This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos. 1. Modelos de Investigación <ol><li> Cultivo celular <ol><li> Mantener las células de riñón embrionario humano (HEK-T293) células en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de L-glutamina, a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Se cultivan las células en frascos T75 y deje que alcancen el 90% de confluencia. </li><li> Llevar a cabo la división celular a través de tripsinización (0.25% de tripsina-EDTA) durante 3-5 min a 37 ° C en 5% de CO 2 </sub&gt;, La inactivación de la tripsina con igual volumen de medio celular, y la centrifugación de las células durante 5 min a 700 xg en 4 ° C. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo. </li><li> Células de semillas en el frasco o placa apropiada 7 x 10 4 células en un frasco T75 48 horas antes de citoquinas tratamiento. Esto debería dar ~ 70% de la densidad en el momento del tratamiento. </li><li> Células dejan a estos suero 24 horas más tarde mediante la aspiración de los medios de comunicación y su sustitución por el mismo volumen de medio libre de suero (DMEM, estéril). </li><li> Preparar el TNF-α, IL1-β e IFN-γ, desde polvo liofilizado con agua ultra pura en concentraciones de trabajo de 5 pg / l, 10 ng / l, y 10 ng / l, respectivamente, y añadirlos a los pozos / frascos. </li><li> Suero Treat células de hambre mediante la adición de citoquinas solubilizadas directamente a los medios de cultivo de células de matraces apropiados. Los tratamientos consistieron de citoquinas individuales, un cóctel de todos los 3 (en lo sucesivo &quot;* 3&quot;), o sterile agua como control (denominado como &quot;0&quot;). </li><li> Incubar las células tratadas durante 24, 48 o 72 hr antes de la evaluación y la cosecha. </li></ol></li><li> Evaluación de la viabilidad de la célula <ol><li> Hacer una solución de 5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) en 1X PBS. </li><li> Para placas de 12 pocillos, añadir 100 l de solución de MTT a cada pocillo y agitar suavemente para asegurar una distribución uniforme. </li><li> Incubar las placas durante 15 minutos-1 hora a 37 ° C en el 5% de CO 2, y se les presentarán bajo un microscopio para detectar la presencia de coloración púrpura. Si no está presente púrpura, agitar de nuevo y permiten a las células se incuban en intervalos de 5 minutos hasta que se observa de color púrpura. La cantidad de tiempo necesario debe ser determinado por cada investigador. </li><li> Usando una pipeta de repetición, añadir 700 l de MTT disolvente (HCl 4 mM y 0,1% de NP40 en isopropanol) a cada pocillo y la placa de roca (s) a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, o hasta que todo el color púrpura había dejado las células . Si púrpurael color no sale de las células, agregar un adicional de 200 l de disolvente y continuar a girar. </li><li> Para el análisis, tomar 100 l de cada pocillo y colocar en una placa de 96 pocillos y leer en un lector de placas utilizando 570 nm y una longitud de onda de referencia de 630 nm, 595 nm, sin embargo también es aceptable siempre y cuando las lecturas se toman a una configuración coherente. </li></ol></li><li> Modelo Animal de ALS <ol><li> Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en los experimentos. </li><li> Realizar genotipado con cebadores estándar contra SOD1 mutante 25. </li></ol></li></ol> 2. Aislamiento de las mitocondrias NOTA: Es importante trabajar con rapidez y mantener todo en hielo durante todo el procedimiento. <ol><li> Preparación de tampón de aislamiento mitocondrial (MIB), tampón de aislamiento de la médula espinal (SC MIB) y tampón experimental (EB) <ol><li> Preparar las siguientes soluciones madre antes de tiempo para MIB y EB. </li><li> Hacer 1 M Tris / MOPS disolviendo 12,1 g de base Tris en 70 ml de H 2 O. Añadir MOPS secos para conseguir el pH a 7,4. Ajuste el volumen al 100 final ml. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C. </li><li> Hacer 1 M Kphos mezclando 80,2 ml de K 2 HPO 4 y 19,8 ml de KH 2 PO 4. Guarde a temperatura ambiente. </li><li> Hacer 0,2 M EGTA / Tris mediante la adición de 3,8 g de EGTA a 10 ml de H 2 O. Añadir 1 M Tris / MOPS hasta disueltos, ~ 30-40 ml. Ajuste a 50 ml, filtro estéril y se almacena a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el pH será ~ 6,7. </li><li> Hacer 1 M glutamato haciendo 10 ml deSolución de ácido glutámico 1 M. Se esteriliza con filtro y almacenar 4 ° C. </li><li> Hacer 1 M Malate haciendo 10 ml de solución de ácido málico 1 M. Añadir Tris / MOPS 50 mM. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C. </li><li> Hacer MIB a una concentración de sacarosa 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, y 1 mM EGTA / Tris. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C. </li><li> Hacer SC MIB a una concentración de sacarosa 250 mM, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, KCl 10 mM, 1,5 mM de MgCl 2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, y cóctel inhibidor de la proteasa. </li><li> Hacer EB a una concentración de 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamato, malato 2,5 mM, 1 mM de fosfato de K, pH 7,4, y 10 mM EGTA / Tris. Se esteriliza con filtro y se almacena a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparativos de los equipos antes de recoger las células. <ol><li> Enjuague un pequeño recipiente de vidrio y homogeneización maja tres veces con agua estéril y colocar en hielo. </li><li> Reúna los elementos necesarios, tales como un taladro estándar, scra celularpers, 1,5 ml, 15 ml y 50 ml tubos y soluciones. </li></ol></li><li> Aislamiento Las mitocondrias <ol><li> Las células cultivadas <ol><li> Para cada tipo de muestra, utilizar dos matraces T175 de células. </li><li> Asegurar que las células son ~ 90% de confluencia y el uso en experimentos de control, o la placa y tratar como se describió anteriormente en el paso 1.2. </li><li> En la parte superior del banco, los medios de comunicación Aspirar y lavar las células adherentes dos veces con 15 ml de 1x PBS cada vez. </li><li> Aspirar el tampón y raspar frascos para eliminar las células adherentes del fondo del matraz. </li><li> Añadir 15 ml de 1x PBS a cada frasco, remolino, y transferir a los distintos tubos de 15 ml cónicos y lugar en el hielo. </li><li> Una vez raspado se realiza, centrifugar los tubos durante 5 min a 700 xg, 4 ° C utilizando una centrífuga de mesa usando un rotor de cubeta oscilante. </li><li> Sobrenadantes Aspirar y resuspender cada sedimento en 1 ml de MIB. </li><li> Combinar ambas suspensiones y transferir a un pequeño recipiente de vidrio para la homogeneización. </li><li> Añadir MIBal recipiente hasta que alcanza el tampón de primera línea. Homogeneizar las células con la mano del mortero conectados a un taladro a velocidad media durante tres pasadas. Asegúrese de que el buque se encuentre en el hielo durante este paso, no para quitar la mano del mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pases continuos. </li><li> Transferir la solución homogeneizada a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Aspirar la solución en una jeringa de 3 ml usando un manómetro 18 de la aguja 1 ½ pulgadas y expulsar de nuevo en el tubo cónico en hielo con un calibre de 27 ½ pulgadas aguja. Tener cuidado para expulsar la solución contra la pared interior del tubo como para utilizar esa fuerza para disrupción de la membrana celular. </li><li> Repita los pasos de jeringas para un total de cinco veces. </li><li> Transferir la solución a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 600 xg, 4 ° C en una centrífuga de mesa usando un rotor de cubeta oscilante. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante y distribuir entre los tres tubos de 1,5 ml. NOTA: Mitochondria son en el sobrenadante después de esta primera, spin-baja velocidad, mientras que las membranas celulares y las células intactas se sedimentan. </li><li> Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Sobrenadantes Aspirar y combinan las pastillas en 100 l MIB y colocan inmediatamente en hielo. NOTA: Las mitocondrias son en el sedimento después de este giro de alta velocidad. Las mitocondrias normalmente mantienen su potencial de membrana para ~ 2-3 ion hielo después de aislamiento y son más estables como una solución madre concentrada en MIB. </li></ol></li><li> Las mitocondrias aislamiento a partir de tejido de ratón <ol><li> Anestesiar el ratón, según el protocolo del IACUC. Establecer un vaporizador en el 5,0% para inducir la anestesia. Confirmó que el animal está anestesiado por la falta de reflejo para pizca pie o reflejo de parpadeo cuando el ojo se acerca o golpeó con un hisopo de algodón. Mantenga el ratón bajo anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico manteniendo el vaporizador entre 1,5% y 2,0%. </li><li> Excise el hígado y la médula espinal de cada animal y el lugar por separado en el hielo frío PBS 1x - / - para retirar cualquier sangre. </li><li> Para el hígado, el tejido transferir a un plato de pesaje en hielo y cortar en trozos finos usando una cuchilla de afeitar fresco durante 1 min. </li><li> Añadir el tejido y el tampón apropiado (MIB para el hígado o SC MIB para la médula espinal) al recipiente hasta que alcanza el tampón de primera línea. Homogeneizar los tejidos con la mano del mortero con la mano durante cinco pases. Asegúrese de que el buque se encuentre en el hielo durante este paso, no para quitar la mano del mortero por encima del líquido y usar una velocidad constante con pases continuos. </li><li> Transferencia de los homogeneizados para limpiar tubos de 15 ml. </li><li> Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 750 xg, 4 ° C durante 10 min. </li><li> Guarde los sobrenadantes en tubos limpios y colocarlos en hielo. NOTA: Las mitocondrias son en el sobrenadante después de esta primera, spin-baja velocidad, mientras que las membranas celulares y las células intactas se sedimentan. </li><li> Vuelva a suspender los pellets de la médula espinal in 500 l de SC MIB. </li><li> Vuelva a homogeneizar cada tres veces, sólo llenar el vaso medio camino con SC MIB este momento. </li><li> Transferir la nueva homogeneizado a un tubo nuevo. </li><li> Centrifugar la en un rotor de ángulo fijo a 750 xg, 4 ° C durante 10 min. </li><li> La combinación de estos nuevos sobrenadantes, que contienen más mitocondrias, con el primer sobrenadante de cada muestra. </li><li> Tubos de centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Sobrenadantes Aspirar y volver a suspender los pellets de hígado en 500 l de MIB y los pellets de la médula espinal en 50 l SC MIB y colocar inmediatamente en hielo. NOTA: Las mitocondrias son en el sedimento después de este giro de alta velocidad. Las mitocondrias normalmente mantienen su potencial de membrana para ~ 2-3 ion hielo después de aislamiento y son más estables como una solución madre concentrada en MIB. </li><li> Realizar un ensayo de concentración de proteína para estimar la concentración de las mitocondrias en solución. Siga las instruccioness para el uso de un kit de ensayo de proteína comercial o método similar 26. Las concentraciones típicas de las mitocondrias son: frascos T175 rendimientos 2 ~ 2 mg / ml, 1 hígado de ratón ~ 3-5 mg / ml, y 1 médula espinal de ratón ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> C Ensayo citocromo utilizando un I + D de rata / ratón citocromo c Quantikine Kit ELISA (adaptado del protocolo proporcionado por el fabricante). <ol><li> Inmediatamente antes de la creación de las reacciones, diluir las mitocondrias a / ml concentración de trabajo de 0,5 mg de EB y distribuir mitocondrias diluido en tubos de 1,5 ml para las reacciones (típicamente 30-50 l de mitocondrias por tubo). </li><li> Añadir ya sea EB o DMSO, a 1% del volumen total, a la mitocondria diluidos y se incuban las reacciones en la mesa de laboratorio durante 7-10 min. Estas reacciones son estables hasta por 30 minutos a temperatura ambiente si se necesita un plazo más largo. </li><li> Mitocondrias precipitado mediante centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min y cuidadosoLy separar el sobrenadante y colocar cada uno en un separadas tubos de 1,5 ml. NOTA: Los tubos pueden ser o bien se congeló a -20 ° C para su posterior análisis o usarse inmediatamente. </li><li> Determinar la liberación de citocromo c por una comparación de la concentración de citocromo c en el sedimento y el sobrenadante 27. <ol><li> Preparar las muestras mediante la solubilización de los pellets en el volumen original de la reacción con 0,5% TX-100 en 1X PBS. </li><li> Para cada muestra, preparar 2 pocillos de la placa ELISA, uno para el pellet ahora solubilizado y uno para el sobrenadante de la reacción por adición de 100 l de citocromo c conjugado (usar directamente fuera de la botella), además de 100 l de 0,5% Tx- 100 en 1X PBS, y luego, de la muestra de pellets o sobrenadante. </li><li> Agite suavemente la placa a temperatura baja (nivel 2-4) durante 20 segundos para mezclar, cubrir e incubar durante 1 hora, 37 ° C. </li><li> A continuación, lavar la placa cuatro veces con tampón de lavado diluido de acuerdo con la Productoresinstrucciones de er. Retire el exceso de solución golpeando los pozos en una toalla de papel. </li><li> A continuación, añadir 150 ml de 1: 1 A + B solución de desarrollo a cada pocillo e incubar la placa durante 20-30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Por último, añadir 50 l de solución de parada a cada pocillo y tomar lecturas de absorbancia a 540 nm usando un lector de microplacas. Calcular la cantidad de la liberación del citocromo c mediante la comparación de la cantidad de citocromo c en el sedimento vs. sobrenadante para cada reacción. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Evaluación de la función mitocondrial (Dys) <ol><li> Inmediatamente antes de las reacciones se configuran, diluir las mitocondrias a 0,5 mg / ml concentración de trabajo con EB y se coloca en tubos de 1,5 ml para las reacciones (típicamente 30-50 l de las mitocondrias se utilizan por tubo). </li><li> Tratamientos mitocondriales <ol><li> Añadir tratamientos adecuados (control EB, 1 mM FCCP mezcla con 50 nM valinomicina, 10 mM rotenona, 5 oligomicina mu M, 2 mM de KCN, o 200 mM ADP, concentraciones finales) para separar las reacciones en 1/10 del volumen total de las mitocondrias diluidas. Se incuban las reacciones sobre la mesa de laboratorio durante 7 min. NOTA: Se debe tener cuidado al manipular estas sustancias como la ingestión accidental o absorción a través de la piel podría ser perjudicial. </li><li> Diluir TMRE, reconstituida en agua estéril a una concentración de trabajo de 100 mM y se almacenaron a -20 ° C, a 2 M y añadir un volumen igual al volumen de reacción mitocondrial. </li><li> Se incuban las reacciones sobre la mesa de laboratorio durante 7 min. </li><li> Mitocondrias precipitado mediante centrifugación en un rotor de ángulo fijo a 10.000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Medio de carga del volumen de sobrenadante de cada muestra en una placa de 396 pocillos y se lee la fluorescencia. NOTA: longitudes de onda de excitación y emisión de TMRE deben optimizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el volumen y la placa que se utilizará parael ensayo. El uso de un 384 pocillos placa estándar negro con 25 l de 1 mM TMRE (concentración final de reacción) se obtuvo la señal más fuerte utilizando longitudes de onda de excitación / emisión &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Calcular el pliegue diferencia en fluorescencia entre el control (EB) y cada tratamiento dividiendo el valor de fluorescencia relativa (RFU) obtenido a partir del lector de placas para la muestra experimental por el RFU de la muestra de control. </li></ol></li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El tratamiento de células HEK-293T con citoquinas recombinantes hace que cantidades moderadas de la muerte celular durante 48 hr (Figura 1). La cantidad de muerte celular inducida por el tratamiento TNF-alfa es similar a los estudios reportados previamente 30 y la viabilidad celular disminuye después de la co-administración de múltiples citoquinas que son mayores que las cantidades acumulativas con cualquier citoquina sola también es coherente con la literatura 31,32. La capac...

Las células vivas banco de energía metabólica en forma de grasas e hidratos de carbono y el uso de esta energía para la biosíntesis, transporte de membrana y el movimiento. Parte de la energía se obtiene en el citosol a través de la conversión de los azúcares de la dieta directamente en ATP durante la glucólisis. Sin embargo, la principal fuente de producción de ATP en una célula es aprovechada dentro de la mitocondria a través de la cadena respiratoria mitocondrial 1. La arquitectura de las mitocondrias proporciona la orientación espacial necesaria para la producción de ATP eficaz y eficiente. Las mitocondrias poseen una doble membrana separadas por un espacio intermembrana y junto con la matriz, el compartimento mitocondrial más interior, la casa de los componentes y coordinar las reacciones químicas implicadas en la generación de ATP. La membrana interna contiene una serie de complejos de proteínas unidas a la membrana que comprenden la cadena respiratoria así como la ATP sintasa, el complejo de proteína que trae ADP y Pi juntos para la formación de ATP. La posadamembrana del ER se dobla en crestas y los electrones se pasan a lo largo de los complejos de la cadena respiratoria por medio del citocromo c, un portador de electrones soluble que se mueve entre los complejos dentro del espacio intermembrana. Como los electrones se mueven, la oxidación de equivalentes reductores se produce y los iones de hidrógeno se bombea desde la matriz al espacio intermembrana. Como consecuencia de la alta concentración de iones dentro del espacio intermembrana, un gradiente electroquímico construye lo que resulta en un potencial de membrana a través de la membrana mitocondrial interna (Δψ) 2. El oxígeno es el aceptor final de electrones de la cadena de transporte de electrones y iones de hidrógeno fluya a través de las ATP sintasas desde el espacio intermembrana de nuevo a la matriz, y al hacerlo directamente causar la formación de ATP. Este proceso tal como se describe en su totalidad se conoce como la fosforilación oxidativa. Los pliegues de las crestas aumentan el área de superficie de la membrana interna, lo que permite el transporte de electrones máxima y la producción de ATP dentro decada mitocondria. Las proteínas, enzimas y otras moléculas implicadas en la fosforilación oxidativa se derivan de ambos genes nucleares y mitocondriales. Las mitocondrias contienen su propio ADN circular, que codifica para 13 proteínas así como ARNt y ARNm necesarias para la producción de ATP 3. Sin embargo, se requieren muchas más proteínas y por lo tanto son nuclear codificada. La mayoría de estas proteínas codificadas en el núcleo están dirigidos a la matriz mitocondrial mediante el uso de presecuencias en el extremo N-terminal de la proteína precursora, y su importación es impulsado en parte por Δψ 4,5. Más allá de contribuir a la bioenergética de una célula, las mitocondrias también influyen en importantes procesos metabólicos tales como TCA y beta-oxidación, la señalización celular a través de la regulación de calcio, así como un papel clave en la apoptosis 6. En concreto, durante los momentos de estrés celular, las proteínas Bcl-2 la familia que residen en o interactúan en la membrana externa mitocondrial puede causar mitocondrialpermeabilidad de la membrana exterior (MOMP) 7,8. Durante MOMP, el citocromo c y otras proteínas se liberan en el citosol, y junto con varias proteínas citosólicas forman un complejo llamado el apoptosome 9,10. El apoptosome activa las caspasas que van a escindir las proteínas celulares y el ADN durante la fase de ejecución de la apoptosis. Tan pronto como se produce MOMP, ΔΨ se derrumbó y la producción de ATP se detuvo. Por lo tanto la función mitocondrial, como apoptosis se inicia se ve comprometida y los cambios en ΔΨ puede ser correlacionada con la salud mitocondrial y celular 12. Mientras que la apoptosis es un punto final en muchos modelos de la enfermedad, la función mitocondrial y cambios a ΔΨ también puede proporcionar información valiosa acerca de originación y / o progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los cambios estructurales y funcionales mitocondriales se han documentado durante el curso de enfermedades neurodegenerativas 13,14. En la primera parte del protocolo, isomento de las mitocondrias intactas que conservan su ΔΨ se describe. Células HEK-293T fueron expuestas a diferentes concentraciones y combinaciones de TNF-α recombinante, IL1-β e IFN-γ para inducir apoptosis. Estas citoquinas fueron elegidos porque son frecuentes a ser alta en muestras sépticos humanos primarios 15 y la vía extrínseca de la apoptosis puede ser desencadenada por la interacción de unión a su receptor TNF-α 6. Puesto que hay variaciones sutiles necesarias para aislar las mitocondrias funcional a partir de tejidos primarios en comparación con células cultivadas, y porque mucha investigación utiliza animales, el protocolo también describe cómo aislar las mitocondrias a partir de hígado y médula espinal de antero esclerosis lateral (ALS) modelo de ratón. La segunda parte del protocolo fue desarrollado para monitorear a las perturbaciones del potencial de membrana mitocondrial usando un colorante fluorescente sensible al potencial con un lector de placa fluorescente. Diferencias entre el estado celular (es decir, sanos vs. poco saludable) se diferencian por la cuantificación de la fuerza de ΔΨ de mitocondrias aisladas en conjunción con agentes de desacoplamiento, inhibidores de la cadena respiratoria, inhibidores de complejos y ionóforos, todos los cuales causan la disipación del potencial de membrana mitocondrial. El saludable las mitocondrias, mayor es el cambio en ΔΨ tras el tratamiento con inhibidores mitocondriales, por lo tanto, la respuesta de las mitocondrias se puede utilizar como un indicador de la función mitocondrial (dys). El uso de mitocondrias aisladas en lugar de en la evaluación in situ de función ofrece evidencia definitiva de que una patología o tratamiento modula directamente los cambios en el orgánulo 16-18. Si bien existen métodos en la literatura para aislar las mitocondrias a partir de células cultivadas, que son vagos 17 y / o utilizan equipo especializado 16. Este protocolo describe en detalle el método de aislamiento y esfácilmente adaptable a otras líneas celulares, incluyendo el tejido primario y culturas 13,14,19,20. Muchos estudios mitocondrias aisladas utilizan los mismos desacopladores e inhibidores mitocondriales utilizados en este protocolo, pero con un electrodo de Clark (figura 21 es un ejemplo representativo de muchos trabajos en la literatura), que a su vez es una pieza muy específica y especializada de los equipos. Además, este método tradicional tiene limitaciones tales como un bajo rendimiento y alta complejidad 22,23 y requiere una cantidad sustancial de las mitocondrias (~ 500 g / reacción). En este protocolo, el fluorescente potencial de membrana TMRE sonda de detección se utiliza en conjunción con un lector de placas fluorescente, que es una máquina estándar en muchos laboratorios. TMRE es ampliamente considerado ya que rápidamente entra en las células y las mitocondrias aisladas y se puede utilizar en concentraciones bajas 24. Múltiples reacciones rápidamente se pueden configurar en tándem y lotes analizados mediante este protocolo. Además, la reacción des requieren una pequeña cantidad mucho de las mitocondrias aisladas (~ 10 g / reacción). Al requerir menos material, muestras de tejido o cultivo de células más pequeñas se pueden utilizar como punto de partida para el aislamiento de las mitocondrias, más repeticiones o reacciones se pueden configurar, y material potencialmente suficiente para otros experimentos mitocondrias aisladas, tales como la producción de ATP, el consumo de oxígeno, o la importación ensayos son posibles.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

El tratamiento de células HEK-293T con 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 hr conduce a cantidades progresivas de la muerte celular (Figura 1A ). La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MTT y consistentemente demuestra que no es de ~ 10% de disminución en la viabilidad celular con el tratamiento 24 hr y ~ disminución del 20% con el tratamiento 48 hr. Las células tratadas con concentraciones similares (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

39.2K vistas.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

Video: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Investigación

Biología

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificación de las mitocondrias de las células de levadura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

La disección de Gyrus dentado del hipocampo de ratones adultos

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Aislamiento de células endoteliales glomerulares de ratón condicionalmente inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...