Agradecemos a los Dres. Alex Gelbard y Willem Overwijk para el asesoramiento sobre la transferencia génica hidrodinámica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (AI098099, SSO), el Centro MD Anderson para el Cáncer de la epigenética, el Centro MD Anderson para la Inflamación y Cáncer (SSW), y el Fondo RE Bob Smith Educación (HSL).

Aprobación institucional se debe obtener por adelantado para todas las manipulaciones experimentales descritas en el presente documento con ratones. Estos incluyen el uso de ratones C57BL6 para el aislamiento de células progenitoras de médula ósea, IFNAR - / - ratones como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas y el uso de HGT para la sobreexpresión de citoquinas in vivo. Alojamiento adecuado y cuidado de los animales también deben ser proporcionados por el investigador o institución. Además, la aprobación institucional puede ser necesaria para los plásmidos utilizados en la transferencia de genes hidrodinámico (es decir, la aprobación de ADN recombinante). Los estudios aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso del Centro de Cáncer MD Anderson de la UT. 1. Transferencia génica hidrodinámica (HGT) Este paso debe ser realizado 2 días antes de la transferencia adoptiva de los CDP para inducir circulantes Flt3L para la expansión de DC in vivo 5. Prepare al menos 5 destinatario ratones / grupo. <ol><li> Para lograr eficiente HGT, los vasos sanguíneos del receptor IFNAR - / - ratones (CD45.2 +) deben ser dilatados mediante la exposición de los ratones a una lámpara de calentamiento durante 5-10 min. </li><li> Coloque el ratón en un dispositivo de inmovilización y desinfectar su cola con etanol al 70%. </li><li> Inyectar 5 g de plásmido que codifica Flt3L en 2 ml de PBS estéril en la vena de la cola usando una aguja de calibre 27. Para la cohorte de control, inyección de 5 mg de vector vacío (pORF) a través de la vena de la cola como se indica. </li><li> Monitorear los ratones durante 15-30 minutos para asegurar que no hay efectos nocivos de la inyección en la vena de la cola. Ratones Volver a instalación de vivienda durante 2 días. </li></ol> 2. Aislamiento de Progenitores Hematopoyéticas de médula ósea de ratón Este paso se debe realizar 2 días después de HGT. Utilice CD45.1 + ratones congenic como la fuente de progenitores de la médula ósea para la transferencia adoptiva en receptor IFNAR - /- animales (CD45.2 +). En este protocolo, se requieren cepas congenic para distinguir donante y el receptor DCs derivadas, así como para evitar el agotamiento inmune mediada por MHC de falta de coincidencia. Se requieren aproximadamente 10 a 20 ratones para proporcionar un número suficiente de células progenitoras hematopoyéticas (10 5 células / ratón receptor) para los experimentos de transferencia. <ol><li> La eutanasia a 10 congenic CD45.1 + ratones mediante asfixia con CO2 y dislocación cervical. </li><li> Coloque cada canal en una bandeja de disección y esterilizar el abdomen y las piernas con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en la mitad del abdomen y cortar a través de la piel del abdomen para cada pierna, corte de la piel a lo largo de la pierna. </li><li> Retire con cuidado la piel de cada pierna, y cortar y quitar las patas de la canal por la articulación de la cadera con unas tijeras afiladas. </li><li> Retire con cuidado los músculos del fémur y la tibia de cada pata usando una cuchilla afilada. </li><li> Eliminarambos extremos del fémur y la tibia con un escalpelo afilado y lugar los huesos en una placa de cultivo que contiene RPMI completo (RPMI con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino, 1% penicilina / estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM y 50 mM β-mercaptoetanol) . </li><li> Preparar una jeringa que contiene 1 ml de RPMI completo, conectados a una aguja 27. </li><li> Insertar la aguja de 27 G en un extremo del fémur o de la tibia. Enjuague la médula ósea del fémur o de la tibia mediante la inyección suavemente el RPMI completo en el hueso. Asegúrese de que las células de médula ósea están siendo removidos del hueso, lo que puede lograrse mediante la detección visual de medios expulsados ​​que parece nublada. </li><li> Repita el lavado cada fémur y la tibia 3x para eliminar completamente las células de la médula ósea. </li><li> Preparar una suspensión de células pipeteando suavemente las células hacia arriba y abajo de 3 a 5 veces en la placa de cultivo. </li><li> Retire los residuos haciendo pasar las células de la médula ósea a través de un colador de 40 células M, la colocación de las células de exudados en una nueva culturalmentee plato. Interrumpir cualquier grupos de células que aparecen en el colador por una suave presión con el extremo de un émbolo de jeringa estéril. </li><li> Lisar las células rojas de la sangre (RBC) presentes en la suspensión de células de médula ósea total de con tampón de lisis RBC comercial según las instrucciones del fabricante. Utilice 2 ml RBC lisis buffer/4-6 x 10 7 células (generalmente células de un ratón) y un tiempo de incubación de 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células de la médula ósea por la granulación células por centrifugación durante 4 min a 500 xg, aspirando suavemente el medio de cultivo, resuspender en 10 ml de tampón FACS (PBS 1x + 2 mM de EDTA + 1% de FBS), células de revestimiento por centrifugación y suavemente aspirando de lavado tampón. </li><li> Repetir el lavado, como se describe en el paso 2,13, para un total de 2 lavados. </li></ol> 3. Fluorescencia de células activadas (FACS) para aislar los CDP Este paso requiere el acceso a un separador de células MidiMACS y columnas MACS LD para un procedimiento de selección negativa inicial,así como una máquina de FACS con al menos 3 láseres para purificar el subconjunto progenitoras multicolor después de la tinción con anticuerpos conjugados con fluorescencia. <ol><li> Después del segundo lavado en el paso 2.14, contar las células de la médula ósea. Sedimentar las células por centrifugación como se describe en el paso 2.13 y resuspender en tampón FACS para lograr una concentración final de 4 x 10 7 células por 30 l de tampón FACS. </li><li> Para preparar las células para FACS, las células de linaje negativo primero se enriquecen con una técnica de selección negativa que elimina las células de linaje positivo de la mezcla de médula ósea usando cromatografía en columna de esferas magnéticas. Para el procedimiento de selección negativa, se añade 1 g de cada uno de los siguientes anticuerpos anti-ratón de rata comercial (ABS) que reconocen marcadores de linaje hematopoyético: CD3, CD19, CD11c, CD11b y Ter-119 Abs. Los Abs debe añadirse en un volumen de 2 l / Ab a la suspensión de células 30 l en tampón de FACS. </li><li> Se incuba la suspensión celular a 4 º C durante 30min. Después de la incubación, se lavan las células dos veces con 10 ml de tampón FACS como se describe en el paso 2,13. </li><li> Resuspender las células para alcanzar una concentración final de 4 x 10 7 cells/40 l de tampón FACS. Añadir 20 l de cabra anti-rata microperlas magnéticas IgG por cada 40 l de suspensión celular. Mezclar suavemente y se incuba a 4 ° C durante 30 min. Lavar las células con 10 ml de tampón FACS como se describe en el paso 2,13. </li><li> Resuspender hasta 10 células de la médula ósea 8 en 500 l de tampón FACS. </li><li> Cargar una columna MACS LD en un separador de células MidiMACS según las instrucciones del fabricante y pre-enjuague de la columna con tampón de 2 ml de FACS. </li><li> Aplicar la suspensión de células de médula ósea de la columna, la carga de hasta 5 x 10 8 células en 2,5 ml de tampón FACS. Asegurar un tubo de recogida (tubo cónico de 15 ml) se coloca debajo de la columna. Lavar la columna 3 veces con 2 ml de tampón FACS / lavado, y recoger las células que pasan a través de la columna, que se enriquece paracélulas de linaje negativo. Contar las células en el material eluido (WASH-a través) de la columna. </li><li> Para llevar a cabo la selección positiva de subconjuntos progenitoras hematopoyéticas por FACS, las células de tinción con la siguiente Abs conjugado con fluorescencia: IL-7R (Pacific Blue), de Flt3 (PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, además de una mezcla de Abs marcadores de linaje dirigidos contra CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 y Ter119 (todo marcado con PerCP Cy5.5). Utilice 0,5-1 l de cada Ab en un volumen total de 100 l. Incubar suspensión de células a 4 º C durante 20-30 min. </li><li> Lavar las células como se indica en el paso 2.13 y resuspender en tampón de FACS en una concentración de 2-3 x 10 7 células / ml. Filtrar células a través de un tubo 35 M tapa filtro de células para eliminar los agregados celulares. Este último paso es crucial para evitar la obstrucción de la máquina FACS. </li><li> Coloque la suspensión de células en un tubo de FACS en el escenario FACS y ordenar los CDP (lin - c-kit lo CD115 + FIt3 +) en elbase del perfil de marcador indicado. Recoger las células purificadas en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de RPMI completo. </li><li> Registre el número absoluto de células clasificadas al final de la carrera FACS. Sedimentar las células por centrifugación como se indica en el paso 2.13 y resuspender en PBS estéril para experimentos de transferencia adoptiva. </li></ol> 4. La transferencia adoptiva de los CDP Este paso se realiza por lo general en las instalaciones de animales, donde se alojan los ratones receptores. Dependiendo de la ubicación de la máquina de FACS, que puede implicar el transporte de las poblaciones de células progenitoras purificadas en las instalaciones de animales antes de la transferencia adoptiva. Suspensiones de células progenitoras deben mantenerse estéril y transportados en hielo. <ol><li> Preparar suspensiones de células para la inyección mediante la dilución de 10 5 CDP purificados en un volumen total de 100 l de PBS estéril. Coloque suspensión de células en una jeringa conectada a una aguja de calibre 27. </li><li> Exponer el receptor IFNAR - / - </sup&gt; ratones (CD45.2 +) a una lámpara de calentamiento durante 5-10 minutos para conseguir la inyección eficiente a través de la vena de la cola. </li><li> Coloque el ratón en un dispositivo de inmovilización y desinfectar su cola con etanol al 70%. </li><li> Inyectar 10 CDP 5 FACS-purificado en 100 l de PBS en la cola vena con una aguja de 27. </li><li> Monitorear los ratones durante 15-30 minutos para asegurar que no hay efectos nocivos de la inyección en la vena de la cola. Ratones Regreso a las instalaciones de la vivienda. </li></ol> 5. El aislamiento del PP y Medición de pDC Cantidades <ol><li> A los 7-10 días después de la transferencia adoptiva, la eutanasia a los ratones receptores. Abra suavemente el ratón por la disección y exponer el intestino. </li><li> Quite todo el intestino y colocarlo en toallas de papel empapadas-PBS. Recoge todos los PPs visibles a lo largo de la pared del intestino delgado mediante finas pinzas y tijeras. C57BL6 y IFNAR - / - ratones tienen típicamente 5-10 PP / ratón, que son diferentes de los folículos linfoides aislados encontradosa lo largo del intestino delgado 18. Tenga en cuenta que los PPs suelen ser estructuralmente distintos, incluso dentro de un solo ratón, asegúrese tan cuidadosamente todos los PPs se identifican y disecados. </li><li> Coloque PP en una placa de Petri que contenía PBS, y el uso de fórceps para eliminar las heces. Repita este procedimiento dos veces para limpiar los PP. </li><li> Resumen PP con 1 mg / ml de colagenasa IV en 10 ml de solución salina equilibrada de Hank 1x (HBSS) en un matraz de 50 ml con agitación vigorosa durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Coloque el PP digerido en el compartimiento superior de un 40 micras células colador celular y de la fuerza a través del filtro con un émbolo de jeringa estéril. Recoger la suspensión de células PP en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Pellet células PP tensas por centrifugación a 500 xg durante 5 min y se vuelve a suspender en 6 ml de solución de Percoll 37% (37% de Percoll en medio RPMI). Colocar suavemente 6 ml de solución de Percoll 70% (70% de Percoll en medio RPMI) por debajo de la suspensión de células, para formar un paso de gradiente de Percoll. </li><li> Centrifugar las células durante 20 min unaT 800 xg con la centrífuga rompa. Las células mononucleares se migrar a la interfaz 37/70%. Después de la centrifugación, la población de células mononucleares se debe recoger por cuidado de pipeteado en la región de interfaz. Pellet recogió células por centrifugación y se lavan dos veces en 50 ml de RPMI completo / lavado. Un gran volumen se utiliza para asegurar la eliminación completa de Percoll. </li><li> Teñir las células PP recolectados con los siguientes anticuerpos para detectar PDC murinos que se derivan de los progenitores de forma adoptiva transferidos (CD45.1 +) o ratones receptores (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) y PDCA-1 (FITC) Abs. Realizar análisis de citometría de flujo de células PP como se indica en los pasos 3.9 y 3.10. Identificar PDC por su CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + fenotipo. Números absolutos PDC se pueden determinar por la siguiente ecuación:% PDC x parael número de células tal PP = PP PDC. </li></ol>

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Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

La técnica de transferencia adoptiva descrito en el presente documento evaluó la contribución de los CDP para la población PP PDC en ratones receptores que son deficientes en PP PDC (por ejemplo IFNAR - / - ratones). En experimentos futuros, será importante evaluar el potencial de otros subconjuntos progenitoras en la generación de PDC PP, en particular, si PDC PP derivan de Flt3 + CLPs. Esta pregunta es importante ya que no queda claro por qué PDC PP son especialmente sensibles a l...

Este sentido, demuestran un protocolo para evaluar si progenitores de células dendríticas comunes (LDC) son capaces de dar lugar a la célula dendrítica plasmocitoide población (PDC) en las placas de Peyer (PP). El objetivo general de la utilización de este método fue el de evaluar la regulación del desarrollo del PDC en las placas de Peyer (PP PDC). La razón de que esto es importante es que PDC PP difieren de PDC se encuentran en otros tejidos, incluyendo la médula ósea, la sangre y el bazo, y por lo tanto no está claro si PDC PP y otras poblaciones PDC son de desarrollo y / o funcionalmente relacionadas. Específicamente, PDC son ampliamente conocidos por ser el principal tipo I de interferón (IFN) productores en el sistema hematopoyético, en respuesta a Toll-like receptor 7 y 9 (TLR7 / 9) la estimulación de la secreción de IFN rápido 1-3. Sin embargo, PDC PP son deficientes en la producción de IFN de tipo I en respuesta a la estimulación de TLR agonista 4,5. Por otra parte, PP PDC también difieren de PDC que se encuentran en la médula ósea y el bazo enque requiere señales del interferón de tipo I (IFN) receptor (IFNAR1) o la señalización de IFN STAT1 molécula para su desarrollo y / o acumulación 5. Estos datos han sugerido la posibilidad de que distintos mecanismos de regulación controlan PDC PP frente a PDC en otros órganos (por ejemplo, médula ósea, bazo) 5. La razón que llevó al desarrollo de este método se basa en los últimos avances en la comprensión de células dendríticas (DC) la biología. La mayoría, si no todos, los subconjuntos de DC se derivan de progenitores hematopoyéticos que expresan el receptor de tirosina quinasa 3 similar al FMS (de Flt3) 6-10; sin embargo, el desarrollo de CC no está restringido a la mieloide clásico y vías linfoides. Por ejemplo, Flt3 + progenitores mieloides comunes (CMPS, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcγR más altas / -) dan lugar a los CDP (lin - c-kit lo CD115 + FIt3 +), which diferenciar aún más en los países en desarrollo y PDC convencionales (CDC) de 9,10. Por el contrario, de Flt3 + progenitores linfoides comunes (CLPS, lin - IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) se desarrollan principalmente en PDC 11. Por lo tanto, los estudios anteriores indican PDC surgen de, al menos, 2 poblaciones progenitoras hematopoyéticas distintas en el marco de la regulación de Flt3L, aunque el análisis típico se ha limitado a la médula ósea, el bazo y / o subconjuntos PDC sangre. Por lo tanto, la población (s) progenitor que genera PP PDC requiere investigación. La comprensión de los orígenes del PP PDC arrojará luz sobre si comparten vías de desarrollo comunes con otras poblaciones PDC, o utilizar mecanismos distintos durante su generación en el PP. Una ventaja única del enfoque descrito en el presente documento es el uso de ratones que muestran una deficiencia grave en PP PDC como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas. Los ratones con el gensupresión de tic en el gen que codifica IFNAR1 (IFNAR - / - ratones) o STAT1 (Stat1 - / -) reveló un agotamiento sorprendente en PP PDC 5. Por lo tanto, estas cepas proporcionan un entorno en el cual se reducen PDC PP, lo que permite estudios de transferencia adoptiva que se realizaron en ausencia de los regímenes de ablación celular potentes tales como la irradiación letal. Una fuerza adicional del método presentado aquí es el uso de la transferencia génica hidrodinámica (HGT) para estimular cantidades circulantes elevados de Flt3L. Esto proporciona un enfoque rentable para inducir Flt3L in vivo, en comparación con la inyección de la proteína recombinante. Numerosos estudios, incluyendo aquellos en nuestro laboratorio, han empleado HGT para inducir cantidades de citoquinas en una variedad de condiciones experimentales 5,12,13. La división del trabajo y las funciones inmunológicas precisas para los países en desarrollo es de gran interés en la inmunología. En particular, el PDC son importantes mediadores de la tolerancia oral y anti-viral sistémicarespuestas, sin embargo, también parecen contribuir al desarrollo y persistencia de la autoinmunidad y el cáncer de 14-17. El protocolo se describe en este documento permitirá a los mecanismos de desarrollo que regulan PP PDC para ser más plenamente exploradas. Además, este enfoque puede permitir que los estudios para evaluar la función PP pDC, y puede ser extendida a la comprensión de la regulación y la función de otras poblaciones inmunes dentro de los PP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<colgroup>
		<col />
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	<tbody>
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			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">664</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">B6.SJL</td>
			<td style="width:201px;">JAX</td>
			<td style="width:177px;">2014</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RPMI</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">11875-093</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352095</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352070</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile surgical tweezers</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile small pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sterile large pair scissors</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352340</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">352235</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RBC lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">R7757</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:260px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Percoll</td>
			<td style="width:201px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:177px;">17089102</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10XHBSS</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4641</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:201px;">Worthington</td>
			<td style="width:177px;">LS004188</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Goat ant-rat IgG microbeads</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-048-501</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LD column</td>
			<td style="width:201px;">Milteyni Biotec</td>
			<td style="width:177px;">130-042-901</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-D3</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">555273</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD19</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553783</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11b</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553308</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-CD11c</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553799</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rat anti-Ter119</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">553671</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD3 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0031</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD19 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0193</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11b (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0112</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-F4/80 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-4801</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Ter119 (PerCP)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">45-5921</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Sca-1 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-5981</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD115 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">17-1152</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-c-kit (APC.Cy7)&#160;</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">47-1171</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-1271</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Flt3 (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-1351</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.1 (APC.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;">560579</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD45.2 (PE.Cy7)</td>
			<td style="width:201px;">Biolegend</td>
			<td style="width:177px;">109830</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-CD11c (Pacific Blue)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">48-0114</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-B220 (APC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">25-0452</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-Siglec-H (PE)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">12-0333</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Anti-PDCA-1 (FITC)</td>
			<td style="width:201px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:177px;">Nov-72</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:201px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;">e.g. BD Fortessa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heat lamp</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">309602</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">27&#189; G needles (sterile)</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:177px;">305109</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the development of murine plasmacytoid dendritic cells in peyer's patches using adoptive transfer of hematopoietic progenitors

Este protocolo detalla un método para analizar la capacidad de progenitores hematopoyéticos purificados para generar células dendríticas plasmacitoides (PDC) en el parche de Peyer del intestino (PP). Progenitores de células dendríticas comunes (LDC, lin - c-kit Lo CD115 + de Flt3 +) se purificaron a partir de la médula ósea de ratones C57BL6 por FACS y se transfirieron a ratones receptores que carecen de una población significativa PDC en PP, en este caso, IFNAR - / - los ratones se usaron como los destinatarios de transferencia. En algunos ratones, la sobreexpresión del ligando de Flt3 factor de crecimiento de células dendríticas (Flt3L) se aplica antes de la transferencia adoptiva de los CDP, usando la transferencia de genes hidrodinámico (HGT) de plásmido Flt3L-codificación. Flt3L sobreexpresión expande poblaciones de DC procedentes de transferidos (o endógenos) progenitores hematopoyéticos. A los 7-10 días después de la transferencia progenitor, PDC que surgen de los progenitores de forma adoptiva transferidos se distinguen de las células receptoras de labase de la expresión del marcador CD45, con PDC de los CDP transferidos siendo CD45.1 + y ser receptores CD45.2 +. La capacidad de los CDP transferidos a contribuir a la población PDC en PP y para responder a Flt3L se evaluó por citometría de flujo de PP suspensiones de células individuales de los ratones receptores. Este método puede ser usado para probar si otras poblaciones progenitoras son capaces de generar PP PDC. Además, este enfoque podría utilizarse para examinar el papel de los factores que se predice que afectan el desarrollo PDC en PP, mediante la transferencia de subconjuntos progenitoras con una caída apropiada, nocaut o sobreexpresión del factor de desarrollo putativo y / o mediante la manipulación de citocinas circulantes a través de HGT . Este método también puede permitir el análisis de cómo PDC PP afectan a la frecuencia o la función de otros subconjuntos inmunes en PP. Una característica única de este método es el uso de IFNAR - / - ratones, que muestran severamente reducida PP PDC en relación con los animales de tipo salvaje, por lo tanto allowing reconstitución de PP PDC en la ausencia de efectos de confusión de la irradiación letal.

Nuestros resultados muestran la estrategia de activación periódica para el aislamiento de los CDP a partir de células de médula ósea de ratón (Figura 1), como se detalla en los Protocolos 2 y 3. CDP comprenden aproximadamente el 0,1% del total de células de la médula ósea, y aproximadamente 4-6 x 10 4 CDP pueden ser aislados de un ratón. Tras la transferencia adoptiva, CDP se diferencian en PDC y CDC 10. <i...

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Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

11.1K vistas.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer. 

Video: Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

La metástasis experimentales y CTL Modelo inmunoterapia adoptiva de transferencia de ratón

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...