Este trabajo fue financiado por los EE.UU. Fundación de Fibrosis Quística (CFF) a través de su estructura Consorcio CFTR 3D. TR fue financiado por una beca Unido CF Trust, y Carolina del Norte por una beca Unido BBSRC. Reconocemos a nuestros colegas en la estructura de consorcio CFF CFTR 3D por su ayuda y asesoramiento y para el diseño de las secuencias CFTR pollo y purificación de las etiquetas de codones optimizados.

1. Preparación de Buffers <ol><li> Para hacer el caldo 100x del inhibidor de la proteasa (PI) cóctel disolver 96 mg AEBSF, 3,5 mg quimostatina, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptina, pepstatina 16,5 mg, 348 mg de PMSF, y 4 mg bestatina en 20 ml de DMSO. Hacer alícuotas de 1 ml y almacenar a -20 ° C. Para hacer un balance de 100x benzamidina, disolver 720 mg en 20 ml de agua ultrapura (ddH 2 O) y almacenar en alícuotas de 1 ml a -20 ° C. Esta cantidad es suficiente para una purificación. En todos los tampones, las existencias de PI y benzamidina se utilizan en una dilución de 1:100. </li><li> Preparar &#39;MPIB&#39; (0,3 M Tris, pH 8, 0,3 M de sacarosa, DTT 2 mM) y &#39;CFTR&#39; (50 mM Tris pH 8, 20% (/ v) de glicerol v, 1 mM de DTT) tampones y el enfriamiento a 4 ° C . Antes de su uso, añadir 1:100 del cóctel inhibidor de la proteasa y 1:100 de benzamidina de acuerdo con el volumen de MPIB utiliza para resuspender el sedimento de células (por ejemplo, utilizar 3,5 ml de PI y 3,5 ml de benzamidina en un volumen total de 350 ml MPIB). </li><li> Preparar solubilization tampones. Tampón de solubilización liso-fosfatidil glicerol-14 (GLP) (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) de glicerol, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, inhibidores de la proteasa (IP) y 4% (w / v) GLP) y maltósido dodecil (DDM) tampón de solubilización (Tris 50 mM pH 8, 20% (v / v) de glicerol, NaCl 1 M, DTT 1 mM, inhibidores de la proteasa, 4% (w / v) de DDM). Buffer puede sonicó en un baño de ultrasonidos (35 W, 40 kHz) para ayudar en la dispersión del detergente, pero evite el vórtice de la mezcla, ya que esto crea burbujas. Enfriamiento a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Tampón de purificación de CFTR para la purificación de GLP es Tris 50 mM, 10% (v / v) de glicerol, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, 0,1% (p / v) inhibidores de GLP-14 y de la proteasa. Preparar 350 ml de este tampón, y 150 ml del mismo tampón más 1 M imidazol. Ajustar el pH de ambos buffers a 8. </li><li> El tampón para la purificación en DDM consta de 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) de glicerol, NaCl 1 M, DTT 1 mM, 0,1% (w / v) de DDM. Preparar 350 ml de este tampón y 150 ml del mismo tampón y 1 M imidazole. Ajustar el pH de ambos buffers a 8. </li><li> Para la cromatografía de permeación en gel (GPC) tampón que contiene GLP, preparar Tris 50 mM pH 8, 10% (v / v) de glicerol, NaCl 50 mM, DTT 1 mM, 0,05% (w / v) de GLP-14. Para GPC usando DDM preparar un tampón de 50 mM de Tris pH 8, 20% (v / v) de glicerol, NaCl 1 M, DTT 1 mM, 0,1% (w / v) de DDM. Todos los tampones y ddH2O utilizados en la columna de la GPC deben ser filtradas (0,2 micras filtro) y desgasificar antes de su uso. </li><li> Tampón de muestra de SDS-PAGE (2x la concentración de trabajo): 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 5% (v / v) de glicerol, EDTA 5 mM, 0,02% (w / v) de azul de bromofenol. Hacer 700 ml de alícuotas y se almacena a -20 ° C. Antes del uso, añadir 200 l de 20% (w / v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 100 l de DTT 0,5 M fresca. Incubar durante al menos 10 minutos con la muestra a temperatura ambiente antes de cargar el gel. No caliente; esto va a desnaturalizar la GFP y puede causar CFTR a agregarse. </li><li> Para hacer que las existencias de lípidos para la reconstitución, disolver un 04:01 (w / w) mezcla de E. coli lípidos unad colesterol en cloroformo y metanol (2:1 v / v), y se seca en un vial de vidrio en atmósfera de N2 gas durante 2 horas para formar una película de lípido. Añadir tampón de GPC (sin NaCl) a una concentración de lípidos de 40 mg / ml y utilizar vórtex repetida y sonicación (35 W, 40 kHz) para aclarar la solución. </li><li> Para el ensayo de ATPasa, preparar 100x existencias de los inhibidores de la ATPasa disolviendo SCH28080 a 1 mM en DMSO, NaSCN a 1 M en ddH2O y oligomicina a 2,5 mM en 100% (v / v) de etanol. Almacenar en alícuotas a -20 ° C. Hacer 100 ml de tampón de ATPasa con 50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM NH 4 Cl, 5 mM de MgSO4 y 0,02% (w / v) NaN 3. Esto se puede almacenar a temperatura ambiente y se utiliza para varios ensayos. Preparar una acción ATP 5 mM inmediatamente antes de su uso y mantener en hielo. (NB Uso de Na 2 ATP para prevenir la excesiva señal de fondo a partir de fosfato en el ensayo). Preparar la solución de SDS parada (12% (w / v) de SDS en ddH2O). </li><li> Para la detección Chifflet preparar tampón A (3% (w/ V) de ascorbato, 0,5% (w / v) de molibdato de amonio, HCl 0,5 M) inmediatamente antes de su uso y tampón B (2% (w / v) de citrato de sodio, 2% (w / v) de sodio meta-arsenito, 2% (v / v) de ácido acético). </li></ol> 2. Aislamiento de microsomas de levadura <ol><li> S. cerevisiae que expresan CFTR pollo se cultivan como se describe en O&#39;Ryan et al. (2012) 14. Guarde el material de una fermentación L 20 en dos alícuotas a -80 ° C durante un máximo de 6 meses. </li><li> Descongelar una alícuota de células rápidamente y volver a suspender en 3 ml MPIB refrigerado por gramo de células. </li><li> Romper las células en un molino de bolas usando perlas de vidrio de 425-600 micras de diámetro. Utilice cinco períodos 1 min de la ruptura celular separadas por períodos de descanso 1 min. (Los períodos de descanso son esenciales para asegurar que las células no se calientan durante la interrupción.) </li><li> Monitorear la disrupción celular por centrifugación de una muestra de 1 ml de lisado de células de la molino de perlas. Se centrifuga (12.000 xg, 4 º C, 5 min) en un centr de sobremesaifuge. Diluir el sobrenadante a 01:50 con MPIB en una cubeta y medir la A 380. Si A 380&gt; 0.1, o ha dejado de crecer a pesar de varios ciclos de cuentas que superaron repetidas, continúe con el siguiente paso. Si no, repita 02.03 a 02.04. </li><li> Centrifugar el lisado celular total (12.000 x g, 4 ° C, 20 min). Conserve el sobrenadante. Deseche el sedimento (que contiene células sin romper y mitocondrias), pero si hay alguna duda acerca de la eficacia de la rotura celular (ver 2.4), luego guarde el pellet también. </li><li> Centrifugar el sobrenadante de la etapa anterior (200.000 xg, 4 ° C, 1,5 h). Desechar el sobrenadante y resuspender las membranas microsomales sedimentadas en tampón de CFTR. Si los microsomas están destinados para la purificación usando DDM, complementar la memoria intermedia de CFTR con 1 M de NaCl. </li><li> Repetir la centrifugación de la fracción de membrana se resuspendió (100.000 x g, 4 ° C, 1 hora) y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender los microsomas sedimentadas enun volumen mínimo de tampón de CFTR (volumen final de 5-15 ml, proteína microsomal total de 70-200 mg). Un ensayo de Bradford puede ser utilizado para determinar la concentración total de proteínas microsomales 25. Además, el espectro de emisión de fluorescencia de las membranas debe ser medido (excitación = 485 nm, emisión = 500-600 nm) y debe tener un pico distinto fluorescencia de GFP (máximo a 512 nm). CFTR puede ser detectada específicamente en un gel de SDS-PAGE, en condiciones escaneada fluorescencia de GFP (Figura 1). </li><li> Flash congelar los microsomas resuspendidos por inmersión en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C, o continuar con el paso 3. </li></ol> 3. Solubilización de microsomas <ol><li> Si se congela, descongelar microsomas inmediatamente antes de su uso en un baño de agua a 10 ° C. </li><li> Para la solubilización de las membranas, diluir los microsomas con un volumen igual de tampón de solubilización el relevante (Paso 1.3) para dar una concentración final de detergente de2% (w / v) y una proteína microsomal de concentración de 5 mg / ml. Incubar esta mezcla durante 1 hora a 4 ° C con agitación (rotador tubo). Conserve 200 l para el análisis. </li><li> Centrifugar la mezcla (100.000 xg, 4 ° C, 45 min). Eliminar el sobrenadante que contiene las proteínas de membrana solubilizadas, pasarla a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras y almacenar en hielo. Medir la fluorescencia del sobrenadante (como en el paso 2.8). </li><li> Resuspender la fracción insoluble en 1% (w / v) de solución de SDS a un volumen igual a la fracción soluble. Medir la fluorescencia en esta fracción y retener una parte alícuota de 50 l para el análisis de SDS-PAGE. </li></ol> 4. La purificación de afinidad de níquel-de CFTR <ol><li> Enlace columnas dos de 5 ml de níquel Sepharose en serie. Lavar con 2 volúmenes de columna (CV) 20% (v / v) de etanol, seguido de 2 CV ddH2O, a continuación, lavar la columna con 2 CV de tampón de solubilización (Paso 1.4 hasta 1.5), que contiene 1 M imidazol. Repita con 2 CV de solubilizationes tampón que carecen de imidazol. </li><li> Añadir imidazol a una concentración final de 5 mM para el material solubilizado (Paso 2.8) y cargar manualmente el material en la columna o en un bucle de muestras si se utiliza un dispositivo de cromatografía de líquidos automatizado. </li><li> Cargar el material solubilizado en la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min, y se lava con 2 CV de tampón de imidazol-carente a la misma velocidad de flujo para eliminar el material no unido. Recoger fracciones de 50 ml tubos Falcon. </li><li> Para el primero de lavado, usar 3 CV de tampón de purificación con imidazol 40 mM a una velocidad de flujo de 1 ml / min. Recoger fracciones de 2 ml. </li><li> Para el segundo lavado, use 3 CV de tampón de purificación con imidazol 100 mM. Recoger fracciones de 2 ml. </li><li> Elute CFTR de la columna de HisTrap con 3 CV de tampón de purificación con imidazol 400 mM. Recoger fracciones de 2 ml. </li><li> Monitorear la fluorescencia en las fracciones eluidas (Paso 2.8). </li><li> Conservar alícuotas de fracciones de los picos para el análisis de SDS-PAGE. Congelación flash restante pico fmuestras raction y almacenarlos a -80 ° C, o seguir a la siguiente etapa de purificación. </li></ol> 5. Cromatografía de exclusión molecular (GPC) Purificación de CFTR <ol><li> Equilibrar la columna (Superose 6 10/300 GL) con 1,2 CV ddH2O seguido de 1,2 CV de tampón GPC. </li><li> Durante el Paso 5.1, concentrar las de Ni-afinidad fracciones purificadas con la más alta fluorescencia de GFP usando un filtro centrífugo de MWCO de 100.000 a 4 ° C. Si purificador en DDM, evitar la concentración de la muestra por encima de una concentración de proteína de 0,3 mg de proteína / ml, ya que esto hará que la pérdida de muestra significativo. Retire el retenido de la concentrador y se centrifuga a 100.000 x g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar las partículas grandes. </li><li> Inyectar la muestra en la columna y eluir con un gradiente isocrático de 1,2 CV de tampón de GPC. Recoger fracciones de 0,5 ml. </li><li> Medir la fluorescencia de GFP como en la sección 2.8 para identificar las fracciones que contienen CFTR. Conserve un pequeño volumen (por ejemplo &lt;/ Em&gt; 50 l) de cada uno para el análisis por SDS-PAGE. </li><li> Congele fracciones en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. </li></ol> 6. Reconstitución de CFTR <ol><li> Añadir lípidos (Paso 1.8) a la CFTR purificada en ratio de 100:1-lípido a proteína (w / w) y se incuba a 4 ° C durante 1 hora. Del mismo modo establecer un control de lípidos única, la sustitución de la proteína purificada con el mismo volumen de tampón de GPC. </li><li> Retire el detergente de la mezcla de proteína / lípido utilizando perlas adsorbentes hidrófobos. Lavar perlas adsorbentes en 5 CV ddH2O, 5 CV 70% (v / v) de etanol, 5 CV ddH2O, y 5 CV de tampón de GPC que carecen de la detergente. Añadir 200 mg de perlas adsorbentes lavadas por ml de proteína purificada y se incuba a 4 ° C durante la noche con agitación suave. </li><li> Recoger la muestra de la reconstitución de las perlas adsorbentes en un tubo nuevo utilizando una pipeta de punta fina terminación. </li></ol> 7. Medición de la Actividad ATPasa <ol><li> Determinar la tasa de CFTActividad de la ATPasa-R específica utilizando un ensayo de Chifflet modificado 26,27 en un formato de placa de 96 pocillos. Con fosfato de sodio solución madre (0,65 mM) preparar 0-20 nmol de fosfato en un volumen final de 50 l como estándares. Utilice una mezcla 1:1 de tampón de CFTR y tampón para diluir la ATPasa de stock de fosfato. </li><li> Incubar ambos CFTR reconstituido y liposomas en blanco con 1:100 (v / v) inhibidores de la ATPasa (Paso 1.9) en hielo durante 10 min. Use al menos 5 g de CFTR reconstituido. </li><li> Añadir ATP (Paso 1.9) a una concentración final de 2 mM y se incuba a 25 ° C durante 1 hora. Detener la reacción mediante la adición de 40 l de 10% (w / v) SDS (Paso 1.9) a cada pocillo (incluyendo los estándares). </li><li> Añadir 100 l de tampón A (paso 1,10) y se incuba durante 10 min. Añadir 100 l de tampón B (1.10) a cada pocillo y medir la absorbancia a una longitud de onda de 800 nm en un Espectrofotómetro UV / VIS compatible con placa de 96 pocillos. </li><li> Convertir la absorbancia a 800 nm en una cantidad de fosfato liberado utilizando elnormas de fosfato. Calcular la tasa de hidrólisis de ATP después de restar la señal de fondo (sólo liposoma pozos). </li><li> Para CFTR no reconstituido seguir el mismo protocolo utilizando tampón de CFTR para las lecturas de fondo. </li></ol>

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	<li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+(ABCC7)+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel.">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li><li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK:+1947-2003.">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li><li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li><li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration.">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li><li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung.">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li><li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology:+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates.">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li><li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line.">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li><li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+of+MRP1+(ABCC1)+and+related+ATP-dependent+drug+transporters.">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li><li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li><li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis.">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li><li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter.">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li><li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter.">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li><li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate/tungstate+ABC+transporter.">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li><li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA:+Alternating+access+with+a+twist.">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li><li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter:+structure+and+allosteric+regulation.">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li><li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding.">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li><li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids.">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+functional+characterization,+and+NMR+studies+of+human+KCNE1,+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome.">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia ni otro conflicto de interés con respecto a este trabajo.

Hemos descrito previamente un método para la sobreexpresión de CFTR murino 14. Desde la publicación de ese protocolo, hemos expresado y purificado varias orthologs diferentes de CFTR utilizando el mismo sistema. Todos los ortólogos probado hasta ahora purificaron bien en el detergente de GLP, mientras que la purificación DDM mostró más variación entre diferentes ortólogos (datos no mostrados). Esta flexibilidad ilustra la fortaleza del enfoque de la levadura: es posible seleccionar muchas construcciones con relativa rapidez con el fin de seleccionar uno para un propósito particular. Lavar los microsomas de levadura con tampón que contenía 1 M de NaCl antes de la solubilización con resultados DDM en una preparación de microsoma más limpio y reduce los contaminantes en las etapas posteriores. Este paso no es necesario en el protocolo GLP como la muestra final de CFTR es&gt; 90% puro sin el lavado de microsomas. Además, la purificación en DDM requiere varias alteraciones a los tampones para la solubilización de unND purificación, a saber, la adición de glicerol y el exceso de sal. En conjunto, estas adiciones aumentaron considerablemente la unión de la proteína-DDM solubilizado a la columna. La metodología de purificación DDM tiene margen para la mejora, en particular, la eliminación de un contaminante principal 40 kDa que, juzgado por espectrometría de masas, es debido a la subunidad ribosómica de levadura L3, que parece tener una afinidad inherente para la resina de níquel. No hay una secuencia poliHis obvio en la proteína L3, pero el examen de su estructura 3D cuando se une al ribosoma (AP = 1FFK) muestra que la subunidad L3 plegada tiene un clúster poliHis potencial. Que esta banda es menos problemática en materia de GLP-purificado puede ser debido a que el detergente GLP más dura. Aunque la purificación en DDM parece ser más pobre que en GLP, detergentes más suaves tales como DDM pueden ser más compatible con los análisis funcionales y estructurales y se han utilizado ya en varios crystall de rayos Xestudios radiográficos de las proteínas de membrana 15-21. Además, nuestros resultados indicaron que el uso de GLP conduce a la pérdida de la función ATPasa en CFTR en relación con la purificación en DDM. Por lo tanto le recomendamos el protocolo de purificación a base de GLP para la generación de CFTR donde la pureza es crucial, por ejemplo, en aplicaciones tales como la caracterización de las modificaciones post-traduccionales, o en la generación de anticuerpos, se elegiría el protocolo basado en GLP . Por otro lado, en aplicaciones en las que es esencial la actividad y estado completamente nativa de la proteína, propondríamos el protocolo basado en DDM como una mejor opción. Para concluir, este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de CFTR en el detergente zwitteriónico GLP-14 o el detergente no iónico DDM. Como tal, indica una mayor gama de condiciones de purificación para CFTR que han sido previamente informado 10-13. En miligramo Además cantidades de CFTR purificados pueden serobtenido utilizando estos procedimientos cuando se combina con un sistema de crecimiento de la levadura de alto volumen tal como un fermentador de 20 L y un sistema de recolección de células de alta capacidad tal como un 6 L de rotor de la centrifugadora de baja velocidad. El CFTR obtenido tiene una etiqueta GFP escindible que permite la monitorización fácil de la proteína en diversos ensayos bioquímicos y biofísicos. El reactivo se describe en este manuscrito (plásmido que contiene CFTR-pollo o células de levadura congelados) se puede obtener a través de la Fundación de Fibrosis Quística (EE.UU.).

La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad genética más común en Europa y América del Norte, con una incidencia de aproximadamente 1 de cada 2.500 nacidos vivos. CF ocurre cuando las mutaciones en el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) causa la proteína pérdida de su función en la membrana plasmática de las células epiteliales 1. La consecuencia más grave de este defecto es el daño pulmonar irreversible, lo cual acorta la esperanza de vida de los enfermos a &lt;40 años de edad 2,3. CFTR es un ATP vinculante cassette (ABC) transportador que ha evolucionado para convertirse en un 1,4 del canal iónico. A pesar de su función bastante alterado en la membrana plasmática de las células, que aún conserva homología de secuencia significativa con otros transportadores ABC. Curiosamente, las partes especializadas del CFTR (es decir, su región reguladora y su N-y C-terminales) comparten ninguna similitud de secuencia significativa con otros metazoos transportadores ABC, por lo tanto, no hay pistas en cuanto a the orígenes de estas secuencias en CFTR. Sobre la base de su estructura primaria, CFTR está clasificado como un miembro de la familia C-de la familia de transportadores ABC, pero no hay evidencia fuerte para un enlace funcional residual para esta sub-familia. Ha habido algunos informes de la actividad del transporte glutatión para CFTR 5-7, lo que sería coherente con el papel de los otros miembros de la familia C-8,9, aunque otros informes sugieren que el glutatión reducido puede inhibir la actividad CFTR ATPasa, en lugar de mostrar la estimulación inducida por sustrato-que caracterizan a los transportadores ABC 10. La medición de la conductancia de iones es suficientemente sensible para permitir la actividad de los canales de CFTR moléculas individuales que se estudió 1 y las propiedades del canal CFTR han sido controlados como una función de tiempo, temperatura, concentración de ATP, potencial de membrana, y estado de fosforilación, así como en la presencia de una gran cantidad de inhibidores de moléculas pequeñas, potenciadores, y modificadores. Estosestudios también han aumentado considerablemente nuestro conocimiento de cómo funcionan los transportadores ABC. Sin embargo, la expresión de CFTR en cantidades significativas y su posterior purificación ha demostrado ser particularmente difícil y el éxito ha sido limitado a unos pocos laboratorios 10-13. La necesidad de desarrollar fármacos más eficaces es apremiante, sin embargo, este proceso se ha visto obstaculizado por la falta de CFTR purificada para la detección de moléculas pequeñas. Resolver el problema de la expresión de CFTR y purificación permitiría la detección de drogas de alto rendimiento destinado a corregir el defecto primario en la FQ y podría también abrir una ruta para estudios estructurales de alta resolución para informar el diseño racional de fármacos. Por otra parte, incluso características bioquímicas relativamente básicas de la proteína, tales como su estado oligomérico funcional, las proteínas que interactúan y la actividad ATPasa permanecen pobremente caracterizados. Hemos informado anteriormente de un protocolo para la expresión a gran escala de las buenas prácticas agrarias y CFTR murino marcado con Hisen S. cerevisiae 14 y ahora también describen protocolos para la purificación de CFTR. Hemos utilizado estos métodos para purificar cinco orthologues de CFTR, y los datos presentes para la purificación de CFTR pollo como un ejemplo. La selección de los detergentes para la solubilización y purificación es un paso crítico en la purificación de cualquier proteína de membrana. Después de haber proyectado para la solubilidad de CFTR en varios detergentes, hemos elegido dos detergentes de contraste para uso en la purificación. Dodecil-β-D-maltósido (DDM) es un detergente no iónico que se ha utilizado ampliamente para ambos estudios estructurales y funcionales de las proteínas de membrana 15-21. El detergente iónico 1-tetradecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol) (GLP-14) es altamente eficaz en la solubilización de CFTR y se ha utilizado anteriormente en la purificación de proteínas de membrana funcionales 10, 22,23, incluyendo la purificación de CFTR a partir de S. cerevisiae 24. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

Los defectos en el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) de proteínas causan la fibrosis quística (FQ), una enfermedad autosómica recesiva que actualmente limita la esperanza media de vida de los enfermos a &lt;40 años de edad. El desarrollo de moléculas de drogas nuevas para restaurar la actividad de CFTR es un objetivo importante en el tratamiento de la FQ, y el aislamiento de CFTR funcionalmente activo es una medida útil para lograr este objetivo. Se describen dos métodos para la purificación de CFTR de un sistema de expresión heteróloga eucariótica, S. cerevisiae. Al igual que los sistemas procariotas, S. cerevisiae se puede cultivar rápidamente en el laboratorio a bajo costo, sino también el tráfico y después de la traducción puede modificar proteínas de membrana grandes. La selección de los detergentes para la solubilización y purificación es un paso crítico en la purificación de cualquier proteína de membrana. Habiendo proyectado para la solubilidad de CFTR en varios detergentes, hemos elegido dos contrasting detergentes para su uso en la purificación que permiten la preparación de CFTR final para ser adaptado a los experimentos planificados posteriormente. En este método, proporcionamos comparación de la purificación de CFTR en dodecil-β-D-maltósido (DDM) y 1-tetradecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1&#39;-rac-glicerol) (GLP-14). La proteína purificada en DDM por este método muestra la actividad ATPasa en ensayos funcionales. Proteína purificada en GLP-14 muestra una alta pureza y rendimiento, se pueden emplear para estudiar las modificaciones post-traduccionales, y se puede utilizar para los métodos estructurales tales como de pequeño ángulo de dispersión de rayos X y microscopía electrónica. Sin embargo, muestra la actividad de la ATPasa significativamente menor.

El protocolo descrito anteriormente es un medio eficaz para aislar microsomas de CFTR-enriquecido, con recuperación casi completa de CFTR durante la rotura de células y preparación de los microsomas de crudo (Figura 1). Otros métodos de rotura de células también se pueden emplear eficazmente. Hemos utilizado una célula de presión francesa, y otros dispositivos high-pressure/cavitation (también en combinación con un impacto contra un objetivo rubí) con igual eficacia. Por conveniencia y bajo costo inicial del equipo, nos encontramos con el método de talones paliza el mejor. El uso de GLP para solubilizar y purificar CFTR produjo 80 g de proteína / l de cultivo en&gt; 90% de pureza (Figura 2). El alto rendimiento fue debido a la solubilización eficiente de CFTR por LPG (comparar Figura 2B, carriles 2 y 4). Además, eficiente y de unión a la columna ajustado resultó en una pérdida mínima de CFTR en la fracción no unida y la ausencia de CFTR en las fracciones de lavado (Figura 2, carriles 3, 5, y6). La proteína eluida tenía una pureza de&gt; 90%, estimada por geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie y mediante densitometría de la CFTR y bandas de contaminantes. Cromatografía de permeación en gel (GPC) separa GLP-CFTR purificado de los contaminantes de bajo peso molecular (Figura 4, panel inferior). El protocolo para la purificación de CFTR utilizando DDM da pureza de aproximadamente el 60% y el rendimiento de aproximadamente 50 g / L (Figura 3). La microscopía electrónica (EM) de las fracciones teñidas negativamente de la GPC que eluye a aproximadamente 10 ml (Figura 4) mostró que CFTR purificada-DDM contiene agregados de 20-30 nm de diámetro, así como partículas más pequeñas de 10 nm de diámetro (datos no mostrados). Es posible que los pequeños agregados de forma reversible pueden asociar y disociar como ultrafiltración con un filtro de corte de 1 MDa fallado para eliminar los agregados EM-detectables. Material de GLP-purificado no adsorbe a una rejilla resplandor-dado de alta, por lo tanto, fue estudiado por crio-EM de las fracciones teñidas. Esto mostróuna población de partículas muy homogénea de un tamaño relativamente pequeño (6-8 nm de diámetro, datos no mostrados). Por último, la actividad de ATPasa de las proteínas purificadas se midió (Figura 5). Como miembro de la familia de proteínas ABC, CFTR tiene dos dominios de unión de nucleótidos (NBDs) capaz de unirse y / o hidrólisis de ATP. Los datos indican que la proteína purificada no era capaz de hidrolizar el ATP en el estado-GLP solubilizado y mostró una débil actividad ATPasa en la presencia de DDM (Figura 5, las barras sin relleno). Después de la adición de los lípidos, y la eliminación del detergente, la actividad ATPasa fue 4 veces mayor para las muestras que habían sido purificados en DDM (13 nmol de ATP / min / mg de proteína). La adición de lípidos y la eliminación de GLP actividad similar restaurado a CFTR que había sido aislado utilizando GLP, pero con una menor tasa final (1,5 nmol de ATP / min / mg de proteína) que el material de DDM-purificado y reconstituido. <img alt="Figura 1"fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 monitorización de los niveles de CFTR pollo en lisado de células (CL)., Los sobrenadantes (S) y gránulos (P) durante diversas etapas de centrifugación utilizados para el aislamiento de microsomas y lavado. Geles de SDS-PAGE se visualizaron utilizando la fluorescencia en gel de la GFP tag. El sobrenadante después de la rotura celular y la centrifugación a 14000 x g contiene prácticamente todo el CFTR (incluyendo productos de degradación). Ultracentrifugación a 200.000 xg sedimentos todo el CFTR de longitud completa dejando algunos fragmentos en el sobrenadante. Ultracentrifugación a 100.000 xg de sal se lavó microsomas pellets de casi todo el CFTR con la eliminación de algunos fragmentos adicionales. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> Figura 2. Purificación de CFTR pollo en GLP por cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE seguido por tinción de Coomassie (panel superior) y la detección de fluorescencia de la etiqueta GFP (panel inferior). Pistas: (1) Microsomas. (2) GLP-microsomas solubilizados. (3) El material no unido. (4) El material insoluble. (5) y (6) 40 y 100 lavados mM imidazol. (7) El material eluido con imidazol 400 mM. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> Figura 3. Purificación de CFTR pollo en DDM por cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE seguido por tinción de Coomassie. El panel de la izquierda muestra las fracciones antes de la elución. Varias fracciones de elución consecutivos se muestran en el panel de la derecha con CFTR enindicada por la flecha. Las fracciones posteriores se enriquecen en un contaminante de 40 kDa, que ha sido identificado por espectrometría de masas como la proteína ribosomal L3. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> Figura 4. Purificación de CFTR de pollo por cromatografía de permeación en gel. CFTR purificado por cromatografía de afinidad de Ni-se concentró y se aplicó a una columna de GPC. El perfil de elución de CFTR (panel superior) purificado en tampón que contiene GLP-14 (línea continua) o DDM (línea discontinua) se superponen. SDS-PAGE (panel inferior), reveló que CFTR eluye entre 8 y 11 ml. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> Figura 5. Activit ATPasaY de fracciones purificadas de proteína CFTR de pollo. purificado en DDM o GLP se ensayó usando un ensayo de Chifflet modificado 26 en presencia de un cóctel de inhibidores de ATPasa para eliminar cualquier fondo de actividad de la ATPasa de F-, P-y ATPasas de tipo V (barras sin relleno ). La tasa de hidrólisis de ATP se midió también después de la eliminación del detergente y la adición de lípidos (barras rellenas). El gráfico muestra la media y la desviación estándar (n = 3). Las diferencias entre los valores medios para la actividad ATPasa en presencia y ausencia de lípidos, y la diferencia entre la actividad en DDM y el GLP son significativas a p &lt;0,05.

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Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

La expresión heteróloga y purificación del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) son retos importantes y los factores limitantes en el desarrollo de terapias con medicamentos para la fibrosis quística. Este protocolo describe dos métodos para el aislamiento de cantidades de miligramos de CFTR adecuados para los estudios funcionales y estructurales.

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

14.4K vistas.  University of Manchester.  La expresión heteróloga y purificación del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) son retos importantes y los factores limitantes en el desarrollo de terapias con medicamentos para la fibrosis quística. Este protocolo describe dos métodos para el aislamiento de cantidades de miligramos de CFTR adecuados para los estudios funcionales y estructurales. 

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR supervisado Redox La titulación de los cofactores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...