Este trabajo fue apoyado en parte por el Alan A. y Edith L. Wolff Charitable Trust, St. Louis, y la Fundación Barnes-Jewish Hospital de. L. Shmuylovich y E. Ghosh fueron parcialmente compatibles con las becas concedidas predoctorales del Heartland de afiliados de la Asociación Americana del Corazón. S. Zhu recibió apoyo parcial del Programa de Compton Los estudiosos de la Universidad de Washington y el Colegio de Artes y Premio de Investigación Licenciatura Verano Ciencias. S. Mossahebi recibió apoyo parcial del Departamento de Física.

El procedimiento para la adquisición de imágenes ecocardiográficas y análisis de los mismos para obtener los parámetros PDF se detalla a continuación. Aunque el cateterismo cardíaco se menciona en la parte de selección de sujetos por debajo, la metodología descrita se aplica sólo a la porción ecocardiográfico. La descripción de la parte de cateterismo se incluyó para la validación independiente de las predicciones del modelo con base y no está relacionada con el análisis de los E-ondas a través del formalismo PDF. Antes de la adquisición de datos, todos los sujetos proporcionan firmaron su consentimiento informado para la participación en el estudio, de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional (Oficina de Protección de la Investigación Humana) en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington. NOTA: Todos los programas de software (junto con tutoriales sobre cómo usarlas) descritos en esta sección se puede descargar desde <a href="http://cbl1.wustl.edu/SoftwareAgreement.htm" target="_blank">http://cbl1.wustl.edu/Softw</a>areAgreement.htm 1. Selección del Objeto NOTA: Todos los sujetos en la base de datos Cardiovascular Laboratorio de Biofísica tenían ecocardiografía simultánea y el cateterismo cardíaco realizado y fueron referidos por sus médicos para cateterismo cardiaco diagnóstico. Los criterios de inclusión de bases de datos son: 1) ausencia de anomalías valvulares significativas, 2) ausencia de alteraciones de la o bloqueo de rama en el ECG, 3) la presencia de una ventana ecocardiográfica satisfactorio con E-claramente identificables y A-ondas. 2. ecocardiográfica Adquisición de Datos <ol><li> Grabar un estudio completo / eco-Doppler 2D para todos los sujetos de acuerdo con la Sociedad Americana de Ecocardiografía 16 criterios. NOTA: Los ecocardiogramas de cribado se registraron en una cámara clínica estándar por un ecografista. Si se desea, la grabación ecocardiográfico transtorácico adicional se puede realizar para el propósito de la verificacións después de un catéter, de alta fidelidad adecuada se avanza en el LV para medir la hemodinámica LV simultáneamente. </li><li> Los sujetos de la imagen en la posición supina. En un entorno no experimental, el posicionamiento lateral izquierda estándar se puede utilizar sin pérdida de generalidad del método. Obtener apical cuatro cámaras que utilizan un transductor de 2,5 MHz, con el volumen de la muestra cerrada en 1.5-5 mm dirigidas entre las puntas de las valvas de la válvula mitral y ortogonal al plano MV (para minimizar los efectos de alineación como se ve en el color Doppler modo M ), el filtro de pared puesta a 1 (125 Hz) o 2 (250 Hz), la línea de base ajustado para tener ventaja de la altura total de la pantalla y la escala de velocidad ajustado para explotar el rango dinámico de la salida sin aliasing. </li><li> Realice Doppler tisular con el volumen de la muestra cerrada en 2,5 mm y se coloca en las pociones lateral y septal del anillo mitral. </li><li> Ahorra exámenes Doppler en formato DICOM en la máquina de eco y grabar en DVD con simultelectrocardiograma aneously registrado (ECG). </li></ol> 3. Doppler de la Imagen y Análisis Convencional NOTA: En esta sección se describen dos programas a medida de MATLAB. El primer programa se describe en el paso 3.1 y el segundo programa se describe en los pasos 3.2 a 3.5. Todos los programas de software (junto con tutoriales sobre cómo usarlas) se pueden descargar desde <a href="http://cbl1.wustl.edu/SoftwareAgreement.htm" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">http://cbl1.wustl.edu/SoftwareAgreement.htm</a> <ol><li> Convertir imágenes desde el formato DICOM y vídeo a mapa de bits (bmp) archivos (usando un programa MATLAB personalizado). NOTA: El procedimiento descrito a continuación para ajustar Doppler E-ondas y Doppler tisular E&#39;ondas se muestra en la Figura 1. </li><li> Cargue los archivos de imagen de mapa de bits en otro programa MATLAB personalizada para medir los parámetros de flujo transmitral convencionales tales como pico E, A pico, E dur </sub&gt;, &#39;pico, A&#39; E pico, etc. y recortar las imágenes para el análisis de PDF. Imágenes con discernible contorno flujo transmitral y ciclo cardíaco completo Seleccione según lo indicado por ECG para su análisis. </li><li> Marcar la tasa de tiempo de muestreo (medida en píxeles / s en el eje horizontal) y la tasa de muestreo de la velocidad (medida en píxeles / (m / seg) a lo largo del eje vertical) en las imágenes. Identificar el ciclo cardíaco completo observando y marcado picos consecutivos R (o cualquier característica distintiva de la ECG) en la imagen. </li><li> Marque la transmitral Doppler E y A-onda o tejido Doppler E&#39;- y A&#39;- ola en el ciclo cardíaco seleccionado. <ol><li> Seleccione el punto de pico es decir Doppler E-ola. Pico E, (o pico E &#39;) y marcar el inicio de la onda utilizando la línea que conecta el pico del comienzo como una guía para que coincida con la pendiente de aceleración de la onda E (o de la onda E&#39;). El comienzo de la onda se utiliza para calcular el intervalo de principio a peflujo ak denota como la onda E (o E&#39;onda) tiempo de aceleración (AT). </li><li> Marcar el final de la onda E (o de la onda E &#39;) usando la línea que conecta el pico hasta el final como una guía para que coincida con la pendiente de desaceleración. Esto se utiliza para calcular el intervalo de desde el pico de la línea de base denotado como el tiempo de desaceleración (DT). El intervalo de desde el principio hasta el final de la onda es la duración de la onda E (E dur = AT + DT). El programa guía al usuario durante todo el proceso con las debidas instrucciones. </li></ol></li><li> Marcar la A-onda usando un procedimiento similar a la de la onda E. Tanto con el E y A-ondas marcó el programa calcula el pico relación E / A pico. NOTA: El programa guarda las ondas marcadas como imágenes recortadas que contienen el E y sólo A-ondas. El programa también crea un archivo de datos con los parámetros de cultivo y medidos para cada latido. </li></ol> 4. de montaje automatizada de flujo transmitral Utilizando el formalismo PDF <ol&gt; <li> El montaje automatizado de Doppler E y A de la onda y el tejido Doppler E&#39;- y los contornos de onda A&#39;- se hace usando un programa de LabView personalizado 18,19. <ol><li> Cargue la imagen recortada, y el programa calcula automáticamente el sobre velocidad máxima (MVE). Seleccione la MVE estableciendo el umbral de tal manera que se aproxima a MVE flujo transmitral como se muestra en la Figura 1. El inicio y la terminación de los puntos que definen el MVE se puede seleccionar a lo largo del eje de tiempo por el operador de tal manera que sólo MVE puntos que proporcionan buena correspondencia a la parte real seleccionado de la onda se utilizan como entrada para la instalación posterior. </li></ol></li><li> NOTA: Los puntos MVE-seleccionados por el usuario son la entrada para el programa de ordenador que se ajuste automáticamente el modelo de solución PDF para la velocidad en función del tiempo utilizando un Levenberg-Marquardt (iterativo) algoritmo. El ajuste se realiza con el requisito de que el error cuadrático medio entre la clínica (de entrada)minimizarse datos (MVE) y el modelo PDF contorno predicho. Puesto que el modelo es lineal, se obtiene un conjunto único de parámetros para cada Doppler de la onda E derivada MVE utilizado como entrada. Por lo tanto numéricamente k, c, y valores únicos x o se generan para cada onda E y k &#39;, c&#39;, y x o &#39;para cada onda E&#39;. </li><li> En el caso de que el ajuste es obviamente subóptima cuando el ajuste se superpone a la onda E (o de la onda E &#39;) imagen (es decir. El algoritmo intentó ajustarse ruido incluido en el MVE por ejemplo) modificar el MVE mediante el uso de más / menos puntos, modificando de este modo el modelo predijo contorno con la consiguiente modificación de los parámetros PDF para lograr un mejor ajuste. </li></ol> Guardar los datos cuando el ajuste apropiado PDF se haya generado. NOTA: El programa está escrito para guardar automáticamente los datos de imagen y archivos de texto que contienen los parámetros de PDF yla información de contorno. Los parámetros PDF obtenidos a partir del procedimiento descrito anteriormente se pueden utilizar para elucidar la fisiología y la nueva distinguir entre la fisiología normal y patológica como se detalla en la sección de resultados representativos a continuación.

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The authors have no competing financial interests.

En consonancia con nuestro enfoque metodológico, se resaltan los aspectos clave de los métodos que facilitan la obtención de resultados precisos y significativos. ECOCARDIOGRAFÍA La Sociedad Americana de Ecocardiografía (ASE) tiene pautas para la realización de estudios transtorácica 16. Durante un examen de eco, hay una multitud de factores que afectan la calidad de la imagen. Los factores que están más allá del control del ecografista inclu...

Estudios pioneros por Katz 1 en 1930 revelaron que el ventrículo izquierdo de mamíferos inicia llenado por ser una bomba de succión mecánica, y mucho esfuerzo desde entonces se ha dedicado a desentrañar el funcionamiento de la diástole. Durante muchos años, los métodos invasivos eran las únicas opciones disponibles para la evaluación clínica o la investigación de la función diastólica (DF) 2-16. En la década de 1970, sin embargo, los avances y desarrollos en la ecocardiografía técnicos finalmente dieron cardiólogos y fisiólogos herramientas prácticas para la caracterización no invasiva del DF. Sin una teoría causal unificación o paradigma para la diástole con respecto a cómo trabaja el corazón cuando se llena, los investigadores propusieron numerosos índices fenomenológicos basados ​​en la correlación con las características clínicas. La curvilínea, rápidamente subiendo y bajando forma de la velocidad del flujo sanguíneo transmitral contorno durante la primera, llenado rápido, por ejemplo, se aproxima como un triángulo y diastólica fuíndices ncio se definen a partir de las características geométricas (altura, anchura, área, etc.) de ese triángulo. Los avances técnicos en ecocardiografía han permitido que el movimiento del tejido, la tensión, y la velocidad de deformación durante el llenado a medir, por ejemplo, y cada avance técnico trajo consigo una nueva cosecha de índices fenomenológicas que se correlaciona con las características clínicas. Sin embargo, los índices siguen siendo correlativo y no causal y muchos índices son diferentes medidas de la misma fisiología subyacente. No es de extrañar, por tanto, que los índices clínicos actualmente empleados de DF han especificidad y una sensibilidad limitada. Para superar estas limitaciones, el llenado (PDF) formalismo parametrizada diastólica, una cinemática causal, modelo de parámetros concentrados de llenado del ventrículo izquierdo que está motivado por e incorpora la fisiología de succión de la bomba de la diástole fue desarrollado y validado 17. Modela la función diastólica (tal como se manifiesta en las formas curvilíneasde los contornos de flujo transmitral) de acuerdo con las reglas de movimiento oscilatorio amortiguado armónico. La ecuación de movimiento oscilatorio armónico amortiguado se basa en la segunda ley de Newton y se puede escribir, por unidad de masa, como: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51471/51471eq1.jpg" /> Ecuación 1 Esta 2 ª ecuación diferencial de orden lineal tiene tres parámetros: K - rigidez de la cámara, c - viscoelasticidad / relajación, y x o - desplazamiento inicial / precarga del oscilador. El modelo predice que los diferentes patrones de llenado diastólico observadas clínicamente son el resultado de la variación en el valor numérico de estos tres parámetros del modelo. Con base en el formalismo de PDF y la mecánica clásica, E-ondas pueden ser clasificados como siendo determinado por bajo amortiguadas-o sobre-amortiguado regímenes de movimiento. Numerosos estudios <sup&gt; 17-21 han validado que clínicamente registrados contornos de onda E y el modelo PDF predijeron contornos muestran excelente acuerdo y han dilucidado los hemodinámicos / análogos fisiológicos de los tres parámetros PDF 21. El proceso para la extracción de los parámetros del modelo de vista clínico registrado datos de la onda E se detalla en los siguientes métodos. A diferencia de los índices típicos de DF en uso clínico actual, tres parámetros del modelo PDF son la causalidad basada. Como se discute en los siguientes métodos, índices adicionales de la fisiología diastólica se pueden derivar de estos parámetros fundamentales y de la aplicación del formalismo PDF a aspectos de la diástole otro que el flujo transmitral. En este trabajo, los métodos de análisis basado en PDF de flujo transmitral y de las relaciones fisiológicas que se pueden extraer del enfoque PDF, se describen los parámetros y los índices derivados. Además, se muestra que los parámetros PDF o índices derivadas de ellos pueden burlarseaparte las propiedades intrínsecas de la cámara de los efectos externos de la carga pueden proporcionar correlaciones con los parámetros definidos invasiva tradicionales y pueden diferenciar entre los grupos normales y patológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Equipment/ Software</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Philips iE33</td>
			<td style="width:159px;">Philips (Andover, MA.)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LabVIEW 6.0</td>
			<td style="width:159px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Version 6.0.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MATLAB</td>
			<td style="width:159px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Version R2010b</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of global diastolic function by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the parametrized diastolic filling formalism

Cuantitativa evaluación de la función cardíaca continúa siendo un desafío para los fisiólogos y médicos. Aunque los métodos invasivos históricamente han conformado el único medio disponible, el desarrollo de técnicas de imagen no invasivas (ecocardiografía, resonancia magnética, CT) que tiene una alta resolución temporal y espacial proporcionan una nueva ventana para la evaluación cuantitativa de la función diastólica. La ecocardiografía es la acordada estándar para la evaluación de la función diastólica, pero los índices de uso clínico actual simplemente utilizar las características de dimensión de la cámara (modo M) o el movimiento de la sangre / tejido (Doppler) formas de onda seleccionada sin incorporar los determinantes causales fisiológicas del movimiento mismo. El reconocimiento de que todos los ventrículos izquierdo (LV) iniciar el llenado, al servir como bombas de succión mecánica permite la función diastólica global para ser evaluado sobre la base de las leyes del movimiento que se aplican a todas las cámaras. Lo que diferencia a un corazón de la otra son los parámetros de la ecuación de movimiento que govllenado Erns. De acuerdo con ello, el desarrollo del llenado diastólico parametrizada (PDF) formalismo ha demostrado que toda la gama de flujo transmitral precoz observado clínicamente patrones (Doppler E-onda) son extremadamente bien en forma por las leyes del movimiento oscilatorio amortiguado. Esto permite el análisis del E-ondas individuales de acuerdo con un mecanismo causal (succión de retroceso-iniciado) que produce tres (numéricamente) parámetros concentrados únicos cuyos análogos fisiológica son rigidez de la cámara (k), viscoelasticidad / relajación (c), y la carga (x o). La grabación del flujo transmitral Doppler (E-ondas) es una práctica estándar en la cardiología clínica y, por lo tanto, el método de grabación ecocardiográfico se revisa brevemente. Nuestra atención se centra en la determinación de los parámetros de PDF a partir de datos de ondas E registrados de forma rutinaria. Como los resultados resaltados indican, una vez que los parámetros PDF se han obtenido a partir de un número adecuado de carga variable E-ondas, las Invesinves- es libre de utilizar los parámetros o construir índices de los parámetros (como la energía almacenada medio kx o 2, la presión máxima AV o gradiente kx, índice de carga independiente de la función diastólica, etc.) y seleccionar el aspecto de la fisiología o fisiopatología ser cuantificados.

Formas de onda Doppler representante de los cuatro tipos diferentes de patrones de llenado (, seudonormal, la relajación normal de retraso,-constrictiva restrictivo) usando el método detallado anteriormente se muestran en la Figura 2. Figura 2A muestra el patrón normal, lo que, por sí mismo es indistinguible de la seudonormal patrón. Figura 2B muestra una relajación retardada y la Figura 2C muestra un patrón de constrictiva restrictivo asociado con la disfunción...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism at JoVE.

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Exacta cuantificación, basada en la causalidad de la función diastólica global ha sido alcanzado por el análisis basado en la modelización cinemática de flujo transmitral a través de la parametrizada llenado diastólico (PDF) formalismo. PDF genera rigidez, la relajación, y los parámetros de carga única y aclara &quot;nuevo&quot; fisiología mientras que proporciona índices de sensibilidad y especificidad de la disfunción.

La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

quantification-global-diastolic-function-kinematic-modeling-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K vistas.  Washington University in St. Louis.  Exacta cuantificación, basada en la causalidad de la función diastólica global ha sido alcanzado por el análisis basado en la modelización cinemática de flujo transmitral a través de la parametrizada llenado diastólico (PDF) formalismo. PDF genera rigidez, la relajación, y los parámetros de carga única y aclara "nuevo" fisiología mientras que proporciona índices de sensibilidad y especificidad de la disfunción. 

Video: Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Investigación

Bioingeniería

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigación De La Separación De Flujo Tridimensional Inducida Por Un Pólipo Modelo De Pliegue Vocal

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

La lignina Down-regulación de<em&gt; Zea mays</em&gt; Vía dsRNAi y Análisis de lignina Klason

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Outer-Boundary Assisted Segmentation and Quantification of Trabecular Bones by an Imagej Plugin

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different bone loss conditions. However, the standard approach for trabecular analysis of micro-CT images is slice-by-slice semi-automatic hand-contouring, which is labor intensive and error prone. Described here is an efficient method for automatic segmentation of trabecular bones according to the bone's outer boundaries, where trabecular bones can be identified and segmented automatically with accuracy with less operator bias when appropriate segmentation parameters are set. To profile satisfactory segmentation parameters, an image stack of segmentation results is displayed, where all possible combinations of the segmentation parameters are changed one by one in sequence, and segmentation results with associated parameters can easily be visually checked. As a quality-control feature of the plugin, simulated standard objects are quantified where the measured quantities can be compared with theoretical values. Layer-by-layer quantification of trabecular properties and trabecular thicknesses are reported by such a plugin, and the distributions of such properties within the selected regions can be profiled easily. Although layer-by-layer quantification retains more information about trabecular bones and facilitates further statistical analysis of structural changes, such measures are unavailable from the output of current commercial software, where only a single quantified value for each parameter is reported for each sample. Therefore, the described workflows are better approaches for analyzing trabecular bones with accuracy and efficiency.

We present a workflow for segmenting and quantifying trabecular bones for 2D and 3D images based on the bone&#39;s outer boundary using an ImageJ plugin. This approach is more efficient and accurate than the current manual hand-contouring approach, and provides layer-by-layer quantifications, which are not available in current commercial software.

Límite exterior asistida por segmentación y cuantificación de huesos Trabecular por un Imagej Plugin

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

The Quantification of Injectability by Mechanical Testing

Injectable biomaterials are becoming increasingly popular for the minimally invasive delivery of drugs and cells. These materials are typically more viscous than traditional aqueous injections and may be semi-solid, therefore, their injectability cannot be assumed. This protocol describes a method to objectively assess the injectability of these materials using a standard mechanical tester. The syringe plunger is compressed by the crosshead at a set rate, and the force is measured. The maximum or plateau force value can then be used for comparison between samples, or to an absolute force limit. This protocol can be used with any material, and any syringe and needle size or geometry. The results obtained may be used to make decisions about formulations, syringe and needle sizes early in the translational process. Further, the effects of altering formulations on injectability may be quantified, and the optimum time to inject temporally changing materials determined. This method is also suitable as a reproducible way to examine the effects of injection on a material, to study phenomena such as self-healing and filter pressing or study the effects of injection on cells. This protocol is faster and more directly applicable to injectability than rotational rheology, and requires minimal post processing to obtain key values for direct comparisons.

Presented here is a protocol for quantitatively evaluating the injectability of a material through a syringe-needle system using a standard mechanical testing rig.

La cuantificación de la inyección mediante pruebas mecánicas

Injectable biomaterials are becoming increasingly popular for the minimally invasive delivery of drugs and cells. These materials are typically more ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.