Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Protocolo económico y eficiente de aislamiento y generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratón. Los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Ética Animal de la Institución de la Universidad Médica de Nanjing.One.Introduction. Con el aumento en la investigación de la inmunidad tumoral, la demanda de células DC está aumentando gradualmente.

Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional de inducir principalmente la diferenciación de la médula ósea en DC es complicado y costoso. Dos. Aislamiento de médula ósea y preparación de células BM Sacrificamos ratones y fijamos en mesa de operaciones de ratón.

Cortar la piel de los músculos expuestos a la izquierda y la arteria femoral. No corte la arteria femoral directamente. De lo contrario, causará sangrado abundante y contaminará el campo de visión.

Corte todos los músculos alrededor del fémur. Estirar lentamente las extremidades inferiores del ratón hacia afuera hasta el prolapso de la cabeza femoral y se puede observar. Separe las extremidades inferiores del cuerpo.

Cortar la pata trasera para obtener un fémur libre y completo. Retire los músculos con una gasa. No rasgue los músculos directamente.

El fémur de los ratones es frágil. Coloque el fémur en alcohol al 75% durante dos a cinco minutos. Tres. Cultivo de inyección de BMDC Enjuague el alcohol residual con PBS.

Sujete la parte media e inferior del fémur con pinzas hemostáticas, y pince el extremo inferior del fémur con otras pinzas hemostáticas. Las pinzas hemostáticas se aplican literalmente al fémur y el fémur se rompe por la línea epifisaria. Use una jeringa de ml para perforar la cavidad de la médula ósea desde la línea epifisaria.

Use un medio completo de dos partes que enjuaguen la cavidad de la médula ósea hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger los líquidos de lavado. Suplementando el medio completo que contiene GM CSF / IL-4 a 24 ml, y la semilla en una placa de 6 pocillos con 4 ml por pocillo. Cuatro.Resultados.

Después de dos días, reemplace todo el medio que contenga GM-CSF/IL-4. La mitad reemplazó el medio completo que contenía GM-CSF/IL-4, en el cuarto, sexto y octavo día. El número de células alcanzó un pico en el séptimo día y luego disminuyó gradualmente.

Las células DC formaron un gran número de sinapsis mostrando una morfología típica de células DC maduras. Los análisis submétricos de flujo muestran que la relación de CD11c impuso lo que el 71% en el sexto día, el aumento de la relación amplia al 96,1% en el día 10. La expresión de CD11c, CD80 y MSC2, aumentó gradualmente con el aumento del tiempo de cultivo. Cinco.Conclusión.

En resumen, establecimos un protocolo económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratones, que solo toma 10 minutos para separar las células de la médula ósea. Se cosechó un alto número de DC de alta pureza después de seis a siete días de cultivo con 10 ng por ml, GM-CSF e IL-4.