Damos las gracias a la canción Renjie (Wadsworth Center Flow Core Citometría) para la asistencia en el análisis celular y Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopatología Core) para la preparación de secciones de parafina. Agradecemos al Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Center Light Microscopy Core) para obtener ayuda con la microscopía confocal y la colección de imágenes. Nos gustaría reconocer Andy Bentley (Wadsworth Photo Center y la Ilustración) para obtener ayuda con animaciones. MDJ con el apoyo de la Fundación para la Investigación Ciencias de la Vida, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA se apoya en un Wadsworth Center-Health Research Fellowship Inc. postdoctoral intramural. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH y HD061916 GM082978.

Los animales fueron alojados en virtud convencionales, libres de patógenos específicos condiciones y fueron tratados en el pleno cumplimiento de Cuidado de Animales institucional del Centro Wadsworth y el empleo directrices del Comité (IACUC). 1. Sonda oral <ol><li> (Opcional) Gavage cepa de ratón de elección con el antígeno o los microbios de interés utilizando un G-22 en x1.5. extremo romo alimentación aguja (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volúmenes de entrega no debe superar los 400 l por ratón. </li></ol> 2. Aislamiento de células de PP para Citometría de Flujo <ol><li> Eutanasiar ratones por asfixia de CO 2, según el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC). </li><li> Limpiar el abdomen con 70% de etanol o betadine antes de la cirugía. Realizar una laparotomía estándar que implica una única (1 cm) incisión utilizando tijeras quirúrgicas de grado a lo largo de la línea media principio sobre 1,5 cm de la base de la caja torácica. Exponer al porcavidad itoneal e identificar el ciego. Corta el intestino delgado terminal en la unión ileal-cecal y retire con cuidado el intestino en su totalidad. Tener cuidado de no extender demasiado el tejido intestinal a medida que se retira de la cavidad peritoneal. </li><li> Coloque el intestino delgado en una cama de toallas de papel húmedas o Kimwipes. Mojar el intestino delgado suavemente con solución salina para evitar la deshidratación del tejido. Identificar visualmente PPs individuales situados en el lado anti-mesentérico del intestino (Figura 1). Típicamente, un único ratón tiene de 5 a 10 pps visibles que están distribuidas de manera uniforme desde el duodeno (proximal) de íleon (distal). En promedio, los ratones cuatro producirá 23 PP. </li><li> Uso de curvas tijeras quirúrgicas, PPS individuales suavemente sobre el consumo y los coloca en solución salina equilibrada de Hank enfriada (HBSS). Nota, las tijeras se debe colocar curva hacia arriba justo por encima del PP y luego suavemente aplicada al tejido. Impuestos Especiales únicamente el PP (no surrounding tejido) y la transferencia de HBSS fría. Nota: Todas las incubaciones y etapas de centrifugación de este punto en adelante en la Sección 2 se realizó a 4 º C para preservar la viabilidad celular. </li><li> Transferir PP en 5 ml de medio de disociación del bazo y se incuba durante 15-20 min a 37 ° C mientras vigorosamente con agitación a 250 rpm. Un mayor tiempo de incubación afectará negativamente a la viabilidad celular. </li><li> Para generar una suspensión de células individuales, los PP en un lugar estéril (esterilizado en autoclave) 70 tamiz de malla de nylon micras celular y la fuerza moler el tejido en la malla utilizando la base de un émbolo de una jeringa de 1 cc. Alternativamente, los PP sándwich entre dos helados estériles portaobjetos de vidrio de microscopio (en autoclave en sobres) y moler suavemente los tejidos con un movimiento de ida y vuelta. Utilizar una pipeta de transferencia estéril para transferir la suspensión de células en un tubo de 5 ml Falcon. </li><li> Añadir EDTA a una concentración final de 1 mM a la suspensión celular. Incubar en un agitador para5 min a temperatura ambiente. </li><li> Decantar suspensión celular a través de un segundo filtro de células 70 micras para eliminar cualquier agregado restantes celulares o restos de tejidos. Recoger las células en un tubo de 15 o 50 ml cónico. </li><li> Células sujeto a centrifugación suave (5 min a 500 xg). Decantar el sobrenadante y resuspender las células en tampón de flujo, que es solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de suero fetal de ternera (FCS). </li><li> Para determinar el número de células y la viabilidad, se diluye 1:10 en células con azul de tripano y una inspección visual de las células utilizando un microscopio de luz y un hemocitómetro. Alternativamente, un contador de células condesa (Invitrogen) o instrumento similar se puede utilizar para enumerar automáticamente el número de células y la viabilidad. A partir de 20-25 PP, este protocolo debe ceder&gt; 2,5 x 10 6 células totales. Esto equivale a ~ 0.8-1.2 × 10 6 células por ratón. </li></ol> Etiquetado Anticuerpos de las células para citometría de flujo &lt;inicio ol = &quot;11&quot;&gt; <li> Dispensar células (10 5 por pocillo) en pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. </li><li> Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg), y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa. </li><li> Resuspender las células en tampón de bloqueo Fc e incubar en hielo durante 15 min. Mientras que hay un número de buffers de bloque disponibles comercialmente Fc (por ejemplo de rata anti-ratón CD16/CD32, BD Biosciences), simplemente usamos medio gastado de una rata B de células de hibridoma (ATCC 2.4.G2) que secreta un anticuerpo monoclonal murino IgG 1 contra Fc gamma receptores para este paso. </li><li> Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg) como anteriormente, y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa. </li><li> Añadir fluoróforo anticuerpos conjugados directamente a las suspensiones de células a dilución deseada, e incubar en hielo durante 30 min con agitación continua. </li><li> Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg), y decantarsobrenadante invirtiendo suavemente la placa. </li><li> Lavar las células con 100 l de tampón de flujo. </li><li> Centrifugar la placa a 1.000 xg durante 5 min, y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa. </li><li> Resuspender las células 400 l Tampón de fijación, que consiste en 300 l de tampón de flujo y 100 l de 1% de paraformaldehído en tampón PHEM (60 mM TUBOS, HEPES 25 mM, EGTA 10 mM, 4 mM de MgCl 2 a pH 6). </li><li> Células sometidas a citometría de flujo utilizando un FACSCalibur o equivalente. Analizar los resultados utilizando Cell Quest Pro versión de software 5.2. </li></ol> 3. Preparación de criosecciones PP <ol><li> Antes de la recogida de tejidos, añada una temperatura óptima de corte (OCT) compuesto a base de moldes 7x7x5 mm de plástico. También preparar una piscina de nitrógeno líquido (&gt; 750 ml) en un cubo dewar o hielo. </li><li> La eutanasia del ratón y realizar un laparotamy, como se describió anteriormente. Retire intestino y el lugar en toallas de papel húmedas. </li><li> Aaislar PPs para cyrosectioning, cortar segmentos de 0,5 cm transversales del intestino delgado que contienen un único PP y transferencia de tejido a una placa de Petri que contiene PBS. Enjuague suavemente el lumen de estos segmentos con PBS para eliminar los desechos fecales no deseado. </li><li> Coloque los segmentos intestinales tejido verticalmente dentro de moldes de base que contienen octubre Sumergir los moldes en nitrógeno líquido y permitir que el tejido para congelar completamente (1-2 min). El color de la OCT cambia de transparente a blanco cuando el tejido está completamente congelado. . Para un enfriamiento más gradual (por ejemplo, para reducir el agrietamiento de la OCT), sumergir el molde en un baño de isopentano enfriado con vapores de nitrógeno líquido Nota: Utilizar gafas de seguridad apropiadas cuando se trabaja con nitrógeno líquido. </li><li> Retirar los moldes congelados de base del nitrógeno líquido utilizando fórceps y permitir que el molde se caliente a temperatura ambiente el tiempo suficiente (~ 10-15 segundos) para permitir que los bordes del bloque de octubre a ablandarse. Para eliminar entonces el bloque congelado de octubre deel molde, invierta el molde y presionar suavemente en la parte posterior para expulsar del bloque a un paño limpio 4 x 4 cm pedazo de papel de aluminio. Inmediatamente envolver el tejido en el papel de aluminio y colocarlo en una bolsa espécimen etiquetado se almacenó en nitrógeno líquido o en hielo seco. Alternativamente, la transferencia del tejido en un congelador (&lt;-20 ° C). Usa el tejido dentro de una semana, de lo contrario los bloques se vuelven frágiles con la edad. </li></ol> Cryosectioning <ol start="6"><li> Criosección el tejido utilizando una Leica CM3050S cryomicrotome o equivalente. La temperatura de la cámara en el criostato se debe establecer a -21 ° C. </li><li> Luchar por secciones que son 12-14 micras de espesor. </li><li> Recoger secciones en Fisher SuperFrost Plus (o equivalente) portaobjetos de vidrio para microscopio e inspeccionar visualmente usando un microscopio de bajo nivel luminoso de alimentación. Si hay varias secciones se están recogiendo en una diapositiva, asegúrese de que están agrupados para aplicaciones de tinción aguas abajo. </li><li> Tienda tse desliza a temperatura ambiente en una caja de diapositivas y, a ser posible, para ser utilizados dentro de unos días. </li></ol> Anticuerpo Etiquetado de criosecciones y análisis de microscopía confocal <ol start="10"><li> Sumerja los portaobjetos en acetona (o metanol) en el vaso de tejido teñido o bastidores durante 2 min. Incubación prolongada puede hacer que los tejidos se desprenda de la diapositiva. </li><li> Transferir diapositivas para tinción frasco nuevo y se lava 3 veces con PBS-T (1X PBS con 0,05% de Tween-20) durante 3 min cada uno. </li><li> Rodear las secciones con un lápiz hidrofóbico ImmEdge. Esto asegurará que los reactivos y anticuerpos permanecen confinados a esa área durante las incubaciones. </li><li> Incubar los portaobjetos en tampón de bloqueo (2% de suero de cabra en PBS) durante 30 min a 37 ° C en una cámara humidificada, protegido de la luz. </li><li> Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo Fc (véase más arriba) durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Dip diapositivas en PBS-T y la zona seca alrededor de las secciones usando Kimwipes o tejido absorbente.Tenga cuidado de no tocar las secciones de tejidos reales. </li><li> Superposición secciones de tejido con solución de anticuerpo primario y se incuba durante 30 min a 37 ° C en una cámara humidificada. El anticuerpo primario se diluye típicamente en tampón de bloqueo hasta una concentración final de 20 mg / ml. El uso de anticuerpos marcados directamente primarios es deseable, porque tanto como tres anticuerpos se pueden combinar directamente en este paso. Anticuerpos directamente marcados también eliminar la necesidad de pasos adicionales de incubación de anticuerpos. </li><li> Lavado de los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) por inmersión en PBS. </li><li> Si los portaobjetos necesarios, incube con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 30 minutos a 37 ° C en una cámara de humedad. </li><li> Lavado de los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) por inmersión en PBS. </li><li> Incubar los portaobjetos durante 4 min en 1% de paraformaldehído en tampón de PHEM, como se describió anteriormente. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS durante 1 min. </li><li> Área seca alrededor de las secciones usando Kimwipes u otro absorberent tejido. Tenga cuidado de no tocar las secciones de tejidos reales. Con una pipeta o cuentagotas, coloque suavemente una gota de oro Prolongar medio de montaje directamente en la sección. Aplicar un cubreobjetos de vidrio sobre el medio de montaje teniendo cuidado de evitar burbujas. Utilice papel secante para absorber el exceso de medio de montaje. </li><li> Seal cubreobjetos para portaobjetos de microscopio con esmalte de uñas comercial y dejar secar al aire. </li><li> Ver diapositivas con una Leica TCS SP5 o un microscopio confocal equivalente. </li></ol>

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	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. 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L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este artículo, hemos proporcionado protocolos paralelos para preparar PP preparaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo y funcional y cryosections para inmunotinción. Ambos métodos son altamente reproducible y fácilmente accesible, siempre un citómetro de flujo y el criostato están disponibles. Para los investigadores por primera vez hay que señalar que, en comparación con el bazo, los rendimientos totales de células de PP son relativamente escasos. Sin embargo, el protocolo...

Placas de Peyer (PP) son agregados macroscópicos de organizados folículos linfoides presentes en todo el intestino delgado de los seres humanos y ratones (Figura 1) y que constituyen los sitios primarios en el que respuestas inmunes mucosales son iniciadas contra antígenos de la dieta, las bacterias comensales, agentes patógenos, y vacunas orales 1-4. A diferencia de otros tejidos linfoides periféricos, tales como los ganglios linfáticos mesentéricos, PP carecen de vasos linfáticos aferentes. Como tales, las respuestas inmunes adaptativas en EPA son accionados en respuesta a antígenos derivados de la luz intestinal. La toma de muestras de antígenos luminales se lleva a cabo por el epitelio del folículo-asociado (FAE), que consta tanto de los enterocitos y células de muestreo de antígeno conocidas como células M. Debajo de la FAE, en la cúpula de sub-epitelial (SED) región, se encuentra una red de células dendríticas (DCs), entremezcladas con los macrófagos, células B, y células T CD4 + 5-9. En el núcleo de cada follicl linfoide PPe son células dendríticas foliculares (CDF) y una rica en células B del centro germinal central, flanqueado por zonas interfoliculares T rico en células. Muestreo de antígeno por los resultados de PPS en el desarrollo de IgA plasmablasts celulares + B y las células CD4 + efectoras y de memoria que la semilla de la propia lámina circundante y proporcionar inmunidad contra una amplia variedad de invasores mucosas. Disección de los eventos inmunológicos complejos asociados con el muestreo de antígeno, la elaboración y presentación de los PP es una tarea de enormes proporciones, considerando que las células PP constituyen sólo una pequeña fracción del total de células linfoides en la mucosa intestinal. Para ayudar en la caracterización in vitro de las células en este medio, se proporciona un protocolo para la preparación total de células de ratón PP para el análisis de citometría de flujo y funcionales, así como un protocolo para la preparación de PP criosecciones para microscopía de inmunofluorescencia y inmunohistología. Nuestro protocolo para el aislamiento, caracterización y inmunotinción de mouse las células del PP no es nueva en sí misma, como lo demuestra el hecho de que hay numerosas referencias datan de hace más de 25 años que citan estas técnicas 5,6,9-11. Más bien, el protocolo proporciona un aerodinámico (y visual) método para investigadores recogida PPs por primera vez. Las técnicas descritas se domina fácilmente y producir fácilmente grandes cantidades de células con&gt; 90% la viabilidad celular. El protocolo cryosectioning produce secciones en serie altamente reproducibles idealmente adecuados para la tinción de inmunofluorescencia y la imagen confocal. Por otra parte, el protocolo complementa otros dos artículos recientes Jove. El primero, por Fukuda et al, describe el uso de ensayos de ligadura del asa ileal para evaluar la absorción de las bacterias patógenas por células M del PP 12. La otra, por Geem y colegas, describe el aislamiento y caracterización de las DCs y macrófagos de la mucosa intestinal del ratón, pero excluye explícitamente PPs de su análisis 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artículo </td><td> Empresa </td><td> Cat. # </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Compuesto octubre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Moldes Base 7x7x5 mm </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Plus diapositivas </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Rite Edge Hoja </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratón CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ratón CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3-FITC ratón </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ratón CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD19 de ratón-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo de fenol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micras filtro de células </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Spleen medio de disociación </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc Block </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes obtenido a partir de la línea celular 2.4.G2 </td></tr><tr><td> Tijera curva </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> 3050 </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Condesa contador de células </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Starplex Científico </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y el equipo utilizados en este estudio. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

Placas de Peyer (PP) son componentes integrales de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT) y desempeñan un papel central en la vigilancia inmunológica intestinal y la homeostasis. Antígenos particulados y los microbios en el lumen intestinal son continuamente muestreados por células M del PP en el epitelio del folículo asociado (FAE) y se transporta a una red subyacente de células dendríticas (DCs), macrófagos, y linfocitos. En este artículo, se describen protocolos en la que PP murinos son (i) disociaron en suspensiones de células individuales y se sometieron a citometría de flujo y (ii) preparado para crioseccionamiento y inmunotinción. Para citometría de flujo, los PP son disociaron mecánicamente y después se filtró a través de membranas de 70 micras para generar suspensiones de células individuales libres de células epiteliales y los desechos grandes. Comenzando con 20-25 pps (de cuatro ratones), este método rápido y reproducible permite obtener una población de&gt; 2,5 x 10 6 células con&gt; 90% la viabilidad celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly aislados se sumergen en una temperatura óptima de corte (OCT) medio, snap-congelado en nitrógeno líquido, y luego seccionado utilizando un criomicrotomo. Las secciones de tejido (5-12 micras) se secan al aire, se fijaron con acetona o metanol, y después se somete a inmunomarcaje.

Análisis de citometría de flujo de suspensiones monodispersas de total de células PP revela una clara distinción entre las preparaciones de células buenas y malas. En preparaciones de células buenas relaciones con más del 80% de viabilidad, la gran mayoría de las células demostrar alta dispersión hacia adelante (FSC), un indicador de volumen celular alta, y baja dispersión lateral (SSC), un indicador de granularidad celular baja (Figura 2A). En este experimento, se preparó también intencion...

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Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K vistas.  New York State Department of Health. Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

Video: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Generación y Etiquetado de murino médula ósea procedentes de células dendríticas con nanocristales Qdot de Estudios de seguimiento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...