עבודה זו מומנה על ידי הקרן האמריקנית סיסטיק פיברוזיס (CFF) באמצעות קונסורציום מבנה CFTR 3D שלה. TR מומן על ידי מלגת לימודים בבריטניה CF אמון, וצפון קרוליינה על ידי מלגת לימודים בבריטניה BBSRC. אנו מכירים עמיתינו בקונסורציום מבנה CFF CFTR 3D לעזרת והעצה ועל העיצוב של תגי רצף CFTR עוף וטיהור מותאמים קודון.

1. הכנת חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מניית 100x של מעכבי פרוטאז קוקטייל (PI) לפזר 96 AEBSF מ&quot;ג, chymostatin 3.5 מ&quot;ג, 10 מ&quot;ג E64, 16.5 leupeptin מ&quot;ג, 16.5 pepstatin מ&quot;ג, 348 PMSF מ&quot;ג, ו -4 מ&quot;ג bestatin ב20 מיליליטר DMSO. הפוך aliquots 1 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C. כדי להפוך את המניה 100x של benzamidine, לפזר 720 מ&quot;ג ב20 מיליליטר מים ultrapure (DDH 2 O) ולאחסן ב 1 מיליליטר aliquots ב -20 ° C. כמות זו תספיק לטיהור אחד. בכל המאגרים, מניות PI וbenzamidine משמשות בדילול 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;mPIB&#39; (0.3 pH M טריס 8, 0.3 M סוכרוז, 2 מ&quot;מ DTT) ו&#39;CFTR &#39;(50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / גליצרול v), 1 מ&quot;מ DTT) חוצצים וצינה עד 4 ° C . לפני השימוש, מוסיף 1:100 של מעכבי פרוטאז הקוקטייל ו1:100 benzamidine בהתאם להיקף של mPIB משמש לresuspend התא גלולה (לדוגמא, השתמש 3.5 PI מיליליטר ו3.5 מיליליטר benzamidine בנפח כולל של 350 מיליליטר mPIB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את יםolubilization מאגרים. (, 10% (v / v) גליצרול, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, מעכבי פרוטאז (PIS) ו -4% גפ&quot;מ 50 מ&quot;מ טריס pH 8 (w / v)) חיץ solubilization גליצרול-14 (גפ&quot;מ) Lyso-phosphatidyl וחיץ solubilization maltoside dodecyl (DDM) (50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / גליצרול v), 1 M NaCl, 1 mM DTT, מעכבי פרוטאז, 4% (w DDM / V)). ניתן sonicated הצפת באמבטית sonicator (35 W, 40 קילוהרץ) כדי לסייע בפיזור של חומרי הניקוי, אך להימנע vortexing התערובת, כמו זה יוצר בועות. צ&#39;יל עד 4 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ טיהור CFTR לטיהור גפ&quot;מ הוא 50 מ&quot;מ טריס, 10% (v / v) גליצרול, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) גפ&quot;מ-14 ומעכבים פרוטאז. הכן 350 מיליליטר של חיץ זה, ו150 מיליליטר של אותו החיץ בתוספת imidazole ז 1. להתאים את pH של שני המאגרים ל8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאגר לטיהור בDDM מורכב מ50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / v) גליצרול, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. הכן 350 מיליליטר של חיץ זה, ו150 מיליליטר של אותו החיץ בתוספת imidazo 1 Mle. להתאים את pH של שני המאגרים ל8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ כרומטוגרפיה חלחול ג (GPC) המכיל גפ&quot;מ, להכין 50 מ&quot;מ טריס pH 8, 10% גליצרול (V / V), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.05% (w / v) גפ&quot;מ-14. לGPC באמצעות DDM להכין מאגר של 50 מ&quot;מ טריס pH 8, 20% (v / v) גליצרול, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1% (w / v) DDM. כל המאגרים וDDH 2 O בשימוש בעמודת GPC צריכים להיות מסוננים (0.2 מיקרומטר מסנן) וdegassed לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מדגם SDS-PAGE (2x ריכוז העבודה): 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.6, 5% (v / v) גליצרול, 5 מ&quot;מ EDTA, 0.02% (w / v) bromophenol כחול. הפוך 700 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C. לפני השימוש, מוסיף 200 μl של 20% (w / v) נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ושל טרי 0.5 M DTT 100 μl. דגירה של לפחות 10 דקות עם דגימה בטמפרטורת חדר לפני הטעינה על ג&#39;ל. אין לחמם; זה לפגל-GFP, ועלול לגרום CFTR לצבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מניות שומנים לכינון מחדש, לפזר תערובת 04:01 (w / w) של א &#39; coli שומניםכולסטרול ד בכלורופורם ומתנול (2:1 V / V), ויבש בבקבוקון זכוכית תחת 2 גז N עבור שעה 2 כדי ליצור סרט שומנים בדם. הוסף חוצץ GPC (ללא NaCl) לריכוז שומנים של 40 מ&quot;ג / מיליליטר ולהשתמש vortexing חוזר ונשנה וsonication (W 35, 40 קילוהרץ) כדי להבהיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay ATPase, להכין 100x מניות של מעכבי ATPase ידי המסת SCH28080 ל1 מ&quot;מ DMSO, NaSCN לז 1 ב DDH 2 O וoligomycin ל2.5 מ&quot;מ ב100% (v / v) אתנול. חנות בaliquots ב -20 ° C. הפוך של חיץ ATPase 100 מיליליטר עם 50 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 5 מ&quot;מ MgSO 4 ו0.02% (w / v) NaN 3. זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר ומשמש לכמה מבחני. הכן מלאי 5 מ&quot;מ ATP מייד לפני השימוש ולשמור על קרח. (נ.ב. השתמש Na 2 ATP כדי למנוע אות רקע מוגזמת מפוספט בassay). הכן את פתרון SDS העצירה (12% (w / v) SDS ב DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי Chifflet להכין חיץ (3% (w/ V ascorbate), 0.5% (w / v) molybdate אמוניום, 0.5 M HCl) מייד לפני השימוש וחיץ B (2% (w / v) ציטרט הנתרן, 2% (w / v) meta-arsenite נתרן, 2% (V / V) חומצה אצטית). </li></ol> 2. בידוד של Microsomes שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ס cerevisiae להביע CFTR עוף גדלים כפי שמתואר באררייאן et al. (2012) 14. אחסן את החומר מתסיסת L 20 בשני aliquots ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot אחד מתאים במהירות וresuspend ב 3 מיליליטר mPIB המצונן לגרם של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים בטחנת חרוז באמצעות חרוזי זכוכית של 425-600 קוטר מיקרומטר. השתמש בחמש דקות 1 תקופות של שיבוש תא מופרדות על ידי תקופות מנוחת 1 דקות. (תקופות המנוחה הן חיוניות כדי להבטיח כי התאים אינם מחוממים במהלך הפרעה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הפרעה תא על ידי צנטריפוגה של מדגם 1 מיליליטר של lysate התא מן טחנת חרוז. צנטריפוגה (12,000 XG, 4 ° C, 5 דקות) בcentr גבי ספסלifuge. לדלל את supernatant ל01:50 עם mPIB בקובט ולמדוד את 380. אם 380&gt; 0.1, או הפסיק הגדלת למרות כמה מחזורי חרוז-מכות חוזרות ונשנות, להמשיך לשלב הבא. אם לא, תחזרו על 2.3-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא הכולל (12,000 x גרם, 4 ° C, 20 דקות). שמור את supernatant. זורק את הכדור (המכיל תאים ומיטוכונדריה רצופים), אבל אם יש לו ספקות לגבי היעילות של שבירת תא (ראה 2.4), ואז לשמור גם גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant מהשלב הקודם (200,000 XG, 4 ° C, 1.5 שעות). בטל supernatant ו resuspend קרומי microsomal pelleted במאגר CFTR. אם microsomes מיועד לטיהור באמצעות DDM, להשלים את חיץ CFTR עם 1 M NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על צנטריפוגה של שבריר קרום resuspended (100,000 x גרם, 4 ° C, 1 שעות) וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend microsomes pelleted בהיקף מינימאלי של חיץ CFTR (נפח סופי 5-15 מיליליטר, חלבון microsomal סך 70-200 מ&quot;ג). Assay ברדפורד ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז הכולל של חלבוני microsomal 25. בנוסף ספקטרום פליטת הקרינה של הקרומים יש למדוד (עירור = 485 ננומטר, פליטה = 500-600 ננומטר) וצריך להיות שיא מובחן GFP פלואורסצנטי (מקסימום ב512 ננומטר). CFTR יכול להיות מזוהה באופן ספציפי על ג&#39;ל SDS-PAGE, נסרק בתנאי הקרינה ה-GFP (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flash-להקפיא microsomes resuspended ידי צולל לתוך חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לשלב 3. </li></ol> 3. Solubilization של Microsomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם קפוא, להפשיר microsomes מייד לפני השימוש באמבט מים מוגדר 10 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לsolubilization של ממברנות, לדלל את microsomes עם נפח שווה של החיץ הרלוונטי solubilization (שלב 1.3) לתת ריכוז חומר ניקוי סופי של2% (w / v) וריכוז 5 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון microsomal. דגירה את התערובת לשעה 1 ב4 ° C עם תסיסה (מסובב צינור). שמור 200 μl לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת (XG 100,000, 4 ° C, 45 דקות). הסר את supernatant המכיל החלבונים בממברנה solubilized, להעביר אותו דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ולאחסן על קרח. למדוד את הקרינה של supernatant (כמו בשלב 2.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שבריר מסיס ב1% (w / v) פתרון SDS לנפח שווה לחלק מסיס. למדוד את הקרינה בחלק זה ולשמור aliquot של 50 μl לניתוח SDS-PAGE. </li></ol> 4. טיהור ניקל זיקה של CFTR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות שני sepharose ניקל 5 מיליליטר הקישור בסדרה. לשטוף עם 2 כרכי עמודה (CV) 20% אתנול (V / V), ואחרי 2 קורות חיים DDH 2 O, ולאחר מכן לשטוף את העמודה עם 2 קורות חיים של חיץ solubilization (שלב 1.4-1.5), המכיל imidazole ז 1. חזור על פעולה עם 2 קורות חיים של solubilizatיון החיץ חסר imidazole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת imidazole לריכוז סופי של 5 מ&quot;מ לחומר solubilized (שלב 2.8) ולטעון את החומר באופן ידני על הטור או לתוך לולאת מדגם אם באמצעות מכשיר כרומטוגרפיה נוזלי אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את חומרי solubilized על הטור בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה, ולשטוף עם 2 קורות חיים של חיץ חסר-imidazole באותו קצב הזרימה להסרת חומר מאוגד. איסוף שברים ב50 צינורות מיליליטר פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכביסה הראשונה, השתמש 3 קורות חיים של חיץ טיהור עם imidazole 40 מ&quot;מ בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה. לאסוף 2 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשטוף את השני, להשתמש 3 קורות חיים של חיץ טיהור עם imidazole 100 מ&quot;מ. לאסוף 2 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute CFTR מעמודת HisTrap עם 3 קורות חיים של חיץ טיהור עם imidazole 400 מ&quot;מ. לאסוף 2 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הקרינה שבברי eluted (שלב 2.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור aliquots של שברים שיא לניתוח SDS-PAGE. ו שיא שנותר הקפאת פלאשדגימות raction ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לשלב הטיהור הבא. </li></ol> 5. ג&#39;ל חלחול כרומטוגרפיה טיהור (GPC) של CFTR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה (Superose 6 10/300 GL) עם 1.2 קורות חיים DDH 2 O ואחריו 1.2 חיץ קורות החיים GPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב 5.1, לרכז את השברים המטוהרים Ni-הזיקה לקרינת ה-GFP הגבוהה ביותר באמצעות מסנן צנטריפוגלי 100,000 MWCO ב 4 ° C. אם טיהור בDDM, להימנע מריכוז המדגם מעל ריכוז חלבון של 0.3 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון כמו זה יגרום לאובדן מדגם משמעותי. הסר את retentate מהרכז ו צנטריפוגות ב 100,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C עד גלולה חלקיקים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק מדגם זה על הטור וelute עם שיפוע isocratic של 1.2 חיץ קורות החיים GPC. לאסוף 0.5 מיליליטר שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הקרינה ה-GFP כאמור בסעיף 2.8 לזהות את אותם שברים המכילים CFTR. לשמור על נפח קטן (לדוגמא: &lt;/ Em&gt; 50 μl) של כל אחד לניתוח על ידי-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את השברים בחנקן נוזלים חנות ב -80 ° C. </li></ol> 6. כינונה מחדש של CFTR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שומנים (שלב 1.8) לCFTR המטוהרים ב100:1 שומנים בדם לחלבון יחס (w / w) ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כמו כן הקים שליטת שומנים בדם בלבד, החלפת החלבון מטוהר עם אותו הנפח של חיץ GPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חומרי ניקוי מתערובת חלבונים / שומנים בדם באמצעות חרוזים כושר ספיגה הידרופובי. לשטוף חרוזים בעלי כושר ספיגה ב5 קורות חיים DDH 2 O, 5 קורות חיים 70% (v / v) אתנול, 5 קורות החיים DDH 2 O, ו -5 חיץ קורות החיים GPC חסר חומרי הניקוי. הוסף 200 מ&quot;ג של חרוזים כושר ספיגה שטפו לכל מיליליטר של חלבון מטוהר ודגירה על 4 מעלות צלזיוס לילה עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את דגימת הכינון מחדש מחרוזי כושר ספיגה לתוך צינור טרי באמצעות פיפטה קצה דק הסתיים. </li></ol> 7. מדידה של פעילות ATPase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את שיעור CFTפעילות ATPase R הספציפי באמצעות assay Chifflet הותאם 26,27 בפורמט צלחת 96 היטב. עם פתרון מניות פוספט נתרן (0.65 מ&quot;מ) להכין 0-20 פוספט nmol בנפח סופי של μl 50 כסטנדרטים. השתמש בתערובת 1:1 של חיץ CFTR וחיץ ATPase כדי לדלל את מניות פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני CFTR מחדש ויפוזומים ריקים עם 1:100 (V / V) מעכבי ATPase (שלב 1.9) על קרח דק 10. השתמש בלפחות 5 מיקרוגרם של CFTR מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ATP (שלב 1.9) לריכוז סופי של 2 מ&quot;מ ולדגור על 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. עצור את התגובה על ידי הוספת 40 μl של 10% (w / v) SDS (שלב 1.9) זה טוב (בכלל זה, הסטנדרטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ 100 μl (שלב 1.10) ו דגירה עבור 10 דקות. הוספת 100 חיץ μl B (1.10) זה טוב ומדוד את הספיגה באורך גל של 800 ננומטר בUV / VIS ספקטרופוטומטר צלחת תואמת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת הספיגה ב 800 ננומטר לכמות של פוספט המשוחרר באמצעותסטנדרטים פוספט. חישוב שיעור הידרוליזה ATP לאחר הפחתת אות רקע (ליפוזום בלבד בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לCFTR הלא מחדש בצע את אותו הפרוטוקול באמצעות חיץ CFTR לקריאה הרקע. </li></ol>

<ol>
	<li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+(ABCC7)+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel.">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li><li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK:+1947-2003.">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li><li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li><li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration.">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li><li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung.">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li><li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology:+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates.">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li><li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line.">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li><li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+of+MRP1+(ABCC1)+and+related+ATP-dependent+drug+transporters.">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li><li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li><li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis.">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li><li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter.">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li><li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter.">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li><li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate/tungstate+ABC+transporter.">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li><li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA:+Alternating+access+with+a+twist.">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li><li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter:+structure+and+allosteric+regulation.">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li><li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding.">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li><li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids.">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+functional+characterization,+and+NMR+studies+of+human+KCNE1,+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome.">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein:+Application+to+lens+ATPases.">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li><li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence.">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li></ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים ולא אינטרסים נוגדים אחרים ביחס לעבודה זו.

שתארנו בעבר שיטה לביטוי היתר של CFTR העכברי 14. מאז פרסום כי הפרוטוקול, שהבענו וטהר כמה orthologs שונה של CFTR באמצעות אותה המערכת. כל orthologs נבדק עד כה מטוהר היטב בחומר ניקוי גפ&quot;מ, תוך טיהור DDM הראתה יותר וריאציה על פני orthologs שונה (מידע לא מוצג). גמישות זו ממחישה את עוצמתו של שמרי הגישה: זה אפשרי למסך מבנים רבים במהירות היחסית כדי לבחור באחת למטרה מסוימת. שטיפת השמרים microsomes עם מאגר המכיל 1 M NaCl לפני solubilization עם תוצאות DDM בהכנת גופיפון נקיה יותר ומפחית את המזהמים בשלבים מאוחר יותר. שלב זה הוא מיותר בפרוטוקול גפ&quot;מ כמדגם CFTR הסופי הוא&gt; 90% טהור בלי לשטוף גופיפון. יתר על כן, טיהור בDDM דורשת מספר שינויים במאגרים לsolubilizationטיהור nd, כלומר התוספת של גליצרול ומלח נוספים. יחד, תוספות אלה הגדילו באופן משמעותי מחייבות של חלבון DDM-solubilized לעמודה. יש מתודולוגיה טיהור DDM היקף לשיפור, בפרט הסרת מזהמים עיקריים 40 kDa ש, נשפטו על ידי ספקטרומטריית מסה, בשל מקטע השמרים ריבוזומלי L3, אשר נראה כי יש זיקה מהותית לשרף ניקל. אין רצף polyHis ברור בחלבון L3, אך בחינה של מבנה 3D שלה כאשר חייב הריבוזום (PDB = 1FFK) מראה כי יש לו את מקטע L3 המקופל אשכול polyHis פוטנציאלי. שהלהקה הזו היא פחות בעייתית בחומר מטוהר גפ&quot;מ יכול להיות בגלל חומרי ניקוי גפ&quot;מ יותר קשה. למרות הטיהור בDDM נראית עני יותר מזה בגפ&quot;מ, חומרי ניקוי מתונים יותר כגון DDM עשוי להיות תואמים יותר עם ניתוחים תפקודיים ומבניים וכבר השתמשו בכמה crystall רנטגןמחקרי ographic של חלבונים בממברנה 15-21. יתר על כן, התוצאות שלנו מצביעות על כך שהשימוש בגפ&quot;מ מוביל לאובדן של תפקוד ATPase בביחס CFTR לטיהור בDDM. מכאן אנו ממליצים על פרוטוקול הטיהור מבוסס גפ&quot;מ עבור הדור של CFTR בי טוהר הוא קריטי, למשל ביישומים כגון אפיון לאחר translational שינויים, או בדור של נוגדנים, הפרוטוקול מבוסס גפ&quot;מ ייבחר . מצד השני ביישומים שבם הפעילות והמצב טבעי לחלוטין של החלבון חיוני, היינו מציע מבוסס פרוטוקול DDM כאפשרות טובה יותר. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור לבידוד של CFTR בDDM גפ&quot;מ-14 או חומר הניקוי שאינו היוני חומר ניקוי zwitterionic. ככזו, היא מצביעה על טווח רחב יותר של תנאים לטיהור CFTR מאשר דווחו בעבר 10-13. במיליגרם בנוסף כמויות של CFTR מטוהר יכולות להיותשהושג באמצעות נהלים אלה בשילוב עם מערכת שמרי צמיחה בנפח גבוה, כגון מערכת קצירת תא קיבולת גבוהה כמו הרוטור צנטריפוגה במהירות נמוכה 6 L פרמנטור ו20 L. יש CFTR השיג תג ה-GFP cleavable המאפשר ניטור קל של החלבון במבחני ביוכימיים וbiophysical שונים. ניתן להשיג מגיב שתואר בכתב היד הזה (פלסמיד המכיל CFTR עוף או תאי שמרים קפוא) באמצעות קרן סיסטיק פיברוזיס (ארה&quot;ב).

סיסטיק פיברוזיס (CF) הוא המחלה הגנטית הנפוצה ביותר באירופה ובצפון אמריקה עם שכיחות של 1 ל 2,500 לידה חי. CF מתרחש כאשר מוטציות ברגולטור פיברוזיס המוליכות הטרנסממברני פיברוזיס (CFTR) הפסד סיבת חלבון של תפקודו בקרום הפלזמה של תאי האפיתל 1. התוצאה החמורה ביותר של פגם זה היא נזק בלתי הפיך ריאות, מה שמקצר את תוחלת החיים של חולים ל&lt; 40 גיל 2,3. CFTR הוא קלטת ATP מחייב טרנספורטר (ABC) שהתפתחה להיות 1,4 ערוץ יון. למרות הפונקציה די שינתה בקרום הפלזמה של תאים, היא עדיין שומרת הומולוגיה ברצף משמעותית עם מובילי ABC אחרים. מעניין לגלות שהחלקים מיוחדים של CFTR (כלומר אזור הרגולציה שלה ו-N-ו-C-Termini) חולקים שום דמיון רצף משמעותי עם מובילי ABC מטזואניים אחרים, ומכאן שאין רמזים לגבי המקורות דואר של רצפים אלה בCFTR. על בסיס המבנה הראשוני שלה, CFTR מסווג חבר של משפחת טרנספורטר ABC C-משפחה, אבל אין ראיות חזקות להצמדה פונקציונלית שיורית למשנה המשפחה הזאת. היו כמה דיווחים על פעילות תחבורת גלוטתיון לCFTR 5-7, וזה יהיה בקנה אחד עם התפקידים של חברי C-משפחה אחרות 8,9, אם כי דיווחים אחרים עולה כי גלוטתיון מופחת עשוי לעכב את פעילות CFTR ATPase, ולא מראה את גירוי-Induced מצע המאפיינים את מובילי ABC 10. מדידת מוליכות יון היא רגישה מספיק כדי לאפשר את פעילות הערוץ של מולקולות CFTR אחת כדי להיחקר 1 ומאפייני ערוץ CFTR כבר במעקב כפונקציה של זמן, טמפרטורה, ריכוז ה-ATP, פוטנציאל הממברנה, ומדינת זירחון, כמו גם ב נוכחותו של מארח של מעכבי מולקולה קטנים, potentiators, ומכפילים. אלהגם מחקרים שהוספנו באופן משמעותי לידע של איך מובילי ABC לתפקד שלנו. עם זאת, ביטוי של CFTR בסכומים משמעותיים והטיהור הבאה שלה הוכיח להיות מאתגר במיוחד וההצלחה הייתה מוגבלת לכמה מעבדות 10-13. הצורך לפתח תרופות יעילות יותר דוחק, אך תהליך זה התעכב בשל חוסר CFTR מטוהר לסינון מולקולות קטנות. פתרון בעיית ביטוי CFTR והטיהור יאפשר הקרנת סמים תפוקה גבוהה שמטרתה לתקן את הפגם העיקרי בCF וגם לפתוח את מסלול ללימודים מבניים ברזולוציה גבוהה כדי ליידע את עיצוב סמים רציונלית. יתר על כן, אפילו מאפיינים ביוכימיים בסיסיים יחסית של חלבון, כגון מדינת oligomeric הפונקציונלית שלה, חלבוני אינטראקציה ופעילות ATPase יישארו מאופיינים בצורה גרועה. יש לנו דיווח פרוטוקול לביטוי בקנה מידה גדולה של ה-GFP-CFTR והעכברי מתויג-בעברבס 14 cerevisiae ועכשיו יתאר נוסף פרוטוקולים לטיהור של CFTR. יש לנו להשתמש בשיטות אלה כדי לטהר את חמש orthologues של CFTR, ומציג נתונים לטיהור של CFTR עוף לדוגמא ירושלים. הבחירה של חומרי ניקוי לsolubilization וטיהור היא שלב קריטי בטיהור של כל חלבון בממברנה. לאחר שהוקרן למסיסות של CFTR בכמה חומרי ניקוי, בחרנו שני חומרי ניקוי מנוגדים לשימוש בטיהור. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) הוא חומר ניקוי nonionic שכבר נעשה שימוש נרחב לשני מחקרים מבניים ותפקודיים של חלבונים בממברנה 15-21. חומר הניקוי היוני 1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול) (גפ&quot;מ-14) הוא יעיל ביותר בsolubilization של CFTR ועבר כבר נעשה שימוש בטיהור של חלבונים בממברנה פונקציונליים 10, 22,23, כולל טיהור של CFTR מס 24 cerevisiae. &lt;/ P&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:492px;" width="491">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;M syringe filter&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sartorius</td>
			<td style="width:161px;">FC121</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane)</td>
			<td style="width:115px;">Vivaspin</td>
			<td style="width:161px;">VS0641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">72.695</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">40Ti rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;"><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50ml Sterile Falcon Tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">62.547.254</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A26209&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid chromatography system</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">28-4062-64</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A8456</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bead-beating cell disrupter</td>
			<td style="width:115px;">BioSpec</td>
			<td style="width:161px;">1107900</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">HERMLE</td>
			<td style="width:161px;">Z300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5417R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benchtop microfuge&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">13-100-511</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">434760</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">152-3920</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">114391</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">357000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">170-808</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C8667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chymostatin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C7268</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">D8418</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">43815</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">E.coli total lipid extract</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">100500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">E3132</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass beads, acid washed</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8772</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:161px;">65017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HisTrap HP columns (5 ml)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5247-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapid Coomassie Stain</td>
			<td style="width:115px;">Novexin</td>
			<td style="width:161px;">ISB1L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge JA-17 rotor</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">369691</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:115px;">Merck</td>
			<td style="width:161px;">108975</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG)</td>
			<td style="width:115px;">Avanti lipids</td>
			<td style="width:161px;">858120</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:115px;">BioRad</td>
			<td style="width:161px;">165-8006</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">n-dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:115px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:161px;">D310S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S6191</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NaN3</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">A9434</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75351</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">392050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prestained protein standards</td>
			<td style="width:115px;">Fermentas</td>
			<td style="width:161px;">SM1811</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Desalting columns (Sephadex G-25)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-0851-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin A</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P4265</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">P7626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sch28080</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S4443</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L37771</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium thiocyanate (NaSCN)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">251410&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel filtration 10/300 GL column</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:161px;">17-5172-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-base</td>
			<td style="width:115px;">Formedium</td>
			<td style="width:161px;">TRIS01</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:115px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:161px;">355618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:115px;">Star Labs</td>
			<td style="width:161px;">N2400-0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic water bath</td>
			<td style="width:115px;">Ultrawave</td>
			<td>F0002202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Multimode plate reader</td>
			<td style="width:115px;">BioTek</td>
			<td style="width:161px;">BTH1MF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein expressed in saccharomyces cerevisiae

פגמים ברגולטור פיברוזיס המוליכות הטרנסממברני פיברוזיס (CFTR) חלבון גורמים סיסטיק פיברוזיס (CF), מחלה אוטוזומלית רצסיבית שכרגע מגבילה את תוחלת החיים הממוצעת של חולים ל&lt; 40 שנים של גיל. הפיתוח של מולקולות תרופה חדשניות כדי לשחזר את הפעילות של CFTR הוא מטרה חשובה בטיפול CF, והבידוד של CFTR תפקודי הפעיל הוא צעד שימושי להשגת מטרה זו. אנו מתארים שתי שיטות לטיהור של CFTR ממערכת אוקריוטים Heterologous ביטוי, ש &#39; cerevisiae. כמו מערכות פרוקריוטים, ש &#39; cerevisiae ניתן לגדל במהירות במעבדה בעלות נמוכה, אלא גם תנועה וposttranslationally יכול לשנות את החלבונים בממברנה גדולים. הבחירה של חומרי ניקוי לsolubilization וטיהור היא שלב קריטי בטיהור של כל חלבון בממברנה. לאחר שהוקרן למסיסות של CFTR בכמה חומרי ניקוי, בחרנו שני שיתוףntrasting חומרי ניקוי לשימוש בטיהור שתאפשר הכנת CFTR הסופית להיות מותאמת לניסויים המתוכננים בהמשך. בשיטה זו, אנו מספקים השוואה של הטיהור של CFTR בdodecyl-β-D-maltoside (DDM) ו1-tetradecanoyl-SN-glycero-3-phospho-(1&#39;-RAC-גליצרול) (גפ&quot;מ-14). החלבון מטוהר בDDM בשיטה זו מעיד על פעילות ATPase במבחנים תפקודיים. החלבון מטוהר בגפ&quot;מ-14 תערוכות טוהר גבוה ותשואה, יכולים להיות מועסק על מנת ללמוד שלאחר translational שינויים, ויכול לשמש לשיטות מבניות כגון פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה ומיקרוסקופים אלקטרונים. עם זאת הוא מציג פעילות ATPase נמוכה באופן משמעותי.

הפרוטוקול שתואר לעיל הוא אמצעי יעיל לבודד microsomes מועשר CFTR, עם התאוששות של CFTR כמעט מוחלטת במהלך שבירת התא והכנת microsomes הגולמי (איור 1). שיטות שבירת תא אחרות גם יכולות להיות מועסקות בצורה יעילה. יש לנו מנוצלים תא לחץ צרפתי, והתקני high-pressure/cavitation אחרים (גם בשילוב עם להשפיע נגד יעד אודם) עם יעילות שווה. לנוחות ועלות הראשונית נמוכה של הציוד, אנו מוצאים את שיטת חרוז ההכאה את הטוב ביותר. שימוש בגפ&quot;מ לsolubilize ולטהר CFTR הניב 80 תרבות חלבון מיקרוגרם / ליטר ב&gt; טוהר 90% (איור 2). התשואה הגבוהה נובעת solubilization יעיל של CFTR על ידי גפ&quot;מ (השווה איור 2b, מסלולים 2 ו -4). בנוסף, יעיל והדוק מחייב לעמודה הביאו להפסד המינימלי של CFTR בשבריר מאוגד וההיעדרות של CFTR בשברים לשטוף (איור 2, נתיבי 3, 5, ו6). היה חלבון eluted טוהר&gt; 90%, שהוערך על ידי ג&#39;לים SDS-PAGE צבעוני Coomassie ובאמצעות צפיפות של CFTR ולהקות מזהמים. כרומטוגרפיה חלחול ג&#39;ל (GPC) מופרדת CFTR-מטוהר גפ&quot;מ ממזהמים במשקל מולקולרי נמוכים (איור 4, פנל תחתון). הפרוטוקול לטיהור CFTR באמצעות DDM נותן טוהר% והתשואה של בערך 50 מיקרוגרם / ליטר (איור 3) על 60. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) של שברים צבעוניים שלילי מGPC משחררי בכ -10 מיליליטר (איור 4) הראה כי CFTR מטוהר-DDM מכיל אגרגטים של 20-30 ננומטר בקוטר, כמו גם חלקיקים קטנים בקוטר של 10 ננומטר (מידע לא מוצג). יתכן כי אגרגטים הקטנים הפיך יכולים לקשר ולנתק כאולטרה סינון עם מסנן חתוכים 1 מד&quot;א לא הצליחו להסיר את אגרגטים EM-לזיהוי. חומר מטוהר גפ&quot;מ לא לספוג לרשת-שוחרר זוהר, ומכאן נחקר על ידי cryo-EM של שברים ללא רבב. זה הראהאוכלוסיית חלקיקים מאוד הומוגנית בגודל קטן יחסית (6-8 ננומטר קוטר, מידע לא מוצג). לבסוף, פעילות ATPase של החלבונים המטוהרים נמדדה (איור 5). כבן למשפחת חלבוני ABC, יש CFTR שני התחומים מחייב נוקלאוטיד (NBDs) מסוגל מחייב ו / או hydrolyzing ה-ATP. הנתונים מצביעים על כך שהחלבון מטוהר לא היה מסוגל hydrolyze ה-ATP במדינת גפ&quot;מ-solubilized והראה פעילות ATPase חלשה בנוכחות DDM (איור 5, בארים ללא מילוי). לאחר התוספת של שומנים, והסרת חומרי ניקוי, פעילות ATPase הייתה פי 4 גבוהה יותר עבור דגימות שטוהרו בDDM (13 nmol ATP / דקות / חלבון מ&quot;ג). התוספת של שומנים וסילוק של פעילות שוחזרה באופן דומה לגפ&quot;מ CFTR שהיה מבודד באמצעות גפ&quot;מ, אך עם שיעור סופי נמוך יותר (1.5 nmol ATP / דקות / חלבון מ&quot;ג) מאשר החומר DDM-מטוהר ומחדש. <img alt="איור 1"עבור: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg&quot; src איור 1. רמות ניטור של CFTR העוף בlysate תא (CL), supernatants (S) וכדורים (P) במהלך שלבי צנטריפוגה שונים המשמשים לבידוד גופיפון וכביסה. ג&#39;לי-SDS היו דמיינו באמצעות הקרינה בג&#39;ל של ה-GFP תג. Supernatant לאחר שבירת התא וצנטריפוגה ב14,000 XG מכיל כמעט את כל CFTR (כולל מוצרים פגומים). Ultracentrifugation ב200,000 משקעי XG כל CFTR באורך מלא, והשאירו כמה שברים בsupernatant. Ultracentrifugation ב100,000 XG של כדורי microsomes-שטף מלח כמעט כל CFTR עם ההסרה של כמה שברים נוספים. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" /> איור 2. טיהור של CFTR העוף בגפ&quot;מ על ידי כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת. שברים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו מכתים Coomassie (פנל עליון) וגילוי הקרינה של תג ה-GFP (פנל תחתון). שירים: (1) Microsomes. (2) microsomes-solubilized גפ&quot;מ. (3) חומר לא כרוך. (4) חומר בלתי מסיס. (5) (6) 40 ו100 שוטף imidazole מ&quot;מ. (7) חומר eluted עם 400 imidazole מ&quot;מ. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" /> איור 3. טיהור של CFTR העוף בDDM ידי כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת. שברים נותחו על ידי SDS-PAGE ואחריו מכתים Coomassie. יד הלוח השמאלית מציג שברים לפני elution. כמה שברים elution רצופים מוצגים בלוח היד תקין עם CFTR בdicated על ידי החץ. מאוחר יותר שברים מועשרים במזהם kDa 40, אשר זוהה על ידי ספקטרומטריית מסה כחלבון ריבוזומלי L3. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" /> איור 4. טיהור של CFTR עוף ידי כרומטוגרפיה חלחול ג. CFTR מטוהר על ידי כרומטוגרפיה Ni-זיקה הייתה מרוכז ויחול על עמודת GPC. פרופיל elution לCFTR (פנל עליון) מטוהר במאגר המכיל גפ&quot;מ-14 (קו מוצק) או DDM (קו מקווקו) הם מעולף. SDS-PAGE (פנל תחתון) גילה כי CFTR eluted בין 8 ל 11 מיליליטר. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" /> איור 5. Activit ATPasey של שברים CFTR העוף מטוהרים. החלבון מטוהר בDDM או גפ&quot;מ היה assayed באמצעות assay Chifflet הותאם 26 בנוכחות קוקטייל של מעכבי ATPase לחסל כל פעילות ATPase רקע מF-, P-וATPases V-הסוג (ברים ללא מילוי ). שיעור הידרוליזה ATP נמדד גם לאחר הסרת חומר ניקוי ובנוסף שומנים בדם (בארים מלאים). העלילה מציגה את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית (n = 3). הבדלים בין ערכים הממוצעים לפעילות ATPase בנוכחות והיעדרות של שומנים בדם, והבדל בין הפעילות בDDM וגפ הם משמעותיים לp &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

ביטוי וטיהור של רגולטור פיברוזיס הטרנסממברני סיסטיק המוליכות (CFTR) Heterologous אתגרים משמעותיים וגורמים מגבילים בפיתוח הטיפולים תרופתיים לסיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לבידוד של כמויות מיליגרם של CFTR מתאימות ללימודים תפקודיים ומבניים.

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

14.4K Views.  University of Manchester.  ביטוי וטיהור של רגולטור פיברוזיס הטרנסממברני סיסטיק המוליכות (CFTR) Heterologous אתגרים משמעותיים וגורמים מגבילים בפיתוח הטיפולים תרופתיים לסיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות לבידוד של כמויות מיליגרם של CFTR מתאימות ללימודים תפקודיים ומ?...

Video: Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR פיקוח חיזור טיטרציה של הקו-הפקטורים של<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...