The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.

NOTA: fueron aprobados y realizados en el cumplimiento de las normas de Tel Aviv Universidad Escuela de Medicina Sackler Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) Todos los animales procedimientos. 1. acondicionado Preparación de Medios <ol><li> Seed 2 x 10 6 U-87 células mg en una placa de cultivo de 10 cm en un volumen de 8 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina / estreptomicina / nistatina 1%. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C; 5% de CO 2 hasta alcanzar la plena confluencia en 48 horas. </li><li> Con una jeringa de 10 ml, retirar todo el medio del plato y filtrar a través de un filtro de 0,45 micras en un tubo de 15 ml. </li><li> Sin lavar la placa de células, añadir 1 ml de solución de tripsina (0,25%) y se incuba. </li><li> Cuando se separan todas las células, inactivar la tripsina usando al menos 5 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y preformar un recuento de células. </li><li<html> &gt; Contar el número de células utilizando un hemocitómetro u otro dispositivo de recuento celular y calcular el número de células de acuerdo con el método de recuento utilizado. NOTA: se utilizará más adelante con el fin de normalizar la concentración de CM. </li><li> Transferir el CM a un matraz de fondo redondo de vidrio y se concentra al rotavapor de alto vacío. Con el fin de acelerar el proceso, aumentar la temperatura del baño a 37 ° C, si se desea. Continúe hasta que el CM logra una textura pastosa. </li><li> Resuspender el CM de cada placa de cultivo de 400 l de solución salina. Cuando se utiliza más de una placa, utilice volumen equivalente. Por ejemplo, para 2 placas de cultivo, utilice 800 l. Use cada placa de 4 ratones. </li><li> Con el fin de comparar las diferentes líneas celulares o tratamientos, ajustar el volumen de acuerdo con la relación de célula recibida en el paso 1.6. Por ejemplo, si una placa contiene 1.5x más células, añadir 200 l de solución salina a los 400 l pre-existentes. Este será el CM ajustado </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-mímica Gel Plug inoculación en ratones <ol><li> Antes de inocular el gel-ECM mímica en ratones, prepare los siguientes materiales: <ol><li> Factores de crecimiento reducidas gel ECM imitador-fenol libre (descongelar durante la noche, un día antes del experimento, a 4 ° C en hielo). </li><li> Máquina de afeitar eléctrica. </li><li> La ketamina y xilazina con el fin de anestesiar a los ratones. </li><li> Helada 1.000 consejos l estériles. </li><li> Helada jeringa de 1 ml y 27 g agujas. </li></ol></li><li> Preparar para cada ratón un tubo Eppendorf de 1,5 ml contiene 80 l ajustados CM y mantener en hielo. </li><li> A cada tubo, añadir 600 mu l factores de crecimiento heladas reducido gel ECM imitador-fenol libre que se descongela la noche a 4 ° C, en hielo. El gel-ECM mimo es líquido en 4 ° C y se solidifica a la temperatura corporal; con el fin de evitar que el gel-ECM sinóptico se solidifique, utilizar heladas 1000 consejos mu l. Mezclar cuidadosamente los tubos sin formar burbujas y mantener en hielo. </li><li> Anestesiar 6 semanas de edad BALB / c ratones utilizando ketamina (100 mg / kg) y xilazina (12 mg / kg). Confirmar la anestesia adecuada de acuerdo al cuidado y uso de animales institucional comité, es decir, antes de comenzar el experimento. Los animales han llegado a su avión adecuado de anestesia cuando ya no responden a una pizca dedo del pie firme. </li><li> Afeitarse la zona abdominal de los ratones y desinfectar usando un exfoliante / alcohol quirúrgico. </li><li> Utilice un resfriado jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G para inyectar el contenido del tubo de Eppendorf por vía subcutánea. Realizar la inyección muy lentamente para evitar la formación de burbujas. Una vez que se administra todo el volumen, no expulse la aguja durante varios minutos, hasta que se produce la solidificación. </li></ol> 3. Evaluación de ECM-mímica Gel Plug Vascularización Usando Ultrasonido NOTA: Esta parte del protocolo requiere conocimientos previos de funcionamiento de un sistema de imágenes de ultrasonido, o la ayuda de un técnico autorizado. <ol><li> Antes de empezar, tener la fmateriales e instrumentos listos ras: <ol><li> Máquina de afeitar eléctrica. </li><li> Crema depilatoria. </li><li> La ketamina y xilazina con el fin de anestesiar a los ratones. </li><li> Microburbujas no específica. </li><li> Dispositivo de activación. </li><li> Sistema de imágenes de Estados Unidos, incluyendo una sonda de 708 MHz 55 y un micromanipulador adquisición 3D. </li></ol></li><li> Medir la vascularización dentro de los tapones de tres semanas después de la inoculación: NOTA: En el modelo animal U-87 a base de MG, 3 semanas se encontraron para representar el punto de tiempo ideal para formación de imágenes. Bajo diferentes configuraciones, calibre cinética de vascularización a partir de unos pocos días después de la inoculación de los tapones. <ol><li> Anestesiar a los ratones utilizando ketamina (100 mg / kg) y xilazina (12 mg / kg). Confirmar la anestesia adecuada de acuerdo al cuidado y uso de animales institucional comité, es decir, antes de comenzar el experimento. Los animales han llegado a su avión adecuado de anestesia cuando ya no responden a una pizca dedo del pie firme. </li><li> Afeitarse lazona abdominal de los ratones y tratar con crema depilatoria. </li><li> Fijar los ratones supina en el escenario de la micro-manipulador. </li><li> Utilizando una solución salina que contiene 1 ml de la jeringa y una aguja de 30 G, colocar la aguja dentro de la vena de la cola, fijar firmemente la aguja y aflojar la jeringa. </li><li> La configuración de la sesión de adquisición de imágenes en modo 3D Contraste: <ol><li> Pulse el botón &quot;3D&quot; para inicializar la etapa motor 3D y colocar el transductor en el medio del área de escaneado deseada. </li><li> Pulse el botón &quot;3D&quot; y la entrada de la distancia y el paso de tamaño de digitalización, a continuación, pulse &quot;Scan&quot;. </li><li> Asegúrese de que todo el tapón fue escaneada en los datos de imagen en 3D que se muestran. Si no, ajuste el transductor de forma que todo el tapón es visible en la exploración y repita el paso 3.5.2. </li><li> Presione &quot;Contraste&quot; y empujar la compensación de ganancia de tiempo (TGC) controla a la izquierda para oscurecer la imagen. </li></ol></li><li> Activar las microburbujas utilizando un mezclador vial que es designated para la activación de microburbujas durante 45 segundos. </li><li> Mezclar en un 1 ml jeringa de 50 l de microburbujas con 50 l de solución salina. </li><li> Vuelva a colocar la jeringa aflojado contiene solución salina con una jeringa que contiene microburbujas activados. Inyectar las microburbujas diluidas en la vena de la cola de los ratones, espere unos segundos para que las burbujas de alcanzar un estado de equilibrio, y luego adquirir cine loop con contraste 3D del tapón, usando el motor de cámara 3D: <ol><li> Pulse el botón &quot;3D&quot; y seleccione &quot;Scan&quot; para adquirir imágenes de realce 3D y pulse &quot;Cine tienda&quot; para guardar los datos de imagen. </li><li> Pulse el botón &quot;3D&quot; y haga clic en &quot;Destroy 3D&quot; para destruir las microburbujas. </li><li> Pulse el botón &quot;3D&quot; de nuevo y seleccione &quot;Scan&quot; para adquirir un bucle de cine post-destrucción, a continuación, pulse &quot;Cine tienda&quot;. </li></ol></li><li> Generar la superposición de tramas de imágenes anteriores y posteriores a la destrucción de microburbujas: <ol><li> En el y# 8220; Configuración de referencia &quot;en el lado izquierdo de la pantalla, haga clic en&quot; Crear de referencia &quot;. </li><li> Pulse el botón &quot;Gestión de Estudio&quot; para abrir el bucle de cine antes de la destrucción adquirida. </li><li> Haga clic en &quot;Cine de proceso&quot; para generar el contraste de la superposición verde y, a continuación, haga clic en &quot;Cargar en 3D&quot;. </li></ol></li><li> Utilice el software de imagen de Estados Unidos con el fin de cuantificar la imagen 3D resultante de volumen de sangre dentro de los tapones: <ol><li> Pulse el botón &quot;Scan / Freeze&quot; y luego presionar &quot;ajustes del modo&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Volumen&quot; y seleccione &quot;Paralelo&quot;. </li><li> Crear un volumen 3D del tejido diana mediante la segmentación de una serie de contornos. </li><li> Haga clic en &quot;Finalizar&quot; para completar la segmentación. NOTA: El volumen del agente de contraste se mostrará en la parte inferior izquierda de la pantalla. </li></ol></li><li> Al final del procedimiento, coloque los ratones en un ambiente cálido, seco y limpio, tranquilo, lejos deotros animales. Proporcionar calor utilizando una almohadilla disponible comercialmente quirúrgica de calefacción o de una lámpara incandescente (50-75 vatios), colocado 12-14 pulgadas de distancia de los roedores. Monitorear ratones continuamente hasta mantener una postura erguida y caminar normalmente. </li></ol></li></ol> 4. Evaluación de ECM-mímica Gel Plug Vasculatura Morfología El uso con fibras Confocal Endomicroscopía NOTA: Esta parte del protocolo se realiza inmediatamente después de la imagen de Estados Unidos y requiere conocimiento previo de operar el sistema de formación de imágenes confocal fibrado endomicroscopía, o la ayuda de un técnico autorizado. <ol><li> Antes de empezar, tiene los siguientes materiales e instrumentos listos: <ol><li> Equipo para cirugía como pinzas, tijeras e hilos de coser absorbibles. </li><li> Dextrano conjugado con FITC (70 KDa). </li><li> Soluciones de calibración (tres tubos de cada uno de peróxido de hidrógeno que contiene, agua o solución fluorescente). </li><li> El sistema de imágenes y unasonda adecuada para obtener imágenes de los vasos sanguíneos según el fabricante. </li></ol></li><li> Anestesiar a los ratones utilizando ketamina (100 mg / kg) y xilazina (12 mg / kg). </li><li> Administrar iv, a través de la vena de la cola, 200 l de 10 mg / dextrano marcado con FITC ml. </li><li> Desinfectar la zona abdominal usando un exfoliante / alcohol quirúrgico y aplicar una pequeña incisión de aproximadamente 1 cm desde el enchufe. </li><li> Coloque la sonda endomicroscopía en la parte superior de la clavija suavemente mientras se mantiene el tapón intacto. </li><li> Adquisición: <ol><li> Una vez que la sonda se encuentra en el tapón, presione &quot;Start láser&quot; utilizando el pedal. La fluorescencia se debe mostrar en la pantalla. </li><li> Adquirir películas cortas (hasta 30 segundos) pulsando &#39;Record&#39; en la pantalla o &#39;Seleccionar&#39; usando el pedal. </li><li> Entre las películas, lavar la sonda mediante la colocación de la punta en un tubo que contiene el agua. </li><li> Cuando haya terminado, retire la sonda y limpie la punta con una punta de algodón. </li></ol></li><li> Analizar ve mediadiámetro ssel: <ol><li> Haga clic en el icono de &quot;Detectar microvasos&quot; en el panel superior para abrir la ventana del módulo de detección de buques. </li><li> Haga clic en &quot;Preferencias&quot; y marcar &quot;el diámetro del vaso media&quot; en la &quot;Estadística de interés&quot; y &quot;Mostrar barras del histograma&quot; en el &quot;Modo de visualización&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Detectar&quot; para mostrar las medidas seleccionadas. </li></ol></li><li> Para analizar la intensidad de la señal fluorescente en las zonas adyacentes a los vasos sanguíneos: <ol><li> Haga clic en &quot;Crear círculo ROI&quot; en el panel izquierdo y crear un círculo en el área de interés. </li><li> Haga clic en &quot;Calcular histograma dentro de ROI&quot; para calcular los valores relacionados con esta región. </li></ol></li></ol> Tratamiento 5. Post-procesal de ratones <ol><li> Al final de cada procedimiento de imagen, coloque los ratones en un ambiente cálido, seco y limpio, tranquilo, lejos de otros animales. Proporcionar calor utilizando un comercialmente unalmohadilla térmica quirúrgica vailable o una lámpara incandescente (50-75 W), colocados en 12-14 lejos de los roedores. Monitorear ratones continuamente hasta mantener una postura erguida y caminar normalmente. </li><li> Para un análisis más detallado de la vascularización tapones &#39;en puntos de tiempo adicionales, se aplican las siguientes condiciones de recuperación: <ol><li> Suturar la incisión con suturas absorbibles. </li><li> Dé analgesia ratones tales como buprenorfina (1 mg / kg) por vía subcutánea, y volver a jaulas individuales. </li><li> Observe todos los animales para determinar si un tratamiento adicional analgésico es necesario y re-evaluar diariamente para monitorear y evaluar para el sufrimiento. </li></ol></li><li> En el punto final del experimento, la eutanasia a los ratones por primera aplicación de isoflurano, seguido por dislocación cervical. </li><li> Si de imagen adicional se realizará en las semanas siguientes los pasos iniciales de imagen, todos los procedimientos deben ser lo más estéril posible. Un exfoliante de la piel quirúrgica debe ser realizada, wa estérilter y algodón estéril consejos deben ser utilizados para limpiar la sonda endomicroscopía, y la sonda se deben desinfectar después de cada animal utilizando agua estéril. </li></ol>

<ol>
	<li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth:+an+in+vivo+Matrigel+model.">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li><li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane,+heparin,+and+fibroblast+growth+factor.">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+assays:+a+critical+overview.">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li><li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+cytometry:+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo.">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li><li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy:+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs.">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li><li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubbles+in+medical+imaging:+current+applications+and+future+directions.">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li><li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles.">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li><li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats.">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents.">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li><li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors.">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Combinando métodos de imagen complementarios permite la adquisición de información sobre la densidad de microvasos, funcionalidad y morfología de los diferentes componentes de la angiogénesis. Cargando CM en los tapones de gel de ECM sinóptico genera un microambiente tumoral, que está separada de otras poblaciones de células, como las células endoteliales, que son reclutados y extravasación en el enchufe. Mediante la realización, en paralelo, las microburbujas de contraste mejorad...

El ensayo de angiogénesis enchufe matrigel fue descrita por primera vez por Kibbey et al., En 1992, donde fue utilizado para evaluar la estimulación de la angiogénesis por el SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. En contraste con otros ensayos de angiogénesis in vivo, como el ratón angiogénesis corneal o ensayos de membrana corioalantoidea de pollo, este ensayo es relativamente fácil de realizar 2. El gel-ECM mímica inyectado puede contener células, pro-angiogénico o un compuestos y / o factores anti-angiogénicos. Al evaluar la actividad de un compuesto anti-angiogénico, el tapón normalmente contiene una mezcla de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y la sustancia anti-angiogénico se puede administrar directamente en el enchufe o sistémicamente 3, 4. El gel-ECM sinóptico se inyecta por vía subcutánea donde se solidifica dentro de minutos. Evaluación de reclutamiento de vasos sanguíneos en el tapón resultante es typically realizado mediante la medición de los niveles de hemoglobina dentro del tapón, por medición de la señal de fluorescencia después de la inyección de isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con dextrano, por inmunotinción de secciones histológicas para marcadores endoteliales específica o por células activadas por fluorescencia (FACS) 2,5, 6. Sin embargo, esta evaluación sólo permite el análisis de punto final y carece de información acerca de la funcionalidad y la morfología de los vasos sanguíneos. Además, las mediciones de volumen de plasma, ya sea por niveles de hemoglobina o mediante el uso de dextrano-FITC como un indicador, puede ser engañosa ya que el contenido de la sangre se ve afectada por el tamaño de los vasos sanguíneos y el grado de charcos estancados de sangre. Esto es especialmente crucial cuando la vasculatura reclutado se caracteriza por la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto 7. Nos proponemos en el presente documento un nuevo más precisa, el método para la visualización de los vasos sanguíneos reclutados por la combinación de dos modalidades de imágenes complementarias. High microburbujas resolución mejorada de ultrasonido-contraste (Estados Unidos) combinado con intravital fibred-confocal endomicroscopía puede proporcionar información no sólo acerca de la densidad de los vasos sanguíneos, sino también en su morfología y funcionalidad. Además, este análisis se puede realizar en varios puntos de tiempo permitiendo así el seguimiento de la cinética de la angiogénesis. Estados Unidos es una técnica de imagen utilizada ampliamente que posee una alta resolución espacial de los vasos sanguíneos de imagen siguiente intravenosa (iv) la inyección de microburbujas que permanecen exclusivamente en el compartimento vascular 8-11. Las microburbujas son microburbujas llenas de gas que producen una señal ecogénica fuerte cuando se excita con un pulso de Estados Unidos y por lo tanto servir como un buen agente de contraste. Imágenes 3D del tapón se adquieren mediante el software de sistema de imagen de Estados Unidos después de microburbujas destrucción. Las imágenes resultantes se componen de cuadros de imágenes de antes y después de la destrucción de microburbujas y reflejan la diferencia en la intensidad de vídeo en color. Estos superpuestolas imágenes se muestran de forma automática por el software. En consecuencia, el porcentaje de vasos funcionales dentro de la clavija puede ser cuantificada. Alta resolución Fibered endomicroscopía confocal sirve como modalidad de imagen complementaria al informar sobre los vasos sanguíneos morfología. En este método mínimamente invasivo, las imágenes se adquieren después de la administración iv de dextrano conjugado con FITC 12. El polímero fluorescente tiñe el torrente sanguíneo y por lo tanto sirve como un &quot;agente de contraste&quot; para los vasos sanguíneos morfología y el flujo sanguíneo. Además, dado que el polímero inyectado es en un tamaño de 70 KDa, sólo puede atravesar los vasos con fugas como se encuentra en la vasculatura del tumor. Esto resultará en alto fondo de la dextrano marcado con FITC fuera de los vasos sanguíneos. En consecuencia, endomicroscopía confocal fibrado se puede utilizar para visualizar características típicas del efecto EPR en el tumor neovasculature- agrandados, los vasos que gotean, altamente enmarañadas-, con extremos romos. Este modelo del sistema se descricama en la comparación del potencial angiogénico de U-87 MG glioblastoma humano y su clon inactivo 13. Vascularización dentro de los tapones se evaluó tres semanas después de la inoculación gel-ECM sinóptico. Se demostró que la vascularización dentro de tapones que contienen CM de U-87 MG de rápido crecimiento de células tumorales de generación se incrementó significativamente en términos de número, la densidad y la funcionalidad, en comparación con la vascularización dentro de los tapones que contienen CM de las células tumorales de generación latentes. Por lo tanto, los autores fueron capaces de concluir que CM aislado de U-87 MG de rápido crecimiento de células tumorales de generación contiene niveles más altos de factores pro-angiogénicos, en comparación con la CM a partir de células tumorales de generación latentes. Estos factores estimulan la formación de vasos sanguíneos funcionales al afectar positivamente todos los pasos de la cascada angiogénica (es decir, la proliferación, la brotación, la migración y, finalmente, la formación de estructuras tubulares de las células endoteliales).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Company</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Catalog number</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Rotary Vacuum Evaporator</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Growth-factors reduced phenol-free Matrigel</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">BD Bioscience</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">FAL356231</td>
			<td style="width:251px;">Thaw overnight, at 40C on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Depilatory cream&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 US imaging system</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">55 MHz 708 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Vevo2100 imaging software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VisualSonics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">VialMix&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">VMIX</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">DEFINITY microbubbles</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DEFINITY Imaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">DE4</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Activate for 45 seconds using Vialmix before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ProFlex MiniO/30 probe</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">70 kD FITC-labeled Dextran</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">46945</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">ImageCell software</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:255px;">Calibration Kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">Mauna Kea Technologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">-</td>
			<td dir="LTR" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td align="left" height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td align="left">Gibco Life Tecchnologies</td>
			<td dir="LTR" style="width:179px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td align="left" height="37" style="height:37px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td align="left" height="39" style="height:39px;">Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution</td>
			<td align="left">Biological Industries&#160;</td>
			<td align="left">03-032-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring functionality and morphology of vasculature recruited by factors secreted by fast-growing tumor-generating cells

El ensayo de tapón de matrigel subcutánea en ratones es un método de elección para la evaluación in vivo de los factores pro- y anti-angiogénicos. En este método, los factores deseados se introducen en gel-ECM sinóptico frío líquido que, después de la inyección subcutánea, se solidifica para formar un entorno que imita el entorno cáncer. Esta matriz permite la penetración de las células huésped, tales como células endoteliales, y por lo tanto, la formación de la vasculatura. En este documento se propone un nuevo ensayo de tapón de matrigel modificado, que puede ser explotada para ilustrar el potencial angiogénico de un grupo de factores secretados por las células de cáncer, a diferencia de un factor específico (por ejemplo, bFGF y VEGF) o agente. El tapón que contiene gel ECM imitador se utiliza para introducir el anfitrión (es decir, el ratón) con un grupo de factores secretados a la CM de células de glioblastoma tumorales generadoras de crecimiento rápido. Hemos descrito previamente una extensa comparación del potencial angiogénico deU-87 MG glioblastoma humano y su clon derivado latente, en este modelo de sistema, que muestra la angiogénesis inducida en las células U-87 MG parentales. El CM se prepara mediante el filtrado de los medios recogidos a partir de placas de cultivo confluente de cualquiera de las líneas de células después de la incubación de 48 horas. Por lo tanto, sólo contiene factores secretados por las células, sin las propias células. Describe aquí es la combinación de dos modalidades de imagen, las microburbujas de imágenes por ultrasonido de contraste mejorado y intravital endomicroscopía con fibras confocal, para una precisa, la caracterización en tiempo real de la medida, la morfología y la funcionalidad de los vasos sanguíneos recién formados dentro de los tapones.

La implantación de los tapones de gel ECM mímica con CM de rápido crecimiento línea de células tumorales generadoras angiogénico U-87 MG, se traduce en una amplia angiogénesis. Este vasculatura puede ser explorado extensamente utilizando dos métodos de imagen complementarios. Las microburbujas con realce de contraste de formación de imágenes de Estados Unidos revela extensa reclutamiento de vasos sanguíneos funcionales en el enchufe ilustrando extensa flujo sanguíneo dentro de U-...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells at JoVE.com

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Monitoreo Funcionalidad y Morfología de Vasculatura Reclutado por factores secretados por las células tumorales generadoras de crecimiento rápido

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

monitoring-functionality-morphology-vasculature-recruited-factors

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vistas.  Tel Aviv University. We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Video: Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Investigación

Biología

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate that acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network and its anti-correlated sensorimotor/paralimbic network at multiple levels of the brain and that the hemodynamic response is influenced by the psychophysical response.  Physiological monitoring may be performed to explore the peripheral response of the autonomic nerve function. This video describes the studies performed at LI4 (hegu), ST36 (zusanli) and LV3 (taichong), classical acupoints that are commonly used for modulatory and pain-reducing actions. Some issues that require attention in the applications of fMRI to acupuncture investigation are noted.

FMRI and physiological monitoring is used to study the effects of Acupuncture on the central and peripheral nervous systems. Acupuncture mobilizes a limbic-paralimbic-neocortical network, with great overlap with the default mode network, to modulate neurological activity, possibly related to its autonomic effect in the peripheral nervous system.

Efectos de la acupuntura en vigilancia por fMRI del cerebro humano

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por &quot;peroxidación&quot; y &quot;oxidativo&quot; Huella de radicales hidroxilo

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...