة من كتلة الخلية reaggregated (أعلى والصور الطوري) تظهر كفاءة عالية ترنسفكأيشن (القاع والصور قناة GFP). لوحات العمود الأيمن تظهر الصور التكبير أعلى المقابلة لإدراجات سلط عليها الضوء في لوحات العمود الأيسر. الحانات، و 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:c<html> ontent العرض = &quot;6in&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; العرض = &quot;500px&quot; /&gt; الرقم 3. 3D فحص الهجرة. (A) وnucleofected neuroblasts الجرذ مع pMAX-GFP (GFP) أو pCAG-IRES-EGFP 22 (EV)، reaggregated، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة وتترك لمدة 24 ساعة تهاجر. والخلايا ثم الثابتة وimmunostained لGFP (الخضراء) وβIII تويولين (الحمراء). بار، و 50 ميكرومتر. (B) قياس المسافة باستخدام يماغيج الهجرة. وتنقسم الكتلة الخلية reaggregated في 6 قطاعات متساوية. تقاس المسافة بين حافة الكتلة (الخط المنقط) والخلية هاجر أبعد لكل قطاع (C) الكمي من مسافة قريبة هاجر من قبل خلايا nucleofected (GFP إيجابية) والسيطرة، وخلايا nonnucleofected (GFP سلبية) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="&lt;/ HTML">&quot;الشكل 4&quot; FO: محتوى العرض = &quot;6in&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; العرض = &quot;500px&quot; /&gt; الشكل 4. مراقبة الهجرة أرومة عصبية بعد shRNA nucleofection. (A) وnucleofected neuroblasts الجرذ مع عنصر تحكم shRNA ناقلات (PCA-B-3 EGFPm5 كاتم الصوت، والذي يعبر أيضا EGFP 23) أو نفس متجه تحتوي على shRNA استهداف fascin، وهو البروتين تجميع الأكتين 24. تم reaggregated الخلايا أكثر من 48 ساعة، جزءا لا يتجزأ في مصفوفة وتترك لمدة 24 ساعة تهاجر. تم المجاميع ثم الثابتة وimmunostained لGFP (الخضراء) وβIII تويولين (الحمراء). بار، و 50 ميكرومتر. (B) fascin الفعال ويمكن الكشف عن استنزاف 50 ساعة بعد shRNA nucleofection عن طريق تحليل لطخة غربية. ويرد الأكتين هنا كعنصر تحكم التحميل (C) التحليل الكمي من مسافة قريبة الهجرة تبين أن استنزاف fascin يعوق إلى حد كبير الهجرة أرومة عصبية. (يعني ± SEM؛ ** ع &lt;0.01، ن = 3 تجارب مستقلة). <aأ href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; الهدف = &quot;_blank&quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro at JoVE.com

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

الهجرة أرومة عصبية هو خطوة حاسمة في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية من خلال توظيف DNA / RNA الصغيرة دبوس (shRNA) nucleofection ومقايسة 3D الهجرة مع neuroblasts معزولة عن القوارض بعد الولادة منقاري تيار المهاجرة.

Nucleofection من القوارض Neuroblasts لدراسة الهجرة أرومة عصبية<em&gt; في المختبر</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K Views.  King's College London.  الهجرة أرومة عصبية هو خطوة حاسمة في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة. وصف بروتوكول هنا يمكن أن تستخدم للتحقيق في دور المنظمين مرشح للهجرة أرومة عصبية من خلال توظيف DNA / RNA الصغيرة دبوس (shRNA) nucleofection ومقايسة 3D الهجرة مع neuroblasts معزولة عن القوار?...

Video: Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

تصور أرومة عصبية خلال الانقسام السيتوبلازمي<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

الماوس الدماغ المؤخر<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة الهجرة Branchiomotor الوجه العصبية

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...