Apoyo financiero a VECT-HORUS se reconoce desde el Fonds Único Interministerial (FUI proyecto / MEDUL) y para Vect-HORUS y el laboratorio UMR7259 de la Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC y proyectos de colaboración PREVENTAD) . El laboratorio UMR7259 también reconoce el apoyo financiero del CNRS y de la Universidad Aix-Marseille.

1. Producción de rata astrocitos Para cada preparación utilice 10 ratas Wistar recién nacidos de ambos sexos. <ol><li> Sacrificar las ratas cortando cabezas con un par de tijeras y transferirlas de inmediato en un plato de Petri seca bajo una campana de flujo laminar. Eliminar los cerebros del cráneo sin el cerebelo y transferirlos inmediatamente en una placa de Petri que contenía tampón de disección en frío: HBSS suplementado con 1% albúmina de suero bovino (BSA bajo nivel de endotoxina), penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 mg / ml. </li><li> Cortar los cerebros en un medio, para separar los 2 hemisferios cerebrales y transferirlos a una placa de Petri limpia con tampón de disección sobre hielo. Cortar el nervio óptico y eliminar las meninges bajo un microscopio estereoscópico. </li><li> Lavar las piezas corticales extensamente en 50 ml de tampón de disección en frío. </li><li> Coloque los trozos de corteza de 3 cerebros en un tubo Falcon de 15 ml y disociar la pipeta hacia arriba y hacia abajo de un golpele de veces con una pipeta desechable de 10 ml equipado con una punta azul en 6 ml de tripsina 0,05% - EDTA 0,02% durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 24 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y los siguientes antibióticos, penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 g / ml, un medio llamado medio de células gliales (GCM), y centrifugar a 300 xg durante 5 min a TA. Se seleccionaron lotes de FBS y validados para el crecimiento y la supervivencia de cutures de astrocitos. </li><li> Resuspender el sedimento que contenía las células disociadas en 10 ml GCM y la placa en un 75 cm 2 matraz T (T75). Cambie el medio del día siguiente para eliminar los restos celulares y el ADN. Vuelva a colocar los medios de cultivo dos veces por semana. </li><li> Después de 1 semana de la proliferación, agite suavemente las células gliales con un agitador orbital a 60 rpm durante 24 horas a 37 ° C en el GCM. Si el T75 no puede ser colocado en una incubadora con 5% de CO 2/95% de aire a 37 ° C atmósfera humidificada, complementar los medios de comunicación con HEPES 5 mM. Lavar las células dos veces para rquítelo las células microgliales no adherentes. </li><li> Tres semanas después de la siembra, se lavan las células dos veces con DPBS sin calcio y magnesio. Añadir 3 ml de tripsina cálida 0,05%-EDTA 0,02%, se incuba a 37 ° C y espere hasta que la capa de células se dispersa (por lo general 5 min). Inhibir la actividad de la tripsina añadiendo 10 ml de GCM, transferir la suspensión de células en un tubo Falcon de 15 ml y centrifugar a 120 xg durante 8 minutos. </li><li> Resuspender el pellet de astrocitos en el 90% de SFB - 10% de DMSO, transferirlos a crioviales (2 x 10 6 células por criovial) y almacenar en nitrógeno líquido. </li></ol> 2. Aislamiento de cerebro de rata Microvasos Nuestros procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Marsella y se ajustan a las normas nacionales y europeas (directiva de la UE N º 86/609). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados. <ol><li> Para cada preparación y para una Experimenter, use de 3 cinco semanas de edad ratas Wistar. </li><li> Lunes de la primera semana, preparar 2 matraces T75 mediante el recubrimiento con colágeno de tipo IV y fibronectina, tanto a 1 g / cm 2 en el agua de cultivo estéril (10 ml por T75). Permitir a adherirse a 37 ° C hasta que la siembra de los microvasos. </li><li> La mañana del miércoles de la primera semana, la eutanasia a las ratas bajo un flujo cada vez mayor de CO 2 para inducir somnolencia, pérdida de la postura y la interrupción de la respiración, a continuación, seguido por una dislocación cervical. Rocíe las cabezas con etanol al 70%. Cortar las cabezas con un par de tijeras y transferirlos a un plato de Petri seca bajo una campana de flujo laminar. </li><li> Eliminar los cerebros del cráneo sin el cerebelo y los nervios ópticos, a continuación, transferirlos a una placa de Petri enfriada en hielo y se llena con tampón de disección en frío (HBSS suplementado con 1% de BSA, penicilina 100 unidades / ml y estreptomicina 100 g / ml) . </li><li> Cortar los cerebros en medio para separar los 2 hemisferios cerebrales y el cerebro medio separado del deEbrain. Transfiera los prosencéfalos en una placa de Petri limpia en el hielo con tampón de disección. </li><li> Tomar un par de hemisferios en una nueva placa de Petri con tampón de disección fría para quitar cuidadosamente las meninges de los prosencéfalos bajo un microscopio estereoscópico con N ° 5 pinzas curvas. Luego, limpiar el interior del cerebro para eliminar el edredón de la mielina y obtener una cáscara de la corteza. Estos pasos no deben tomar más de 2 horas para la conservación de tejidos y la supervivencia celular. </li><li> Disociar la corteza de 3 cerebros en 6 ml de tampón de disección en frío en un homogeneizador Dounce de 7 ml por 10 golpes arriba y abajo con cada uno de 2 manos de mortero de diferentes autorizaciones, 71 micras seguido de 20 micras. </li><li> Divida la suspensión para obtener el equivalente de 1 corteza en 1 ml de un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Se digiere la suspensión de 1 corteza con 1 ml de una solución enzimática que contiene una mezcla de colagenasas / dispasa (60 g / ml de R11; 0,3 U / ml), Tipo de DNasa I (35 g / ml - 20 K unidades / ml) y gentamicina (50 mg / ml) en un agitador durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Mezclar el 1 digest ml de 1 corteza con 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X y separada por centrifugación dependiente de la densidad a 3.600 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente el disco superior (mielina y el cerebro parénquima) y el sobrenadante a un tubo Falcon de 50 ml limpio y repetir la centrifugación. Mantenga el sedimento resultante contiene los microvasos cerebrales a 4 ° C. </li><li> Desechar con cuidado el disco superior y el sobrenadante. Resuspender ambos gránulos resultantes que contienen los microvasos cerebrales con 1 ml de HBSS frío 1X y transferir a un tubo Falcon de 50 ml limpio. </li><li> Lavar los microvasos mediante la adición de 20 ml de HBSS frío 1X y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Además digerir los microvasos de 1 corteza con 1 ml de la misma solución enzimática como se describe en el paso 2.9 durante 1 hora a 37 ° C en un SHaker. </li><li> A continuación, mezclar los microvasos digeridos de cada uno de los 3 cortezas en un tubo y separar aún más en dos tubos Falcon de 50 ml para obtener extraídos de microvasos el equivalente de uno y medio (1.5) de la corteza por tubo. Añadir 30 ml de tampón de disección en frío y centrifugar a 1000 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender el sedimento de microvasos en 10 ml de DMEM/F12 complementado con 20% de plaquetas bovina plasma pobre en suero derivado, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 2 ng / ml), heparina (100 mg / ml), gentamicina (50 mg / ml) y HEPES (2,5 mM), llamado medio celular endotelial (ECM) suplementado con puromicina a 4 g / ml. </li><li> Tome los frascos T75 recubiertos 2 de la incubadora, aspirar el exceso de recubrimiento y placa los microvasos de cada tubo en un frasco T75 (microvasos extraídos de 1,5 corteza por matraz T75). </li></ol> 3. Purificación y proliferación de la Dirección Regional Primocultures <ol><li> Purificación: de miércoles a viernes, añadir puromycin a 4 g / ml a los medios de cultivo. Cambie el medio el jueves. El viernes, se lavan las células y añadir puromicina a 2 mg / ml hasta el lunes. </li><li> Proliferación: el lunes de la segunda semana, se lavan las células y añadir insulina, transferrina y suplemento selenita de sodio al medio de cultivo hasta que los cultivos alcanzan el 90% de confluencia el miércoles de la segunda semana. </li></ol> . 4 Diferenciación: Configurar el modelo in vitro acreditación <ol><li> Lunes de la segunda semana, preparar filtros (polietileno, 12 pozos, de tamaño de poro 1,0 m) por recubrimiento con una mezcla de colágeno tipo IV y fibronectina tanto en 0.5μg/cm 2 en el agua de cultivo estéril (500 l de mezcla en el compartimiento superior y 1,5 ml de agua de cultivo estéril en el compartimiento inferior). Deje que se adhieran a 37 ° C hasta que la Dirección Regional de la siembra. </li><li> Lunes de la segunda semana, cinco días antes de que el establecimiento de la co-cultura, descongele los astrocitos de crioviales a 37 ° C y la transferenciaen un Falcon de 15 ml con 10 ml GCM. Centrifugar la suspensión a 120 xg durante 8 minutos a TA. </li><li> Resuspender el pellet de astrocitos en GCM y la placa a una densidad de 30 x 10 3 células por cm 2 en placas de 12 pocillos. </li><li> Miércoles de la segunda semana, justo antes de la disociación de la Dirección Regional con tripsina, lavar dos veces el filtro pre-recubierto con medio DMEM/F12. Pre-llenar las cámaras con ECM: 1,5 ml en el compartimiento inferior y 0,5 ml en el compartimento superior. </li><li> Miércoles de la segunda semana, lavar dos veces la Dirección Regional con DPBS sin calcio y magnesio. Añadir 4 ml de tripsina cálida 0,05% - EDTA 0,02% de solución a 37 ° C por matraz T75 durante 30 segundos exactamente. Luego quite 3,5 ml de solución de tripsina y observar bajo el microscopio. Cuando la capa de células comienza a separarse de la matriz, ayudar a ellos golpeando suavemente el borde del matraz T75 hasta que todas las células están flotando. </li><li> Añadir 9 ml de ECM por matraz T75 y transferir a un tubo Falcon de 15 ml. Muy disociar suavemente la célulasuspensión pipeteando arriba y abajo 4 veces con una pipeta de 10 ml equipado con una punta amarilla (evitar la producción de burbujas en la solución). Contar las células en la suspensión (aproximadamente 3 x 10 6 cells/T75) y la placa inmediatamente en filtros de pre-revestidos y precargadas a una densidad alta (160 x 10 células de 3 / filtro, por tanto, aproximadamente 18 filters/T75) (Figura 8 ). El día siguiente (jueves), cambie dos veces el medio del compartimiento superior para eliminar los residuos celulares. </li><li> Jueves de la segunda semana, el día antes de la creación del co-cultivo, sustituir el medio de cultivo de astrocitos en 1,5 ml de medio de diferenciación (ECM con hidrocortisona a 500 nm), que se pueden complementar con 1/3 medio del compartimento basal acondicionado de un co-cultivo anterior (3 días de contacto entre las células endoteliales y astrocitos). </li><li> Viernes de la segunda semana se define como el día 0 de la diferenciación; reemplazar el medio de cultivo de la conta filtrosnando la Dirección Regional con medio de diferenciación. Transfiera los filtros DRECEI en los pocillos que contienen los astrocitos. En estas condiciones, los modelos in vitro se diferencian y expresan proteínas relacionadas de unión-plazo de 3 días. </li><li> Los modelos mantienen su diferenciación óptima durante 3 días más, entre el lunes y el miércoles de la tercera semana. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Muchos medicamentos desarrollados para el tratamiento de Sistema Nervioso Central (SNC) no son capaces de llegar al parénquima cerebral en concentraciones terapéuticamente relevantes. La acreditación protege el tejido nervioso cerebral de la fluctuación de la composición del plasma, de los agentes patógenos, y mantiene la homeostasis del parénquima cerebral mediante la restricción de flujo no específica de iones, péptidos, proteínas e incluso las células dentro y fuera del cerebro 1. Características de BBB son inducidos y mantenidos por la proximidad íntima y la diafonía entre las células endoteliales de microvasos cerebro clase especializada y elementos vecinos de la unidad de neuro-glia-vascular (NGVU) tales como neuronas, células gliales (más precisamente astrocito END-pies), y pericitos ensheathed en la membrana basal, que se compone principalmente de colágeno de tipo IV, fibronectina, laminina y proteoglicanos 2,3. Los pericitos cubren aproximadamente el 22 - 32% del endotelio en el nivel capilar y juegan un importantepapel en la regulación de la proliferación endotelial, la angiogénesis y procesos inflamatorios. Las células endoteliales forman una hoja continua que cubre la superficie interior de los capilares. Ellos están interconectados por TJs, que forman una estructura semejante a una correa en la región apical y que contribuyen a la celda de polarización. Los astrocitos regulan de BBB propiedades y son fuentes de factores reguladores importantes tales como el TGF-β, GDNF, bFGF e IL-6. Los astrocitos deficientes en GFAP con funcionalidad incompleta no son capaces de regular de BBB propiedades 4. Las neuronas no están directamente involucrados estructuralmente en la formación de la BBB, pero también regulan aspectos importantes de la expresión de la proteína y BBB funciones 5. Con el fin de estudiar más a fondo la estructura, fisiología y patología de la BBB, los modelos in vitro de la BBB se desarrollaron como herramientas de investigación. Células endoteliales de cerebro se han extraído de diversas especies de implementar en modelos de BBB in vitro basadoen cultivos de paso bajo las primarias de las especies bovina, porcina 6,7 8,9, 10,11,12 rata, ratón 13 y también humanos 14,15. Se sabe que estos modelos a imitar la acreditación in vivo, particularmente cuando se co-cultivaron con células gliales de rata o murino y / o pericitos 16,12, y / o los astrocitos derivados de células progenitoras neurales 17 y / o neuronas 18. Los modelos de laboratorio &quot;en&quot; a menudo se producen a partir de roedores, ya que permiten in vitro / in vivo en experimentos y comparaciones y / o el estudio de las células endoteliales del cerebro producidos a partir de modelos transgénicos 19. De nuevo desarrollo de modelos in vitro BBB también han sido diseñadas para ayudar a predecir la captación cerebral de los posibles candidatos a fármacos del SNC antes de la prueba in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modelos in vitro de BBB se utilizan generalmente para comparar el transporte de fármacos con: i) la penetración conocido en el SNC o con lOW permeabilidad a través de la acreditación y no hay efectos centrales, y ii) la aparente Pe de los mismos medicamentos medidos en modelos animales de la misma especie. Los fármacos que pasan fácilmente la acreditación son en su mayoría lipófilo y cruzan las membranas celulares endoteliales del cerebro por mediada por lípidos difusión libre (cafeína, carbamazepina, etc.) Los medicamentos transportados negativamente, tal como digoxina, verapamilo o la ciclosporina A se extruyen de forma activa por transportadores de salida endoteliales del cerebro tales como la P-gp. Sin embargo, muchas de las moléculas terapéuticas de nuevo desarrollo son productos biofarmacéuticos, tales como proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales o siRNAs. La mayoría de ellos no cruzan la BBB debido a: i) la ausencia de transportadores específicos, y ii) la capa apretada de las células endoteliales, que impiden que las moléculas de alto peso molecular a partir de someterse a paso paracelular. Con estos límites, las estrategias de &quot;caballo de Troya&quot; han sido implementados utilizando vectores (anticuerpos, péptidos) contra los receptores conocidos en el BBB, involucrados in mediada por el receptor de transporte o transcitosis (RMT), tales como la transferrina (Tf) del receptor (TfR), el receptor de insulina (IR), o miembros de la del receptor de LDL (LDLR) relacionados con la familia del receptor (LDLR, LRP1). Tales receptores se han encontrado en aislados capilares del cerebro y en la acreditación in vivo 24,25. Los perfiles de transcripción para estos receptores, en particular los de la familia LDLR, se analizaron y se compararon entre las células endoteliales cerebrales y células endoteliales de cerebro co-cultivadas con astrocitos o en los capilares cerebrales directamente después de su extracción a partir de cerebro 26. Pardridge 24 abrió el campo con el anticuerpo OX-26 contra el receptor de transferrina (TfR), seguido por anticuerpos contra el receptor de la insulina y el receptor del factor de crecimiento de insulina 27,28. Con estos vectores basados ​​en anticuerpos, ArmaGen Technologies ha desarrollado una tecnología de plataforma Trojan horse molecular acreditación para entregar las drogas, incluyendo las proteínas, a través de la acreditación 29. Lala literatura es rica en datos que muestran la expresión de LRP1 en las células endoteliales del cerebro y su papel como receptor endocítica / carroñero potente. Análisis de transferencia Western sugirió que LRP1 se expresa en fracciones enriquecidas en los capilares del cerebro y en las células endoteliales capilares de cerebro de rata 30. Empresas como Angiochem LRP1 objetivo con vectores de péptidos derivados de la aprotinina que promueven la afluencia de drogas eficientes a través de la acreditación 31. Sin embargo, LRP1 también está involucrado en el transporte activo de Aß y su flujo de salida / autorización de parénquima cerebral a la sangre 32. Estos datos implican LRP1 en un transporte bidireccional través de la BBB en función de sus ligandos. biOasis desarrolla la tecnología de Transcend usando un melanotransferrina proteína para el transporte de productos biológicos, tales como enzimas lisosomales y anticuerpos través de la bbb 33 mientras VECT-HORUS desarrolla vectores de péptidos que se dirigen a la LDLR 34. No se sugiere que los datos de la PRL y LDLR se pueden utilizar para el transporte de difErent moléculas tales como enzimas lisosomales 35,36 o complejos de nanopartículas través de la bbb 37. Nuestro campo de interés es la administración de fármacos para el SNC usando moléculas de vector y vectorizadas de drogas-candidatos para el tratamiento de enfermedades del SNC. En particular, la administración de fármacos a través de la acreditación tiene que ser considerado en el contexto de la neuroinflamación, un proceso que puede variar en su extensión, pero que es probablemente común a todas las lesiones y enfermedades del SNC, incluyendo la encefalitis, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, etc neuroinflamación se asocia con la acreditación inflamación y potencialmente con los cambios en la fisiología de la acreditación y la permeabilidad paracelular y teniendo en cuenta que el transporte transcelular se pueden amplificar en condiciones patológicas 38,39,40,41,42,43. Por ejemplo, el TNF-α, ajustar, y otras citoquinas modulan la inflamación, y los experimentos con modelos in vitro en BHE han demostrado que pueden alterar las propiedades paracelulares de the monocapa de células endoteliales 38,39,40 y que el TNF-α también conduce a un aumento en el transporte transcelular de las LDL 41, holotransferrin 42 y lactoferrina 43. Nuestro objetivo era desarrollar y caracterizar un optimizado y singénico de rata altamente reproducible acreditación modelo utilizando co-cultivos de células endoteliales cerebrales primarios y astrocitos. Utilizamos 5 semanas de edad y neonatales de ratas Wistar para la producción de las células endoteliales del cerebro y la producción de astrocitos, respectivamente. Un desafío fue establecer un protocolo que permite la producción de modelos BBB &quot;semanal reproducibles&quot;. Para alcanzar este objetivo, se llevó a cabo todos los pasos del protocolo de producción en días fijos de la semana, a partir de la producción de los microvasos cerebro el miércoles de la primera semana. Las disecciones se realizaron casi todas las semanas en los últimos 3 años. Para mejorar aún más la reproducibilidad de las culturas, se estableció un sistema de aseguramiento de la calidad. Todo reagents y productos químicos fueron referenciados en una base de datos (fecha de entrada, existencias, plazo de caducidad, etc.) El modelo se caracteriza después de un número de criterios, tales como la organización de las células endoteliales y la pureza, la TEER, LY permeabilidad, respuesta a agentes pro-inflamatorias, la expresión cualitativa y cuantitativa de las proteínas TJ, la funcionalidad de los transportadores de flujo de salida, tales como la P-gp, y receptores involucrado en la transcitosis a través de la monocapa de células endoteliales tales como el TfR o el LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

La barrera hematoencefálica (BBB) ​​regula específicamente flujo molecular y celular entre la sangre y el tejido nervioso. Nuestro objetivo era desarrollar y caracterizar una singénico de rata altamente reproducible modelo in vitro de la BBB usando co-cultivos de células endoteliales de cerebro de rata primarios (DRECEI) y astrocitos para estudiar los receptores implicados en la transcitosis a través de la monocapa de células endoteliales. Los astrocitos fueron aislados por disección mecánica después de la digestión con tripsina y se congelaron durante el co-cultivo posterior. DRECEI se aislaron a partir de cortezas de rata 5 semanas de edad. Los cerebros se limpiaron de meninges y la sustancia blanca, y se disociaron mecánicamente después de la digestión enzimática. A partir de entonces, el homogeneizado de tejido se centrifugó en albúmina de suero bovino para separar fragmentos de vasijas a partir de tejido nervioso. Los fragmentos de vasijas fueron sometidos a una segunda digestión enzimática de las células endoteliales gratuitas de su matriz extracelular. Las células contaminantes restantes, tales como pericitos fueron fás eliminado mediante siembra de los fragmentos de microvasos en medio que contenía puromicina. Luego se pasaron sobre filtros de co-cultivo con astrocitos cultivados en el fondo de los pocillos. DRECEI expresa altos niveles de unión estrecha (TJ) proteínas tales como ocludina, claudina-5 y ZO-1 con una localización típica en los bordes de la celda. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de las monocapas endoteliales del cerebro, lo que indica la estanqueidad de TJs alcanzó 300 ohmios · cm 2 en promedio. Los coeficientes de permeabilidad endotelial (PE) para lucifer amarillo (LY) fue altamente reproducible con una media de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Las células endoteliales del cerebro organizados en monocapas expresaron la eflujo transportador de la P-glicoproteína (P-gp), mostraron un transporte polarizado de rodamina 123, un ligando de la P-gp, y mostraron el transporte específico de transferrina-Cy3 y DiILDL través de la monocapa de células endoteliales. En conclusión, le ofrecemos un protocolo para la creación de un in vitroAcreditación modelo que es altamente reproducible debido a los métodos de control de calidad, y que sea adecuado para la investigación sobre de BBB transportadores y receptores.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.2K vistas.  VECT-HORUS SAS.  El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores. 

Video: Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Resonancia magnética guiada por disrupción de la barrera sangre-cerebro con ultrasonido transcraneal Enfocado en un modelo de rata

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Investigación

Medicina

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como<em&gt; In Vitro</em&gt; Lesión cerebral traumática Modelo de la barrera hematoencefálica

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Carrera

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Oxígeno-Glucosa Privación y Reoxigenación como<em&gt; In Vitro</em&gt; La isquemia-reperfusión modelo para el estudio de la disfunción barrera hematoencefálica

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

Una rata carótida lesión con el balón modelo para probar Terapéutica Remodelación Anti-vasculares

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...