We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

Los protocolos experimentales se realizaron en ratas Long Evans hembras (250-350 g) de acuerdo con las directrices de cuidado y uso de animales prescritos por el gobierno federal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en San Diego. 1. Acclimating la Rata a cuerpo de sujeción NOTA: Coloque la rata en una dieta restringida. Alimentar a la rata una vez al día inmediatamente después de cada sesión de manejo diario para aclimatarse a la rata para el sistema de retención (descrito a continuación). Proporcionar suficiente de alimentación para mantener al animal en 80% de su peso inicial. Esta cantidad es de aproximadamente 6 gramos de alimento por día para un 250 g mujeres de largo Evans rata. <ol><li> Aclimatarse a la rata a ser manipulado por los seres humanos. Frenar suavemente la rata a mano por períodos de aproximadamente 5 segundos cada 30 segundos. Haga esto durante 15 minutos al día en 2 días consecutivos. Monitorear las ratas diariamente para detectar signos de estrés durante el período de formación. Los signos incluyen luchando in respuesta a la moderación, la vocalización, y diente-parloteo. </li><li> En el día 3 rd, coloque la rata en un cuerpo que restringe su calcetín de tela (Figura 1) durante 15 minutos al día durante dos días consecutivos. </li><li> En el 5º día, coloque la rata dentro del calcetín, y colocar el calcetín dentro de un tubo rígido en la plantilla experimental (Figura 4). Deja la rata en el tubo durante 15 minutos al día en 2 días consecutivos. </li><li> Alimentar a la rata inmediatamente después de cada sesión de entrenamiento. Al final de la última sesión (día 6) dar acceso sin restricciones a los alimentos. Seleccione para su implantación sólo aquellas ratas que no muestran signos de estrés excesivo en el último día de entrenamiento. NOTA: Aunque la selección de las ratas para la implantación es subjetiva, en nuestras manos más del 90% de las ratas se encontró que ser sensible a la habituación y capaz de someterse a la implantación. </li></ol> 2. Implantación del Mecanismo de Cámara Grabación y reposacabezas <ol><li> Hacer una realambre Conferencia soldando alambre de acero inoxidable desnudo a un conector pin. Corte el cable de manera que 5.3 mm restos descubiertos por el pasador. Autoclave el cable de referencia, junto con todas las herramientas quirúrgicas. </li><li> Administrar ketamina / xilazina anestesia. Administrar 95 mg / kg de ketamina se mezcla con 5 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal. La dosis inicial tiene una duración de 1 ½ a 2 horas. Complementar la anestesia cada 30-45 min a partir de entonces, según sea necesario. Lubricar los ojos del animal con una pomada oftálmica. </li><li> Compruebe el reflejo de retirada del dedo del pie para determinar el plano de la anestesia, y mantener la anestesia según sea necesario. </li><li> Coloque la rata en un marco de soporte estereotáxica con barras de oído (Figura 3A). Afeitarse el pelo en la cabeza y la desinfección de la zona de la herida con povidona-yodo (solución al 10%). Tenga cuidado de insertar las barras de oído adecuadamente de modo que no dañen el tímpano. Barras de oído con puntas romas son preferibles. </li><li> Hacer una incisión con un bisturí aproxidamente a lo largo de la línea media del cráneo desde el nivel rostro-caudal de los ojos a la parte posterior de las orejas. Utilice unas tijeras para cortar y retirar una tira de 2-3 mm de piel en cada lado de la incisión. </li><li> Raspe el periostio para exponer la superficie del cráneo a los rebordes laterales. Cubra el cráneo expuesta con fina capa de pegamento. </li><li> Perforar un agujero pequeño, con un diámetro ligeramente menor que 0-80 tornillos, usando un taladro rebabas ½ mm de diámetro (véase la sección de Materiales). Perforar el agujero inmediatamente posterior a bregma, donde la sutura se encuentra con el canto lateral, y en un ángulo de 30-45 ° en el cráneo, de modo que el tornillo puede entrar con la parte superior más lateral de la parte inferior. </li><li> Enrosque un tornillo 0-80 máquina de fondo plano al agujero (aproximadamente 3 vueltas), en 30 a 45 ° de ángulo. Tenga cuidado de no enroscar demasiado profundamente para evitar dañar el tejido cerebral subyacente. </li><li> Repita este procedimiento para 6 tornillos adicionales en la configuración que se muestran <strong&gt; (Figura 3B). Aplicar pegamento a la base de todos los tornillos. </li><li> Coloque una aguja de la jeringa en el manipulador stereotax. Mida desde la sutura bregma, y ​​hacer un hueco en el cráneo con la aguja cerca, pero fuera de la ubicación craneotomía deseada, como una marca de referencia. NOTA: En esta demostración, las coordenadas estereotáxica de la marca son 3 mm posterior y 1 mm lateral a la sutura bregma. </li><li> Marque la abolladura con un marcador permanente. Tenga en cuenta las coordenadas estereotáxica de la marca, ya que servirá como punto de referencia estereotáxica (Figura 3B). </li><li> Hacer una craneotomía centrado en las coordenadas deseadas (3 mm posterior y 3 mm lateral al bregma en este ejemplo). Deje la duramadre intacta. Cubrir la craneotomía con líquido cefalorraquídeo artificial modificada (NaCl 125 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM de MgCl 2, pH 7,4) 13 (Figura 3C). </li&gt; <li> Cortar un tubo de 0,2 ml centrífuga para 4 - 5 mm de longitud, y le cortó la tapa. Se coloca el tubo en el cráneo y centrarlo sobre la craneotomía. </li><li> Aplique el cemento dental alrededor de la parte inferior del tubo para sellar la base del tubo en el cráneo. Tenga cuidado de no tener fugas de cemento en la craneotomía expuesto (Figura 3D). </li><li> Perforar otro agujero pequeño (alrededor de ½ mm de diámetro) en la placa craneal contralateral e inserte con cuidado el cable de referencia. Construir el cable de referencia por la soldadura de un pasador que se conecta con el amplificador de grabación para el extremo del alambre (ver sección Equipment). No mueva el cable de referencia una vez que está en el cerebro, ya que esto puede causar daños. </li><li> Aplicar pegamento en el agujero en el que se insertó el alambre. Esto sellará el pasador y el cable en su lugar temporalmente. </li><li> Mezclar las dos partes del kit de gel de silicona (véase la sección de Materiales) en porciones aproximadamente iguales. Espere dos minutos para mezclar y fill el tubo de centrífuga aproximadamente ⅓ completo con gel. </li><li> Acople una abrazadera posterior ángulo recto (véase la sección de Materiales) de la barra de reposacabezas. Coloque la placa de cabeza (Figura 2A) a la barra de retención (Figura 2B) en un ángulo de 45 ° de tono de modo que la parte inferior de la placa es hacia la nariz del animal. Es útil usar un inclinómetro para ajustar el ángulo de paso para que coincida con la de la plantilla experimental (Figura 4). </li><li> Coloque la barra de sujeción al brazo manipulador stereotax para que la barra es paralela a las barras de oído. Bajar la barra y la placa de modo que la placa es posterior de la sutura lambda y anterior a la caudal más-tornillo. </li><li> Sujete la cabeza del perno delantero (un perno o tornillo 8-32, véase la sección de Materiales) a unos 45 ° ángulo con un brazo manos ayudar y abrazadera, de manera que la cabeza del tornillo quede hacia abajo y hacia la cola del animal. Baje el tornillo de modo que toque la hormigaerior 0-80 tornillos (Figura 3F, G). </li><li> Asegure el perno y la placa en su lugar con acrílico dental. Aplicar acrílico dental alrededor de las cabezas de los tornillos de hueso, el pasador de referencia, y alrededor de los lados del tubo de centrífuga. Espere aproximadamente 10 min para el acrílico dental se seque (Figura 3H). </li><li> Aplicar una capa de cemento dental alrededor de los bordes del acrílico dental, consolidando la piel para el implante. Espere a que el cemento se seque. </li><li> Meter varios agujeros en la tapa del tubo de centrífuga, y colocar el tapón en el tubo. </li><li> Retire la abrazadera manos ayudando. A continuación, retire con cuidado la barra de la cabeza de retención de la stereotax, y luego retire la placa de la cabeza de la barra (Figura 3I). </li><li> Quite el animal del stereotax y administrar cuidados postoperatorios y de seguimiento de conformidad con todas las reglas, reglamentos y leyes (por ejemplo, buprenorfina 0,02 mg / kg, cada 8 a 12 horas durante un mínimo de 24hr). Si la inflamación se desarrolla alrededor de los bordes del implante, aplicar una capa fina de pomada antibiótica al sitio afectado diariamente hasta que se resuelva. </li></ol> 3. Monitoreo Juxtacellular de unidades neuronales <ol><li> Tire tubo capilar de cuarzo en una micropipeta láser de dióxido de carbono extractor (ver sección Equipment) con diámetros de punta de menos de 1 m (Figura 5A). Nota: Los parámetros de calentamiento variarán de acuerdo con el instrumento en particular, y que el diámetro del cuello requerida variará dependiendo de la estructura del cerebro de interés. Para grabaciones en el tálamo de ratas, micropipetas tienen cuellos que van de 5-7 mm. </li><li> Asegure la pipeta en el lugar bajo un contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopio equipado con objetivos de larga distancia de trabajo. Use plastilina para sostener la pipeta en su lugar en el escenario del microscopio. </li><li> Lentamente mueva un bloque de vidrio (0,5 a 1 cm de espesor; un pedazo de vidrio utilizado para making cuchillos ultra-micrótomo es conveniente) en el campo de visión con la punta de pipeta. Utilizando el micromanipulador etapa, toque suavemente la punta de la pipeta para el cristal, haciendo que se rompa. Repita según sea necesario hasta que el diámetro exterior de la punta de pipeta está entre 1-3 micras (Figura 5B, C). Asegúrese de que estas micropipetas tienen impedancias entre aproximadamente 5-15 MΩ. </li><li> Preparar solución salina extracelular (NaCl 135 mM, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,2 con NaOH) 8 y añadir 2% (w / v) Chicago Sky Azul. Usando una jeringa con una aguja de 30 G o menor, llenar el extremo posterior de la pipeta con la solución. Alternativamente, para el etiquetado juxtacellular sola célula añadir 2% (w / v) Neurobiotin o amina dextrano biotinilado (BDA-3000 o BDA-10000) a la solución salina en lugar de Chicago Sky Azul. </li><li> Coloque la rata dentro del calcetín de tela en el interior del tubo rígido en una plantilla experimental apropiado ( <strong&gt; Figura 4) .Wait un mínimo de 72 horas después de la cirugía antes de colocar el animal en el montaje de reposacabezas. Apretar el cordón alrededor de la parte superior del esternón, en lugar del cuello, para evitar la obstrucción de la vía aérea. Si la respiración parece ser dificultosa u obstruida, afloje el cordón o moverlo posterior. Llevar a cabo este procedimiento mientras la rata está alerta. </li><li> Fije la placa frontal de restricción en la rata a la pieza correspondiente en la plantilla. Para ello, en primer pin de la placa reposacabezas en su lugar y, a continuación, fijarlo con un tornillo 4-40. Asegúrese de esperar hasta que el animal está tranquilo con el fin de evitar la aplicación de un par excesivo a la cabeza. Luego, coloque una tuerca de 8-32 en el perno de cabeza de restricción que se implanta en la rata. Luego atornille en una varilla de acero inoxidable roscado al perno en la cabeza. Colocar la varilla a la plantilla experimental de tal manera (Figura 4) que se puede apretar en su lugar. NOTA: Asegurar el animal con la cabeza del perno, así como el reposacabezas placa minducir al mínimo la flexión del aparato y mejora la estabilidad de la grabación. En la mayoría de los casos la grabación puede comenzar en el primer día del animal es el jefe-restringido. Sin embargo, si el animal se mueve nerviosamente en exceso o vocaliza, proporcionar un día de entrenamiento habituación reposacabezas antes de comenzar las grabaciones. En este caso, dejar al animal en la plantilla durante 15 minutos y luego se coloca de nuevo en su jaula. Repita este paso el día siguiente y continuar con el protocolo. </li><li> Abra la cámara de grabación y quitar el gel de silicona. Limpie la craneotomía utilizando unas pinzas finas si el tejido ha vuelto a crecer en la craneotomía. </li><li> Coloque la pipeta para el micromanipulador motorizado, y conecte el preamplificador cabezal de la platina. NOTA: En el presente manifestación, un circuito de relé pequeño en el cabezal de la platina se utiliza para cambiar entre los hilos conductores del amplificador y una fuente de corriente externa con alto cumplimiento (Figura 6A-C). Tenga en cuenta que algunos amplificadores tienen un adecuado incorporado fuente de alto cumplimiento(Ver Discusión y Materiales secciones). </li><li> Utilice el micromanipulador motorizado para mover la punta de la pipeta a la marca estereotáxicamente identificado en la cámara de grabación. Tenga en cuenta las coordenadas de la ubicación. Tenga cuidado de no romper la punta de la pipeta sobre el cráneo. </li><li> Mueva la pipeta a la ubicación de grabación que desee en los ejes antero-posterior y medio-lateral. Entonces avanzar la pipeta ventralmente a través de la dura hasta que es de aproximadamente 500 micras dorsal a la ubicación de grabación. </li><li> Avance lentamente la pipeta mientras escucha para clavar eventos en un monitor de audio de la tensión amplificada registrado entre la punta de la pipeta y el cable de referencia. Una vez identificados los eventos Rematar, continúan moviendo la pipeta 0-100 micras hasta deflexiones positivas tensión va mayores que se observan alrededor de 500 mV. NOTA: La resistencia del electrodo se incrementará en un factor de aproximadamente 1,5-10 when esta se produce. </li><li> Comienza la grabación una vez una unidad ha sido aislado como de acuerdo al paso 3.11, junto con todas las demás medidas conductuales y fisiológicos de interés. En la presente manifestación, movimientos Vibrisas autogenerados son monitoreados con la videografía de alta velocidad (véase la sección de Materiales). </li><li> Para etiquetar el sitio de registro, cambiar el electrodo lleva a conectarse a la fuente de corriente. Hay varias maneras de hacer esto, ya sea utilizando un circuito de relé (Figura 6 A - C), un sistema incorporado en la fuente de corriente en el amplificador, o manualmente (Figura 6D, consulte el paso 3.8 y Discusión). Pase -4 mu con 2 pulsos por segundo bajo ciclo de trabajo del 50% durante 4 minutos para inyectar iontoforéticamente Chicago Sky azul a través de la pipeta. </li><li> Matar y perfundir el animal después de varios procedimientos de etiquetado según la práctica estándar. Sección del cerebro y de contraste si es necesario para identificar la localización anatómica de la grabación sentarsee. Contratinción el tejido para la reactividad citocromo oxidasa como por 14. Por otra parte, identificar los depósitos de Chicago Sky azul usando microscopía de fluorescencia. NOTA: Para diferenciar con precisión entre diferentes unidades marcadas es importante que todas las etiquetas están fabricadas con la misma pipeta en el mismo día, sin el desamarre la pipeta entre las etiquetas. En este caso, los sitios de grabación pueden ser diferenciados por su ubicación relativa en la histología post-hoc junto con las coordenadas del manipulador notables de cada sitio (véase el paso 3.9). Para la identificación inequívoca, marque las etiquetas de al menos 200 micras separados unos de otros, y no más de 3-5 etiquetas por región del cerebro. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Construcción de la plantilla experimental La descripción de las partes mecánicas utilizadas para construir la plantilla experimental (Figura 4) se omite en el protocolo, ya que se puede construir en una variedad de maneras. En esta norma demostración se utilizan optomecánico partes y las abrazaderas de soporte para montar la barra de reposacabezas y el tubo de sujeción del cuerpo (véase la sección de Materiales). Partes...

Supervisión de la actividad neuronal en un animal de alerta participando activamente en una tarea de comportamiento es crítica para la comprensión de la función y la organización del sistema nervioso. Registro extracelular de la actividad eléctrica de las unidades neuronales individuales ha sido durante mucho tiempo una herramienta básica de la neurociencia de sistemas y es todavía ampliamente en uso en la actualidad. Una variedad de tipos de electrodos y configuraciones están disponibles en función de las exigencias científicas y técnicas de un experimento particular. Crónicamente implantados microdrives o conjuntos de electrodos se utilizan a menudo en animales con libertad de movimientos, incluyendo aves, roedores y primates no humanos 1.4. Alternativamente, las penetraciones agudos con microelectrodos de metal o de vidrio a través de un micromanipulador externa se utilizan a menudo para grabar a partir de animales anestesiados o cabeza-restringido. Electrodos de micropipeta de vidrio tienen la ventaja de que pueden ser utilizados en el juxtacellular o &quot;célula unidos&quot; configuración para aislar de manera inequívoca laactividad de las neuronas individuales sin las complicaciones de pico post-hoc de clasificación 5. Estos electrodos permitan, además, la grabación a partir de células o lugares anatómicamente identificadas, ya que pueden ser utilizados para inyectar pequeños depósitos de tinte o neuroanatómicas trazadores, o incluso para llenar el individuo célula registrada. Esta configuración se ha aplicado con éxito en ratas, ratones y aves 10.6. La técnica descrita actualmente centra en el seguimiento juxtacellular y los depósitos de tinte extracelular en alerta, ratas cabeza-restringido. Tenga en cuenta que una sola célula a diferencia de juxtacellular llena, estos depósitos de tinte no proporcionan información sobre la morfología celular o proyecciones axonales 11, pero permitirá la localización anatómica exacta a aproximadamente 50 micras y, críticamente, tienen un rendimiento significativamente mayor en los animales de alerta. La información relativa a una sola célula juxtacellular llena, sin embargo, se proporciona como una estrategia alternativa para el etiquetado anatómica. En resumen, elprotocolo consta de tres fases principales. En la primera fase, la rata se aclimataron a la restricción del cuerpo en un calcetín de tela (Figura 1) durante un período de 6 días. En la segunda fase, un aparato de apoyacabezas (Figura 2) y la cámara de grabación se implantan quirúrgicamente de tal manera que la rata se puede mantener en el plano estereotáxico durante múltiples sesiones de grabación posteriores (Figura 3); este procedimiento permite al experimentador de centrarse en las regiones subcorticales del cerebro para el estudio electrofisiológico basado en referencia estándar coordina 12. La tercera fase consiste en la colocación de la rata en una plantilla adecuada para la realización de los experimentos de comportamiento y electrofisiológicos (Figura 4), ​​la construcción del electrodo de un tubo capilar de cuarzo (Figura 5), por lo que las grabaciones neuronales juxtacellular que sin ambigüedades aíslan unidades individuales 6-9, y marcando los locati anatómicasen el sitio de la grabación con Chicago Sky colorante azul (Figuras 6 y 7). Las grabaciones se realizaron con monitorización simultánea de comportamiento; sin embargo, los detalles técnicos de la conducta dependerán de los objetivos científicos de cada experimento y por lo tanto más allá del alcance de un solo protocolo. Después de la terminación del procedimiento experimental, que se puede repetir en varios días, el animal es sacrificado. El cerebro se extrae y se procesa de acuerdo con las técnicas neuroanatómicas estándar utilizando cualquiera de campo claro o microscopía de fluorescencia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Ketaset (Ketamine HCl)</td>
			<td style="width:179px;">Fort Dodge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Anased (Xylazine solution)</td>
			<td style="width:179px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Betadyne (Povidone-Iodine)</td>
			<td style="width:179px;">CVS Pharmacy</td>
			<td align="right" style="width:175px;">269281</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Loctite 495</td>
			<td style="width:179px;">Grainger Industrial Supply</td>
			<td style="width:175px;">4KL86</td>
			<td style="width:315px;">20-40 cp cyanoacrylate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Vetbond</td>
			<td style="width:179px;">3M</td>
			<td style="width:175px;">1469SB</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement powder</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675571</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Grip cement liquid</td>
			<td style="width:179px;">Dentsply Intl</td>
			<td align="right" style="width:175px;">675572</td>
			<td style="width:315px;">For the base of the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Silicone Gel</td>
			<td style="width:179px;">Dow Corning</td>
			<td align="right" style="width:175px;">Mar-80</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Jet denture repair acrylic powder</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td>
			<td style="width:179px;">Lang Dental Manufacturing Co.</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">For securing the head restraint apparatus to the cranium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Chicago sky blue</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C8679</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:175px;">158127</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">P3813</td>
			<td style="width:315px;">For perfusion and tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">C2506</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Diaminobenzidine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:175px;">D5905</td>
			<td style="width:315px;">For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Material Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Rat sock</td>
			<td style="width:179px;">Sew Elegant (San Diego, CA)</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 1, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">PVC tube 2 &#189;&#8221;</td>
			<td style="width:179px;">U.S. Plastic Co.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">34108</td>
			<td style="width:315px;">Figure 4</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Subminiature D pins &#38; sockets</td>
			<td style="width:179px;">TE Connectivity</td>
			<td style="width:175px;">205089-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel music wire 0.010&#8221; diameter</td>
			<td style="width:179px;">Precision Brand Products, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:175px;">21010</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic holding frame</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 900</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic ear bars</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 957</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Stereotaxic manipulator</td>
			<td style="width:179px;">Kopf Instruments</td>
			<td style="width:175px;">Model 960</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">&#189; mm drill burr</td>
			<td style="width:179px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:175px;">100-3995</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quiet-Air dental drill&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Midwest Dental</td>
			<td style="width:175px;">393-1600</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Stainless steel 0-80 1/8&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">247438</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">0.2mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">05-407-8A</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Custom head-holding bar</td>
			<td style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">Custom made, Figures 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:191px;">Custom head-holding plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">UCSD SIO Machine Shop</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:315px;">Custom made, Figure 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Right angle post-clamp</td>
			<td style="width:179px;">Newport</td>
			<td style="width:175px;">MCA-1</td>
			<td style="width:315px;">Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">8-32 3/4&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">240181</td>
			<td style="width:315px;">For head-restraint, Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">4-40 &#188;&#8221; screw</td>
			<td style="width:179px;">Fastener Superstore</td>
			<td align="right" style="width:175px;">239958</td>
			<td style="width:315px;">For head restraint, Figures 3, 4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Quartz capillary tubing</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">QF-100-60-10</td>
			<td style="width:315px;">Figure 5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Carbon dioxide laser puller</td>
			<td style="width:179px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:175px;">P-2000</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Motorized micromanipulator</td>
			<td style="width:179px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:175px;">MP-285</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">Multiclamp 700B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Microelectrode amplifier head stage</td>
			<td style="width:179px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:175px;">CV-7B</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:191px;">Isolated pulse stimulator</td>
			<td style="width:179px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:175px;">Model 2100</td>
			<td style="width:315px;">Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Audio monitor</td>
			<td style="width:179px;">Radio Shack</td>
			<td style="width:175px;">32-2040</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:191px;">Pipette holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:179px;">Warner Instruments</td>
			<td rowspan="2" style="width:175px;">#MEW-F10T</td>
			<td style="width:315px;">Alternate parts: see Discussion</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Figure 6A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Electrode lead wire</td>
			<td style="width:179px;">Cooner wire</td>
			<td style="width:175px;">NEF34-1646</td>
			<td style="width:315px;">(optional), Figure 6D</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:191px;">Relay for amplifier head-stage</td>
			<td style="width:179px;">COTO Technology</td>
			<td style="width:175px;">#2342-05-000</td>
			<td style="width:315px;">(optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:191px;">Digital video camera</td>
			<td style="width:179px;">Basler</td>
			<td style="width:175px;">A602fm</td>
			<td style="width:315px;">(optional) For behavioral monitoring, Figure 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtacellular monitoring and localization of single neurons within sub-cortical brain structures of alert, head-restrained rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

<html> Unidades neuronal en ventral medial posterior (VPM) tálamo codificar la fase de movimiento Vibrisas durante auto-generado batiendo 15,16. La Figura 7A muestra la actividad de la muestra spiking de una unidad de talámico VPM como una rata se batiendo activamente. La Figura 7B muestra un histograma de la espiga veces alineados a la fase instantánea de movimiento Vibrisas 17. Hay más espigas durante la fase de retracción de batir. Después de la grabación,...

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Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Monitoreo Juxtacellular y localización de las neuronas individual dentro de las estructuras cerebrales subcorticales de Alerta, ratas Head-restringido

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K vistas.  University of California, San Diego. This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Investigación

Neurociencias

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Las neuronas de imágenes dentro de las secciones del cerebro gruesas, según el método de Golgi-Cox

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Transcranial Electrical Brain Stimulation in Alert Rodents

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in humans is transcranial direct current stimulation (tDCS). Less frequently, transcranial alternating current stimulation (tACS) or transcranial random noise stimulation (tRNS), a specific form of tACS using an electrical current applied randomly within a pre-defined frequency range, is used. The increase of noninvasive electrical brain stimulation research in humans, both for experimental and clinical purposes, has yielded an increased need for basic, mechanistic, safety studies in animals. This article describes a model for transcranial electrical brain stimulation (tES) through the intact skull targeting the motor system in alert rodents. The protocol provides step-by-step instructions for the surgical set-up of a permanent epicranial electrode socket combined with an implanted counter electrode on the chest. By placing a stimulation electrode into the epicranial socket, different electrical stimulation types, comparable to tDCS, tACS, and tRNS in humans, can be delivered. Moreover, the practical steps for tES in alert rodents are introduced. The applied current density, stimulation duration, and stimulation type may be chosen depending on the experimental needs. The caveats, advantages, and disadvantages of this set-up are discussed, as well as safety and tolerability aspects.

This protocol describes a surgical set-up for a permanent epicranial electrode socket and an implanted chest electrode in rodents. By placing a second electrode into the socket, different types of transcranial electrical brain stimulation can be delivered to the motor system in alert animals through the intact skull.

Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta

Transcranial electrical brain stimulation can modulate cortical excitability and plasticity in humans and rodents. The most common form of stimulation in ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

A Bedside, Single Burr Hole Approach to Multimodality Monitoring in Severe Brain Injury

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic brain injury. While elevations in ICP are common, data regarding the measurement and treatment of these ICP elevations are conflicting. There is increasing recognition that changes in the balance between supply and demand of brain tissue are critically important and therefore the measurement of multiple modalities is required. Approaches are not standard, and therefore this article provides a description of a bedside, single burr hole approach to multimodality monitoring that allows the passage of probes designed to measure not only ICP but brain tissue oxygen, blood flow, and intracranial electroencephalography. Patient selection criteria, operative procedures, and practical considerations for securing probes during critical care are described. This method is readily performed, safe, secure, and flexible for the adoption of a variety of multimodality monitoring approaches aimed at detecting or preventing secondary brain injuries.

A method of recording multimodality monitoring signals in patients with severe brain injuries using a bedside, single burr hole technique is described.

Un enfoque de agujero rebabas de cabecera, solo para monitoreo de multimodalidad en lesión cerebral grave

Intracranial pressure (ICP) monitoring is a cornerstone of the intensive care management of patients with severe acute brain injuries, including traumatic ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modelado de formas tridimensionales y análisis de estructuras cerebrales

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.

Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética