Disfunción de locus coeruleus se ha implicado en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, incluyendo la enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Alzheimer, depresión, trastorno bipolar, y ansiedad. Dadas estas funciones, el análisis de locus coeruleus es crucial para estudiar su función y disfunción. Durante la sección del cerebro del ratón, el locus coeruleus se puede perder fácilmente en secciones coronales o sagitales debido a su pequeño tamaño.
Así, para ofrecer orientación para la localización de locus coeruleus, describimos un protocolo que desarrollamos para localizar esta región en el cerebro del ratón para varias aplicaciones. Comience colocando el cerebro recién aislado de un ratón anestesiado y luego perfundido en 4%PFA en un tubo de 50 mililitros. Incuba el cerebro durante 24 horas a cuatro grados centígrados.
Utilice fórceps para transferir el cerebro a un tubo cónico de 50 mililitros lleno de 25 mililitros de 30% de solución de sacarosa. Incubarlo a cuatro grados centígrados durante 48 a 72 horas hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo. Para incrustar la sección del tronco encefálica, coloque su superficie de corte en la parte inferior de un molde de incrustación y agregue un compuesto de temperatura de corte óptimo para rodear el tronco encefálica.
Congele el cerebro incrustado en un congelador de menos 80 grados Celsius durante al menos 12 horas hasta su uso posterior. Coloque el molde con el cerebro en el criostato e inciba durante varias horas para ajustar su temperatura a la del criostato. Para exponer el bloque OCT que contiene el cerebro, utilice una cuchilla de afeitar para cortar los cuatro bordes del molde hasta la parte inferior, y luego despegue el molde incrustado de él.
Usa cuchillas de afeitar para eliminar el exceso de OCT de la superficie del bloque, asegurándote de no tocar el cerebro. A continuación, monte el bloque OCT en el mandril del criostato, exponiendo la superficie de corte del cerebro hacia el frente. Para ajustar el cerebro, oriente la superficie de corte paralela a las cuchillas de afeitar del criostato.
Orientar correctamente la muestra es un paso crucial en este protocolo. Debido a que estamos utilizando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC, como el límite entre el cerebelo y el colliículo inferior, es importante que las secciones se alineen correctamente. Esto requiere cuidado en establecer correctamente el cerebro en la matriz de la cortadora de cerebro del ratón.
Recortar el cerebro comenzando en la médula, cortando secciones de 100 micrómetros rostralmente. Una vez que el cerebelo y el tronco encefálica comiencen a cortar como una rebanada continua a nivel del cuarto ventrículo, comience a recolectar rodajas con un grosor de 50 micrómetros. Use fórceps para recoger cada rebanada de cerebro y colóquela en un pozo de un plato de 24 pocillos lleno de PBS.
El locus coeruleus será más notable en una rebanada donde el cerebelo y el colliículo inferior se encuentran unos con otros a unos 5,52 milímetros posteriores de bregma. El primer día, lave las rodajas cerebrales en la placa de 24 pozos tres veces durante cinco minutos cada una en PBS. A continuación, añadir 0.5%PBS con detergente y permeabilizarlos a cuatro grados Celsius durante 24 horas.
Al día siguiente, lave las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una con 0.5%PBSD. Luego agregue el anticuerpo primario a una dilución de uno a 500 en 0.5%PBSD e incubar a cuatro grados Celsius durante 18 horas. Al tercer día, lave las rodajas tres veces durante 10 minutos cada una con 0.5%PBSD, luego agregue el anticuerpo secundario en una dilución de uno a 1000 en 0.5%PBSD.
Envuelva la placa con papel de aluminio e incubar a cuatro grados Centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, lave las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una con 0.5%PBSD, y luego durante cinco minutos en PBS. Cubra las secciones utilizando un medio de montaje duro sin DAPI.
Cubra con una cubierta de vidrio y séquela durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice un microscopio confocal con ajustes para detectar la señal de la longitud de onda de fluorescencia adecuada a las rebanadas cerebrales de imagen. Después de ajustar el microscopio al plano focal de la rebanada cerebral, utilice un aumento de 10 veces para tomar una sola imagen.
Utilice el cuarto ventrículo situado debajo del cerebelo y por encima de pons y tronco encefálico para localizar una posible región LC en la rebanada cerebral. Concéntrese en los bordes laterales del cuarto ventrículo y la LC se ubicará comenzando desde los bordes del cuarto ventrículo y apuntando hacia la región del tronco cerebral. La distribución intracelular de la dopamina beta-hidroxilasa, una proteína expresada en la LC, se evaluó utilizando este protocolo con el fin de estudiar la morfología LC y la densidad neuronal.
Otra proteína expresada en la LC, la tirosina hidroxilasa, también mostró una fuerte señal fluorescente verde en las rebanadas cerebrales que contienen la LC.Los cambios en la homeostasis metálica se observan a menudo en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en el LC.In este ejemplo, cuando una rebanada cerebral cortada a través de la LC se midió para fosfato, potasio, zinc y cobre, sólo el cobre mostró un aumento específico de la señal. Recomendamos cortar alrededor de 500 micras más de tejido anterior y posterior a LC para evitar perder el núcleo, y cortar más secciones de las necesarias, especialmente si la primera vez realiza este protocolo. El estudio cuidadoso de las imágenes del atlas cerebral antes de la tinción es muy útil.
Una vez que la LC se encuentra mediante inmunohistoquímica, las rebanadas cerebrales adyacentes se pueden utilizar para estudios adicionales, incluyendo análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios de imágenes metálicas a través de microscopía de fluorescencia de rayos X. Las secciones cerebrales generadas utilizando el protocolo descrito se pueden utilizar para cuantificar los niveles de cobre y otros metales en la LC y compararlos con los niveles en regiones fuera de la LC, que es necesario para la comprensión del mecanismo de la enfermedad. Otras posibles aplicaciones de este protocolo incluyen la detección de abundancia y distribución intracelular de la dopamina beta-hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, y otras proteínas expresadas en la LC individualmente, o en los ensayos de co-tinción, estudios de morfología LC y densidad neuronal.
